CC BY
30
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФОТО ДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ УДК 615.373.36.035:616-006-073.524 I.G. Meerovich1, I.Yu. Kubasova1, G.A. Meerovich2, A. Brandis3, N.A. Oborotova1, A. Yu.Baryshnikov1, A. Scherz3 POSSIBILITY TO USE BACTERIOCHLOROPHYLLID-SERINE AS PHOTOSENSITIZER FOR FLUORESCENT DETERMINATION OF MALIGNANCIES JN.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow 2Natural Sciences Center of A.M. Prokhorov General Physics Institute RAS, Moscow 3Weizmann Institute of Science, Israel ABSTRACT Study is devoted to investigation of near-infrared photosensitizer bacteriochlorophyllid-serine. It was shown that peculiarities of its fluorescence excited on wavelengths 775 nm and 633 nm allow to use this sensitizer for advanced fluorescent detection of malignancies. Key words: bacteriochlorophyllide-serine, photosensitizer, fluorescence, laser, spectrum, tumor. И.Г. Меерович1, И.Ю. Кубасова1, Г.А. Меерович2, А. Брандис3, H.A. Оборотова1, А.Ю. Барышников1, А. Шерц3 О ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛИД-СЕРИНА В КАЧЕСТВЕ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА ДЛЯ ФЛЮОРЕСЦЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НОВОБРАЗОВАНИЙ 'ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2Центр естественно-научных исследований Института общей физики им. А.М. Прохорова РАН, Москва 3Институт Науки им. Вейцмана, Израиль. РЕЗЮМЕ Работа посвящена исследованию флюоресцентных свойств инфракрасного фотосенсибилизатора бактери-охлорофиллид-серина. Показано, что особенности флюоресценции бактериохлорофиллид-серина при лазерном возбуждении с длинами волн 775 нм и 663 нм позволяют использовать его для совершенствования флюоресцентного метода обнаружения опухолей. Ключевые слова: бактериохлорофиллид-серин, фотосенсибилизатор, флюоресценция, лазер, спектр, опухоль.
№4/том2/2003 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ВВЕДЕНИЕ
Флюоресцентная диагностика с применением фотосенсибилизаторов, избирательно накапливающихся в опухолевых тканях, отличается простотой, непродолжительностью, невысокой стоимостью и неинвазивно-стью диагностической процедуры и может быть совмещена с терапевтическим лазерным воздействием (фо-тодинамическая терапия). Она перспективна для обнаружения целого ряда заболеваний (в частности, злокачественных опухолей) преимущественно поверхностной и внутриполостных локализаций [2; 3; 4; 8]. Суть метода заключается в облучении обследуемого участка светом в полосе поглощения введенного в организм фотосенсибилизатора и контроле интенсивности флюоресценции, вызванной этим облучением. Как правило, интенсивность флюоресценции фотосенсибилизатора пропорциональна его концентрации в исследуемой точке. Поэтому, обнаружив участок с повышенной интенсивностью флюоресценции, можно предположить наличие патологического процесса уже на раннем этапе его развития, что является важным дополнительным фактором диагностики наряду с использованием традиционных методов исследования.
Наиболее перспективными для флюоресцентной диагностики представляются фотосенсибилизаторы, возбуждаемые и флюоресцирующие в красном или, что еще более предпочтительно, ближнем инфракрасном диапазоне, что может позволить контролировать флюоресценцию из более глубоких слоев биоткани. Для широкого применения метода важно также иметь возможность проводить флюоресцентную диагностику через небольшое время после введения фотосенсибилизатора (в пределах 1 ч).
Мы рассмотрели возможность использования для флюоресцентной диагностики новообразований нового высокоэффективного фотосенсибилизатора бакте-риохлорофиллид-серина, флюоресцирующего в ближнем инфракрасном диапазоне [1; 6; 7]. Он удовлетворяет большинству обсуждаемых требований. Однако, к сожалению, особенности флюоресценции бактериох-лорофиллид-серина in vivo в ранний период после его введения, наиболее важные для флюоресцентной диагностики, ранее практически не исследовались. Это и обусловило актуальность представляемой работы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериохлорофиллид-серин был синтезирован в Институте Науки им. Вейцмана (Реховот, Израиль).
