CC BY
32
0 ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ СШИВАЕМОГО ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА В КАЧЕСТВЕ НОСИТЕЛЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ ДЛЯ ИНТРАВИТРЕАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ (Экспериментальное исследование)
Шишкин М.М.1, Штильман М.И.2, Юлдашева Н.М.1, Артюхов А.А.2 УДК:615.451.13:616-08:612.08
1 Национальный медико-хирургический центр им. Н.И. Пирогова,
2 РХТУ им. Д.И. Менделеева, Учебно-научный центр «Биоматериалы»
Резюме
На 14 кроликах породы «шиншилла» (28 глаз) изучены изменения органа зрения после интравитреальной имплантации модифицированного поливинилового спирта, способного к сшивке, как носителя лекарственных веществ. На 3-10 сутки от начала введения полимера у животных отмечались признаки воспалительной реакции со стороны радужки, цилиарного тела и сетчатки. Угнетение показателей ретинограммы свидетельствовало о токсическом влиянии полимера на сетчатку и микроциркуляцию хороидеи. Результаты гистологического исследования также свидетельствуют о токсическом действии полимера на внутренние структуры глаза экспериментальных животных.
Ключевые слова: интравитреальное введение, модифицированный поливиниловый спирт, носитель лекарственных веществ.
INTRAVITREAL IMPLANTATION BIODEGRADABLE CROSSLINKED POLY (VINYL ALCOHOL), AS A DRUG-RELEASING IMPLANT (Experimental trials)
Shishkin M.M., Shtilman M.I., Juldasheva N.M., Artyuhov A.A.
On 14 «shinshilla» rabbits (28 eyes) were investigated clinical parameters and histological changes of the eye after intravitreal implantation of the cross-linkable modified poly(vinyl alcohol), as drug-releasing implants. In 3-10th day after introduction of polymer to experimental animals the attributes of inflammatory reaction from an iris, ciliar bodies and retinas were marked. Parameters of a retinogram also specify to toxic influence of polymer on the retina and choroidal microcirculation. Results of histological research supplement the clinico-functional observations and have shown toxicity of the polymer for internal structures of eyeglobe.
Keywords: intravitreal introduction, modified poly(vinyl alcohol), drug delivery system.
Фармакологическое лечение диабетической ретинопатии (ДР), остается нерешенной проблемой, что обусловлено особенностями анатомии глаза. Системное назначение (внутривенное, внутриартериолярное) препаратов, сопровождается токсическим воздействием на весь организм [7], а местное назначение не позволяет создать оптимальную концентрацию препарата в пораженных тканях, (подконъюнктивальное, парабуль-барное, субтеноновое) [2]. Препятствием служат низкая проницаемость склеры и гематоофтальмический барьер. Широкое распространение интравитреальных инъекций, позволило добиться оптимальной концентрации препарата в стекловидной камере и минимизировать побочные эффекты системного характера [6, 9]. Однако, активный обмен веществ во внутриглазных структурах сокращает период полувыведения препаратов и определяет необходимость повторных инъекций. Велением времени становится не только адресная доставка препарата, но и пролонгация его действия с сохранением высоких концентраций в месте приложения [6, 8]. В поисках рационального решения проблемы, рядом исследователей было предложено применять препараты на биологически индифферентных химических носителях и имплантировать их интравитреально, так называемые полимеры-депо с постепенным высвобождением фармпрепарата. Примером могут служить полимеры полимолочной кислоты или поливинилового спирта [11, 12, 13], и уже разрешенные к применению интраокулярные
имплантаты Retisert (Baush and Lomb) и Posurdex (Allergan), содержащие стероиды. Несмотря на клинический успех имплантатов, риск развития осложнений (катаракта и глаукома) не позволяет расширить круг показаний для их применения [10, 13].
В работе был использован модифицированный поливиниловый спирт (Mn=12x103), способный образовывать сшитую систему в присутствии инициаторов радикальной полимеризации - аскорбиновой кислоты и перекиси водорода (заявка на изобретение № 2006125-842/15(028036)). Способность к биодеградации данного полимера является положительным моментом, поскольку не требует хирургического удаления остатков носителя из организма. Продукты деградации полимера - фрагменты поливинилового спирта легко выводятся из организма, не токсичны, 2-3%-ный растворы его используют в качестве кровезаменяющего препарата [4, 12, 13].
В поисках путей клинической реализации этой задачи нами проведены предварительные экспериментальные исследования с использованием гелеобразного имплантата.
