CC BY
59
УДК 612.841.1-008.64-08:611.018.7
А.С. ДУБОВИКОВ1, А.В. БЕЗУШКО1, А.Н. КУЛИКОВ1, C.B. МУРАШОВ1, В.Ф. ЧЕРНЫШ1, М.И. БЛИНОВА2, О.И. АЛЕКСАНДРОВА2, А.А. СУЕТОВ1, И.О. ГАВРИЛЮК1
1Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова МО РФ, 194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6
Институт цитологии Российской академии наук, 194064, г. Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, д. 4
О применении культивированных на амниотической мембране стволовых клеток роговичного эпителия для устранения лимбальной недостаточности в эксперименте
Дубовиков Анатолий Сергеевич — клинический ординатор, тел. +7-981-781-48-23, e-mail: [email protected] Безушко Анна Васильевна — врач-офтальмолог, тел. +7-921-091-23-11, e-mail: [email protected] Куликов Алексей Николаевич — доктор медицинских наук, доцент, начальник кафедры офтальмологии, тел. +7-921-923-57-85, e-mail: [email protected]
Мурашов Сергей Викторович — доктор медицинских наук, профессор кафедры офтальмологии, тел. +7-911-226-84-15, e-mail: [email protected]
Черныш Валерий Федорович — кандидат медицинских наук, доцент кафедры офтальмологии, тел. +7-911-739-71-92, e-mail: [email protected]
Блинова Миральда Ивановна — кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биологии клетки в культуре, тел. +7-911-700-58-07, e-mail: [email protected]
Александрова Ольга Игоревна — младший научный сотрудник лаборатории биологии клетки в культуре, тел. +7-965-072-86-02, e-mail: [email protected]
Суетов Алексей Александрович — кандидат медицинских наук, врач-офтальмолог, тел. +7-911-757-61-33, e-mail: [email protected] Гаврилюк Илья Олегович — врач-офтальмолог, тел. +7-911-029-93-81, e-mail: [email protected]
Одной из основных причин, приводящих к формированию васкуляризированных бельм роговицы, является лим-бальная недостаточность (ЛН). Успешная зрительная реабилитация таких пациентов с помощью оптической кератопластики возможна только при предварительно восстановленном роговичном фенотипе эпителия. Последнее достигается с помощью операции пересадки со здорового глаза стволовых клеток роговичного эпителия (лим-бальной трансплантации — ЛТ). В настоящее время в качестве одной из наиболее перспективных технологий такой операции, позволяющей избежать риска развития ятрогенной ЛН на глазу-доноре, рассматривается пересадка культивированных на амниотической мембране (АМ) лимбальных эпителиальных стволовых клеток (ЛЭСК). Исследована возможность применения культивированных на амниотической мембране ЛЭСК для устранения ЛН в эксперименте.
Исследование проводилось на предварительно сформированной на глазах двадцати кроликов механической модели ЛН. Кролики были разделены на две группы (по 20 глаз). В основной группе после поверхностной кератэктомии на роговицу трансплантировалась АМ с культивированными на ее поверхности ЛЭСК (из ограниченных по величине аутологичных лимбальных биоптатов), а в контрольной группе АМ трансплантировалась без ЛЭСК. В исходе заживления в основной группе роговица была полностью эпителизирована, прозрачна и практически аваскулярна. В контрольной группе наблюдали тотальный фиброваскулярный паннус с помутнением стромы. Предлагаемая методика трансплантации АМ с культивированными на ее поверхности ЛЭСК обеспечивает восстановление нормального эпителиального покрова роговицы на глазах с тотальной лимбальной недостаточностью в эксперименте.
Ключевые слова: лимбальная недостаточность, лимбальные эпителиальные стволовые клетки, амниотиче-ская мембрана.