Для эксперимента in vivo использовались мыши-гибриды F1 с аденокарциномой Эрлиха. Исследования проводились на 7-й день после перевивки, когда опухоли достигали объема 1 см3. Бактериохлорофиллид-серин, растворенный в физиологическом растворе, вводился в хвостовую вену в дозе 20 мг/кг массы животного.
Флюоресценция возбуждалась полупроводниковым лазером с длиной волны 775 нм или He-Ne лазером с длиной волны 633 нм. Спектры флюоресценции фотосенсибилизатора в опухоли и нормальных тканях исследовались чрескожно с помощью спектроанализатора ЛЭСА-01 «Биоспек» («Биоспек», Россия) с волоконным катетером, обеспечивающим возмож-
ность локального исследования (с пространственным разрешением 1 мм). Чтобы обеспечить возможность наблюдения флюоресценции бактериохлорофиллид-серина на фоне значительно превосходящего ее по интенсивности рассеянного лазерного излучения, чувствительность системы в спектральном диапазоне вблизи длины волны излучения лазера была уменьшена примерно на 4 порядка. При использовании He-Ne лазера с длиной волны 633 нм на вход спектроанализатора устанавливался фильтр из стекла КС 19. При возбуждении флюоресценции полупроводниковым лазером с длиной волны 775 нм фильтром служила пластинка из полиметилметакрилата с растворенным в нем тетра-З-диметиламинотетра-5-трет-бутил-фталоцианином меди, поглощение которого максимально в спектральном диапазоне 760-780 нм с плавным спадом к 800 нм. Из-за этого прибор регистрировал не всю флюоресценцию бактериохлорофиллид-се-рина, а только ее длинноволновую компоненту (за пределами полосы поглощения фильтра).
В исследованиях in vivo определялись спектр и интегральная интенсивность флюоресценции бактериох-лорофиллид-серина в разных точках опухоли и прилегающих к ней и контралатеральных ей участках нормальной ткани. Определялось также соотношение К между значениями интенсивности флюоресценции в опухоли и нормальной ткани, которое благодаря линейной связи между интенсивностью флюоресценции и концентрацией фотосенсибилизатора характеризует селективность накопления в опухолевой ткани.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При возбуждении излучением полупроводникового лазера с длиной волны 775 нм регистрируемый спектроанализатором ЛЭСА-01-«Биоспек» спектр флюоресценции бактериохлорофиллид-серина в тканях экспериментальных животных имел один пик с максимумом на длине волны 840 нм (рис. 1), причем в опухолевой и нормальной ткани он отличался только по амплитуде.
При возбуждении He-Ne лазером (длина волны излучения 633 нм) спектры сенсибилизированных бакте-риохлорофиллид-серином опухолевых и нормальных тканей существенно отличались по форме (рис. 2). Спектр флюоресценции в опухолевой ткани имел два пика с максимумами при 695 и 770 нм с четко выраженным «провалом» между ними в спектральном диапазоне 730-745 нм. Спектр флюоресценции в нормальных тканях представлял собой пик со спектральным максимумом около 690 нм и пологим плато в длинноволновой области (примерно 730-790 нм) или слабо выраженным пиком при 750-770 нм («провал» между максимумами в этом случае не превышал 5-6 %).
Контраст накопления достигал значения 4 уже через 15 мин после введения, а через 4 ч после введения отмечалось его максимальное значение 8-10 (рис. 3). За это время интенсивность флюоресценции опухолевых тканей мышей снижалась более чем вдвое (рис. 4) из-за уменьшения концентрации препарата вследствие его выведения и метаболизма.
Высокий контраст накопления бактериохлорофиллид-серина в опухолевых тканях по отношению к нор-
мальным и возможность его достижения в относительно короткий срок после введения делают этот фотосенсибилизатор перспективным для обнаружения патологического участка как зоны с повышенной интегральной интенсивностью флюоресценции.