Материал и методы
Объектом для экспериментального изучения действия сшитой формы имплантата служили 28 глаз 14 кроликов породы «шиншилла» половозрелого возраста (13-17мес.) - группа I. Вес животных 2,5-3,0 кг. Серочерной окраски. Группу II (контрольную) составили 6
здоровых кроликов (12 глаз) той же породы и окраски, такого же возраста и веса. Клинические методы исследования: тонометрия, биомикроскопия и офтальмоскопия (60D) были проведены на 1-е, 3-и, 10-е сутки и через 1, 2 и 3 месяца от начала эксперимента. Динамику ретинального электрогенеза (ЭРГ) при интравитреальном введении полимера изучали до введения полимера и на 1-е, 3-и, 10-е сутки и через 1 месяц от начала эксперимента. ЭРГ регистрировали на одиночную (1Гц) и ритмическую (30Гц) стимуляцию с помощью электрофизиологической минисистемы для животных «Mjolner» (Global EYE Program AB, Швеция). Статистическую обработку данных проводили средствами программ AnalystSoft Biostat 2007.
Приготовление раствора для интравитреальной инъекции осуществляли в инсулиновом шприце смешением раствора исходного сшиваемого полимера (5 масс. %) с инициирующей системой (2 мг/мл аскорбиновой кислоты и 2 мг/мл перекиси водорода) [1, 12].
Рис. 1. Биодеградирующая система на основе сшитого поливинилового спирта: А - жидкая форма исходного полимера (до сшивки); Б - плавающие в физиологическом растворе нити полимера, образующегося после сшивки, окрашенные трипановым синим для визуализации
Исследования in vitro
Полученный полимер оставался прозрачным, сохранял форму в виде нитей. После насыщения трипановым синим in vitro и помещения полимера в физиологический раствор 0,9% NaCl в течение 20-27 минут выделял краситель, однако полного выделения красителя за это время не наблюдалось. Через 6 месяцев нахождения в физиологическом растворе полимера дальнейшего выделения красителя не произошло. Так же не наблюдалось и деградации полимера.
Исследования in vivo.
Животным группы I (28 глаз) в условиях общей анестезии под контролем операционного микроскопа интравитреально инъекционной иглой 30G через pars plana вводили 0,1мл раствора исходного сшиваемого полимера с инициирующей системой. Предварительно через парацентез роговицы выпускали 0,1 мл внутриглазной жидкости. Поскольку имплантат, в стекловидном теле (СТ) у 8 кроликов (16 глаз) не визуализировался при биомикроскопии, 6 кроликам (12 глаз) был введен имплантант, окрашенный трипановым синим. Животным группы II - (12 глаз) под общей анестезией интравитреально вводили 0,1 мл сбалансированного раствора BSS®.
Работу с животными выполняли согласно требованиям нормативного документа «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77). Животные содержались в виварии согласно «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» (Утвержденный главным государственным санитарным врачом СССР от 06.04.1973 №1045-73).
Из эксперимента животных выводили поэтапно передозировкой препарата «Наркотан» в сроки 1, 3, 10 день и 1, 2 и 3 месяцы от начала эксперимента (3 кролика 6 глаз на каждый срок наблюдения). В группе II забор материала на 1, 3 день и через 1 месяц по 2 кролика (4 глаза) на каждый срок наблюдения. Полученный материал фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида, с последующей проводкой в спиртах восходящей концентрации. Заливали в среду Аралдит-М и готовили ультратонкие срезы (1 мкм) на ультрамикротоме LKB-4800 (Швеция). Окраска метиленовым синим и основным фуксином (163 среза).
Результаты и обсуждение
Состояние кроликов сразу после имплантации удовлетворительное. При осмотре отмечали небольшую гиперемию конъюнктивы в области послеоперационной раны, выпадения СТ в рану нет, роговица прозрачная, передняя камера несколько мельче средней. При биомикроскопии помутнения хрусталика и ятрогенного повреждения внутриглазных структур не отмечено. У 6 кроликов (12 глаз) в СТ видны свободно плавающие тонкие нити имплантата светло синего цвета. У всех
животных сетчатка прилежит на всем протяжении, кровоизлияний нет.
У одного кролика к концу 1 суток развился резко выраженный эндофтальмит. Парный глаз оставался спокойным. Мы сочли это следствием нарушения правил асептики и антисептики, и глаз был выведен из эксперимента, количество исследуемых глаз составило 27 (п=27).