Однако при реальных исследованиях (особенно внутриполостных локализациях) интенсивность излучения, возбуждающего флюоресценцию, может быть распределена по исследуемому участку неравномерно. Вызванная этим неравномерность распределения интенсивности флюоресценции может существенно исказить картину распределения фотосенсибилизатора по участку, что снижает точность и достоверность флюоресцентной диагностики. Предложенный рядом авторов способ аппаратурной коррекции такого искажения флюоресцентной картины, предусматривающий нормирование флюоресцентного сигнала на сигнал рассеянного лазерного излучения [2; 8], не обеспечи-
Время, мин
Рис. 3. Соотношение между концентрациями бактери-охлорофиллид-серина в опухоли и нормальной ткани мышей А с карциномой Эрлиха при возбуждении флюоресценции лазерным излучением с различными длинами волн:
■ — 775 нм,
Д — 633 нм
Интенсивность, отн.ед. 140
830 850 870
Длина волны, нм
Рис.1. Спектры флюоресценции бактериохлорофил-лид-серина в тканях мыши ft с карциномой Эрлиха при возбуждении лазерным излучением с длиной волны 775 нм:
1 - опухоль,
2 — нормальная ткань.
Бактериохлорофиллид-серин введен за 20 мин до исследования
Интенсивность, отн.ед.
Длина волны, нм
Интенсивность, у.е. 300-
250
200-
150-
100-
50
ЧН
300 1200
Время, мин
Интенсивность, у.с.
1500
Б
Рис. 2. Спектры флюоресценции бактериохлорофил-лид-серина в опухоли (1,2,3) и нормальной ткани (4,5) мыши ^ с карциномой Эрлиха при возбуждении излучением Не-№ лазера с длиной волны 633 нм.
Бактериохлорофиллид-серин введен за 17 мин до исследования
Время, мин
Рис. 4. Изменение во времени интенсивности флюоресценции бактериохлорофиллид-серина в опухолях Эрлиха мыши fjl
А - возбуждение на длине волны 775 нм, контроль интенсивности на длине волны 840 нм;
Б - возбуждение на длине волны 633 нм, контроль интенсивности на длине волны 795 нм
вает достаточного качества коррекции из-за неоднородности рассеяния биологической ткани в разных точках исследуемого участка. Это связано с целым рядом причин, в частности, с геометрией поверхности участка, его микрорельефом и микроструктурой, неоднородным распределением эндогенных флюорохромов и со-
судов кровеносной системы, существенной разницей между спектральными диапазонами лазерного излучения и флюоресценции, отличием оптического пути излучения, рассеянного от поверхности патологического участка, и флюоресцентного излучения, генерированного внутри биоткани и выходящего из нее через эту поверхность наружу.
Более перспективными для коррекции такого искажения флюоресцентной картины представляются способы, основанные на использовании фотосенсибилизаторов, флюоресценция которых имела бы и амплитудные, и спектральные различия в патологических и нормальных тканях, вызванные, например, различиями в pH и р02 тканей, механизмах распространения фотосенсибилизатора в них или его метаболизма. Используя их, можно путем спектрального анализа флюоресценции из разных точек исследуемого участка исключить составляющую, связанную с интенсивностью возбуждающего излучения, и извлекать информацию, обусловленную только различиями во внутренних биофизических и биохимических свойствах биоткани.
Мы рассмотрели возможность использовать для флюоресцентной диагностики опухолей отличий в форме спектра флюоресценции бактериохлорофиллид-се-рина в опухолевых и нормальных тканях при возбуждении He-Ne лазером. Сравнение результатов наших спектрально-флюоресцентных исследований с данными B.W. Henderson et al. [1] позволяет предположить, что наблюдаемые изменения в спектре флюоресценции связаны с процессами ферментативного метаболизма и окисления бактериохлорофиллид-серина в биологической ткани, при которых образуются продукты его окисления со спектральным максимумом флюоресценции в области 690-700 нм и продукт его деметаллизации со спектральным максимумом в области 750-760 нм (бактериофеофитин). Особенности протекания этих процессов биодеградации бактериохлорофиллид-серина в опухолевых и нормальных тканях требуют дополнительного изучения, тем не менее, исследуя флюоресценцию бактериохлорофиллид-серина in vivo в тече-
Рис. 5. Изменение во времени параметра нормированной флюоресценции бактериохлорофиллид-серина в опухолевых (1) и нормальных (2) тканях мышей ^ при воз-буждении лазерным излучением с длиной волны 633 нм
ние нескольких часов после введения, мы обнаружили, что, хотя интенсивность флюоресценции достаточно быстро меняется, соотношение между ее значениями в диапазонах 770-780 нм и 730-745 нм в течение длительного времени остается примерно постоянным, но существенно разным для опухолевых и нормальных тканей. Для оценки этого соотношения мы ввели параметр нормированной флюоресценции, которым можно охарактеризовать в каждой точке изучаемого участка эту особенность флюоресценции бактериохлорофиллид-серина:
г ^Фл ~ ^ :
где:
I—параметр нормированной флюоресценции;
1фл—интенсивность флюоресценции в спектральном диапазоне 770-780 нм;
I — интенсивность флюоресценции в спектральном диапазоне 730-745 нм.