У животных I группы через 1 сутки в области инъекции отмечались незначительная гиперемия и отек в 11,1% наблюдений. На 3 сутки явления раздражения усилились: у животных появились светобоязнь (62,9%) и беспокойство (59,3%) при пальпации глаз через веки, перикорнеальная инъекция у 12 (44,4%) животных. При биомикроскопии на 3 сутки отмечали отек и сглаженность рисунка радужки в 76,2% наблюдений, единичные преципитаты в 52,4% случаев, а также слабую опалесценцию СТ (2 степень по Nussenblatt R.B. et а1., 1985) в 7 глазах. У 6 кроликов (12 глаз) в СТ были видны неизмененные нити полимера. При офтальмоскопии во всех случаях отмечали полнокровие и извитость сосудов сетчатки, небольшой отек по ходу вен в виде бело-серых полос сопровождения. Единичные штрихообразные геморрагии по ходу сосудов, появившиеся на 3 сутки после имплантации у 6 (28,6%) животных, к 10 суткам увеличились в размерах и количестве. Отек сетчатки по ходу вен к 10 суткам распространился на всю её площадь. Вокруг вен появились сероватые утолщения. Через 1 месяц явления воспаления переднего отрезка полностью купировались. Помутнение СТ значительно усилилось (4 степень) и офтальмоскопия была затруднена. У животных появились признаки катаракты (макропрепарат на Рис. 2).
Изменения глаз животных после имплантации полимера представлены в таблице №1. Поскольку, в определенные сроки наблюдения часть животных выводилась из эксперимента для забора материала, количество исследуемых глаз в последующем уменьшалось.
У всех животных до и в течение 1 месяца после имплантации полимера велся контроль внутриглазного давления (ВГД). Результаты контроля ВГД у подопытных животных представлены на рисунке 3.
Исходное ВГД животных составило 16,7±2,3 мм рт.ст. в основной группе и 15,8±2,3 мм рт.ст. в контрольной группе. В течение первых 3 дней отмечалось постепенное повышение ВГД до 20,1±1,9 мм рт. ст. (р<0,05), с колебаниями 17-24 мм рт.ст. (норма 12-20 мм рт.ст.) к 1 суткам и до 21,0± 1,8 мм рт. ст. (р<0,05), с колебаниями 17-25 мм рт.ст. к 3 суткам. Причиной повышения ВГД, на наш взгляд, явилось набухание полимера. К 10 суткам наметилась тенденция к постепенному снижению ВГД до 18,3±2,1 мм рт.ст. К концу 1 месяца наблюдения средние величины ВГД были ниже исходных (14,4±2,7 мм рт.ст), что можно объяснить гипофункцией цилиарного тела после перенесенного воспаления. У животных II группы повышение
Табл. 1. Клиническая характеристика органа зрения животных с интра-витреальной имплантацией полимера в зависимости от сроков наблюдения
1 сутки 3 сутки 10 сутки 1 мес
(п=27) (п=21) (п=15) (п=9)
Гиперемия и отек конъюнктивы 3 (11,1%) 17 (80,9%) - -
Беспокойство при пальпации 16 (59,3%) 15 (71,4%) 11 (73,3%) -
Светобоязнь 17 (62,9%) 15 (71,4%) 10 (66,7%) -
Отек роговицы - 2 (9,52%) 2 (13,3%) -
Сглаженность рельефа радужки - 16 (76,2%) 9 (60,0%) 4 (44,4%)
Уменьшение глубины п/к 18 (66,7%) 13 (61,9%) 7 (46,7%) 2 (22,2%)
Опалесценция влаги п/к - 11 (52,4%) 9 (60,0%) -
Опалесценция стекловидного тела - 7 (33,3%) 12 (80,0%) 9 (100%)
Ретинальные геморрагии - 6 (28,6%) 10 (66,7%) -
Катаракта - - - 9 (100%)
полимер
Рис. 2. Макропрепарат сагиттального разреза глаза экспериментального животного (группа I): а - помутневший хрусталик; б - уплотненное стекловидное тело
Рис. 3. Динамика показателей внутриглазного давления у животных после интравитреального введения полимерного материала
ВГД было отмечено только в 1 сутки до 21,3±0,4 мм рт.ст., к 3 суткам давление у всех кроликов нормализовалось и сохранялось на этих уровнях до конца исследования.
Электрофизиологические исследования у животных I группы выявили умеренное снижение (до 82-77% от исходных значений) амплитуды а-волны ганц-фельд ЭРГ в 1 сутки после введения полимера (рис. 4). На 3 сутки наблюдали картину гиперреакции (152-168% от исходных значений), сохраняющуюся до 10 суток эксперимента. Динамика амплитуды Ь-волны ЭРГ напоминала характер изменений а-волны. Через сутки наблюдения у животных диагностировали угнетение Ь-волны (до 54-63%). На 3 сутки амплитуда Ь-волны была увеличена до 124-132% от исходного уровня. А к 10 суткам амплитуда Ь-волны была в пределах ±17% от исходных показателей (рис. 5). К концу 1 месяца у животных I группы регистрировали выраженное угнетение а- и Ь-волн ретинограммы (4053% и 38-49% соответственно от исходных показателей). У животных группы II в ответ на интравитреальную инъекцию отмечалась депрессия а- и Ь-волн (82-89% и 71-80% соответственно). Восстановление Ь-волны наблюдалось к 3 суткам, а восстановление а-волны только к 10-м. Спустя 1 месяц после введения BSS ЭРГ животных группы II соответствовало исходным уровням.
%
Рис. 4. Динамика а-волны ЭРГ у животных группы I Примечание: Вследствие малого количества наблюдений и большого разброса показателей данные на графиках представлены не в виде абсолютных значений, а в процентах от исходных значений амплитуд волн ЭРГ (в контрольных точках медиана)
%
Рис. 5. Динамика Ь-волны ЭРГ у животных группы I
Выявленные изменения ЭРГ свидетельствуют о токсическом воздействии полимера на электрогенез сетчатки. Обнаруженная в первые сутки депрессия а- и Ь-волн ЭРГ у животных обеих групп (субнормальная ЭРГ) служит отражением ответной реакции на интраокулярную инъекцию. Картина супернормальной ЭРГ, отмеченная при введении полимера на 3-10 сутки, может быть связана с повышением количества раздражающих нейромедиаторов в сетчатке, что является ранним признаком медикаментозной интоксикации [5]. Регистрируемая к концу 1 месяца плюс-негативная ЭРГ, характеризующаяся выраженной депрессией а- и Ь-волн, является проявлением дистрофических изменений в ретинальной ткани и хороидеи, вследствие токсического влияния полимера.
По данным световой микроскопии у животных I группы изменения со стороны дренажной зоны и роговицы были минимальными. Были выявлены дегенеративные изменения единичных клеток заднего эпителия роговицы. На 1-3 сутки на гистологических срезах радужки, отмечены умеренный отек глубоких слоев стромы, разрушение отдельных эндотелиальных клеток и незначительное сужение просвета капилляров (Рис. 6А). На уровне заднего пограничного листка отмечена гибель единичных клеток пигментного эпителия. На 10 сутки на препаратах радужки изменения преимущественно были локализованы в заднем пограничном листке, т.е. в структуре, непосредственно контактирующей со СТ. Отмечена характерная реакция меланоцитов стромы, что свидетельствует о несомненной токсичности полимера (Рис. 6Б). А также очаговая облитерация капилляров, появлении отека и не-кробиотических изменений в периваскулярных муфтах.
На 3 сутки микроскопия препаратов сетчатки свидетельствовала о разрушении наружных сегментов фоторецепторов. В наружном ядерном слое наблюдались очаговая деструкция и лизис ядерного содержимого. Во внутреннем ядерном слое отмечали дезорганизацию клеточных элементов и деструктивные изменения нейронов. На препаратах, забранных на 10 сутки, на протяжении всей области контакта сетчатки с полимером наблюдался практически полный лизис наружных слоев сетчатки и очаговая деструкция внутреннего ядерного слоя (Рис. 7). Отмечено также резкое полнокровие венозной сети хоро-идеи (Рис. 8С), плазматическое пропитывание и разволок-нение сосудистых стенок, периваскулярный отек с диа-педезным выходом эритроцитов (Рис. 8Б), межуточный и внутриклеточный отек нейроглии сетчатки, с высокой степенью выраженности в зонах адгезии полимера к поверхности сетчатки, диффузное и очаговое утолщение мембраны Бруха. На препаратах также была обнаружена выраженная лимфоидная инфильтрация сетчатки и хоро-идальной ткани (Рис. 8А), и дистрофические изменения ретинального пигментного эпителия. В СТ на гистологических срезах обнаружен полимер, на различных стадиях деградации: от плазматического пропитывания (Рис. 9А) до полного лизиса макрофагами (Рис.9Б).