Было показано, что значение этого параметра в нормальной ткани составляет не более 0,04, в то время как в патологической ткани превышает 0,08 (рис. 5). Его численные значения, как это видно из формулы, не зависят от интенсивности возбуждающего излучения, а связаны только с флюоресцентными свойствами биоткани в ее конкретной точке. При этом, поскольку для нормирования используются значения интенсивности флюоресценции спектрально близкого диапазона, минимизируется погрешность, связанная с неоднородностью распределения оптических свойств биоткани по исследуемому участку. Это позволяет более адекватно связывать разницу в значениях параметра нормированной флюоресценции в опухоли и нормальных тканях с различиями в их биохимических и биофизических свойствах. Использова ние предложенного метода анализа распределения флюоресценции бактериохлорофиллид-серина дает возможность совершенствовать флюоресцентный способ обнаружения новообразований.
ВЫВОДЫ
Проведенные исследования показали, что бакте-риохлорофиллид-серин является перспективным фотосенсибилизатором для создания системы флюоресцентной диагностики и обнаружения новообразований. При этом могут быть использованы различия как в интегральной интенсивности, так и в форме спектра флюоресценции фотосенсибилизатора. Приемлемый для проведения диагностики контраст накопления достигается уже через 15 мин после введения фотосенсибилизатора, что делает его перспективным и для интраоперационной диагностики. Таким образом, бактериохлорофиллид-серин с успехом может быть использован для флюоресцентной диагностики и контроля ФДТ, тем более что и возбуждающее излучение, и флюоресценция лежат в спектральном диапазоне, соответствующем «окну прозрачности» биологической ткани [5], что позволяет исследовать и достаточно глубокие ее слои.
ЛИТЕРАТУРА
1. Henderson В. W., Sumlin А.В., Owczarczak B.L., Dougherty T.J. Bacteriochlorophyll-a as photosensitizer for photodynamic treatment of transplantable murine tumors //J. Photochem. Photobiol., B: Biol. —1991. —Vol. 10, N.
6. —P. 303-312.
2. Loschenov V.B., Luckjanetz E.A., Stratonnikov A.A. et al. The noninvasive evaluation of absolute fluorochrom concentration in various tissues in vivo by means of standard samples with modeled optical properties // Proc. SPIE. — 1995. — Vol. 2326. — P. 415-419.
3. Loschenov V.B., Steiner R. Working out the early diagnostic and control for the cancer treatment method with the use of photosensitizer of modelling action // Proc. SPIE. — 1994. — Vol. 2325, «Photodynamic Therapy of Cancer». — P. 144-148.
4. Meerovich G.A., Loschenov V.B., Stratonnikov A.A. et al. Laser Fluorescent System for endoscopic tumor diagnostic and irradiation control in the photodynamic therapy //
Proc. SPIE. —1996.—Vol. 2728, «Laser Use in Oncology».
— P. 35-38.
5. Meerovich G.A., Lukyanets E.A., Yuzhakova O.A. et al. Phosphosubstituted phthalocyanine derivatives as effective photosensitizers for PDT // Proc. SPIE. — 1997.
— Vol. 3181,—P. 90-93.
6. Pandey K., Shiau F.-Y., Dougherty T.J., Smith K.M. Synthesis of new Bacteriochlorophyllides and their Antitumor Activity // Bioorg. Med. Chem. Lett. — 1994.
— Vol. 4, N. 10. — P. 1253-1257.
7. Rosenbach-Belkin V., Chen L., Feodor L. et al. Serine Conjugates of Chlorophyll and Bacteriochlorophyll: Photocytotoxicity in vitro and Tissue Distributuon in Mice Bearing Melanoma Tumors // Photochem. Photobiol.
— 1996. —Vol. 64, N. l.P. 174-181.
8. Sokolov V. V., Chissov V.I., Smirnov V. V. et al. Real-time fluorescence imaging system for cancer diagnostics // Proc. SPIE. — 1995. — Vol. 2626, «Biomedical Optoelectronics in Clinical Chemistry and Biotechnology». — P. 385-390.