Рис. 6. Гистологический срез тканей радужки. В строме крипт радужки отдельные тромбированные сосуды, отек периваскулярной ткани (а). Характерная реакция меланоцитов стромы (Б) (Окраска: метиленовая синь, основной фуксин. Увеличение Х100-200)
Рис. 7. Гистологический срез тканей глаза. Дезорганизация слоя фоторецепторов и пигментного эпителия. Расслоение мембраны Бруха (10 сутки после имплантации). Окраска: метиленовая синь, основной фуксин. Увеличение Х100
Рис. 8. Гистологический срез хороидальной ткани. Лимфоидная инфиль-трация(А) и отек хороидеи (Б) в зоне контакта жидкого полимера с ретинальной тканью, резкое полнокровие и расширение хороидаль-ных сосудов, стаз крови (В). Окраска: основной фуксин и метиленовая синь, ув.Х100
Рис. 9. Гистологический срез тканей глаза. Биодеградация нитей полимера в витреальном геле. Окраска: основной фуксин и метиленовая синь, увеличение Х100. А - нити полимера срок наблюдения 10 дней, Б - деградировавшийся полимер спустя 3 месяца: плазматически пропитанный полимер (1), остатки эрозированного полимера в витреальной полости (2), значительная лимфоидная инфильтрация (3)
Изменения в структурах глаза кроликов контрольной группы значительно отличались от опытной группы. На препаратах роговица сохраняла нормальную структуру, целостность и пластичность всех слоев без каких-либо патологических отклонений. На гистологических срезах радужки, цилиарного тела и сетчатки также были отмечены правильная структура с обычным клеточным составом, нормальный калибр сосудов без признаков дистрофии, токсического повреждения и воспалительной реакции.
Результаты гистологического исследования дополняют клинико-функциональные наблюдения и свидетельствуют о токсическом действии использовавшейся полимерной системы на внутренние оболочки глаза экспериментальных животных.
Заключение
Результаты выполненных экспериментальных исследований достоверно свидетельствуют о выраженном токсическом воздействии исследовавшейся формы полимера на структуры заднего отрезка глаза животных при его интравитреальном введении. Полученные данные отличаются от положительных результатов исследований о возможности применения данного имплантата в торакальной хирургии. Это подтверждает особые требования к фармпрепаратам и имплантатам, которые планируется применять для интравитреального введения. Отрицательный результат данного исследования требует продолжения изысканий в этом направлении, также как и поиска других возможных, не менее эффективных, но более безопасных путей доставки лекарственных веществ к внутренним структурам глаза.
Литература
1. Shtilman M.I., Artyukhov A.A., Zolotaikina T.S., Korshak A.Yu., Gorchakov A.V., Tsatsakis A.M. Crosslinked macroporous polymeric hydrogels of polyvinyl alcohol: a study of the influence of the synthesis conditions. International Polymer Science and Technology, 2006, Vol 33, №10, P. 25-29.
2. Басинский С.Н. Способ адресной доставки лекарственных препаратов в лечении дистрофических состояний глаз // Клиническая офтальмология: Библиотека РМЖ. - 2004. - Т.5, №1. - С. 5-7.
3. Васильев А.Е. Наноносители лекарственных веществ // Новая аптека. - 2006.
- №5. - С.33-35.
4. Розенборт М.Э. Полимеры на основе винилацетата - Л., 1983.
5. Шамшинова А.М., В.В. Волков Функциональные методы исследования в офтальмологии. - М.: Медицина, 1999. - 416 с.
6. Carvounis P.E., Barr M.A., Albini T.A. Effects of intravitreouse injection of preserved and non-preserved triamcinolon in rabbit retina // Arch. Ophthalmol. - 2006.
- Vol.124, N.11. - P. 1666-1668.
7. Chibber R., Chibber S., Kohner E.M. Перспективы лечения диабетической ретинопатии в 21 веке (New!) // Expert Review of Endocrinology and Metabolism
- 2007. - Vol. 2, N.5. - P. 623-631.
8. Douglas L.C., Yi N.Y., Davis J.L. Ocular toxicity and distribution of subconjunctival and intravitreal rapamicin in horses // J. Vet. Pharmacol. Ther. - 2008. - Vol.31,
N.6. - P. 511-516.
9. Jager R.D. Risk of intravitreouse injection: a comprehensive review // Retina.
- 2004. - Vol.24, N.5. - P. 676-698.
10. Kane F.E., Burdan J., Cutino A. et al. Iluvien: a new sustained delivery technology for posterior eye disease // Expert. Opin. Drug Deliv. - 2008. - Vol.5, N.9. - P. 1039-1046.
11. Langer R., Peppas N.A. Advances in Biomaterials, Drug Delivery, and Bionanotec-
hnology // Biomaterials. - 2003. - Vol. 49, N.12. - Р. 2990-3006.
12. Martens P., Anseth K.S. Characterization of hydrogels formed from acrylate modified poly(vinyl) alcohol macromers // Polymer. - 2000. - V. 41. - P. 7715-7722.
13. Short B.G. Safety evaluation of ocular drug delivery formulations: techniques and practical considerations // Toxicol. Pathol. - 2008. - Vol. 36, N.1. - P. 49-62.
Контактная информация