6® ^tl практическая медицина
'9 (110) сентябрь 2017 г. / том 2
A.S. DUBOVIKOV1, A.V. BEZUSHKO1, A.N. KULIKOV1, S.V. CHURASHOV1, V.F. CHERNYSH1, M.B. BLINOVA2, O.I. ALEKSANDROVA2, A.A. SUETOV1, I.O. GAVRILYUK1
1S.M. Kirov Military Medical Academy, 6 Akademika Lebedeva Str., Saint Petersburg, Russian Federation, 194044
institute of Cytology of the Russian Academy of Science, 4 Tikhoretskiy prospect, Saint Petersburg, Russian Federation, 194064
On using the corneal epithelial stem cells cultured on the amniotic membrane for limbal stem cell deficiency treatment in an experiment
Dubovikov A.S. — clinical resident, tel. +7-981-781-48-23, e-mail: [email protected] Bezushko A.V. — ophthalmologist, tel. +7-921-091-23-11, e-mail: [email protected]
Kulikov A.N. — D. Med. Sc., Head of the Department of Ophthalmology, tel. +7-921-923-57-85, e-mail: [email protected] Churashov S.V. — D. Med. Sc., Professor of the Department of Ophthalmology, tel. +7-911-226-84-15, e-mail: [email protected] Chernysh V.F. — Cand. Med. Sc., Associate Professor of the Ophthalmology Department, tel. +7-911-739-71-92, e-mail: [email protected] Blinova M.I. — Cand. Biol. Sc., Leading Researcher of the Laboratory of cell biology in culture, tel. +7-911-700-58-07, e-mail: [email protected] Aleksandrova O.I. — Junior Researcher of the Laboratory of cell biology in culture, tel. +7-965-072-86-02, e-mail: [email protected] Suetov A.A. — Cand. Med. Sc., ophthalmologist, tel. +7-911-757-61-33, e-mail: [email protected] Gavrilyuk I.O. — ophthalmologist, tel. +7-911-029-93-81, e-mail: [email protected]
One of the main causes of vascularized corneal leukoma formation is limbal stem cell deficiency (LSCD). Successful visual rehabilitation of such patients using optical keratoplasty is possible only after the corneal epithelial phenotype is restored. This condition can be achieved through limbal epithelial stem cells transplantation (limbal transplantation — LT) from the healthy eye. Currently, one of the most promising technologies for such operation, which allows to avoid the risk of iatrogenic LSCD development on the donor eye, is the transplantation of limbal epithelial stem cells (LESC) cultured on the amniotic membrane (AM). The aim of the research was to investigate the possibility of using LESC cultured on the amniotic membrane for LSCD treatment in the experiment. The research was carried out on the previously created mechanical LSCD model on the eyes of 20 rabbits. The rabbits were divided in two groups (20 eyes in each). In the main group, after surface keratectomy, AM with LESC (from size-limited autologous limbal biopsy samples) was transplanted onto the cornea, and in the control group AM was transplanted without LESC. In the outcome, the cornea was completely epithelialized, transparent and almost avascular in the main group. In the control group, we observed a total fibrovascular pannus with a stromal opacification. The proposed technique of cultured LESC on AM transplantation provides restoration of the normal corneal epithelial cover in the eyes with LSCD in the experiment. Key words: limbal stem cell deficiency, limbal epithelial stem cells, amniotic membrane.
Одной из основных причин, приводящих к формированию сосудистых помутнений роговицы, является дисфункция расположенных в складках палисада Vogt роговичной части лимба стволовых клеток роговичного эпителия (лимбальных эпителиальных стволовых клеток — ЛЭСК), проявляющаяся состоянием, получившим название лимбальной недостаточности (ЛН). К развитию ЛН могут привести различные заболевания и повреждающие факторы, вызывающие частичную или полную гибель ЛЭСК с нарушением их функциональной активности [1, 2].
Клинически ЛН характеризуется развитием хронического воспаления глазной поверхности, перси-стирующих и рецидивирующих эрозий роговицы, нарастанием на роговицу конъюнктивального эпителия (конъюнктивизация), врастанием в строму глубоких и поверхностных сосудов с формированием фиброваскулярного паннуса (сосудистого бельма) [1].
Зрительная реабилитация пациентов с помутнениями роговицы достигается в основном с помощью операции оптической кератопластики. Обязательным условием для выполнения такой операции на глазах с ЛН является предварительное восстановление нормального эпителиального покрова роговицы. Это возможно посредством операции трансплантации ЛЭСК со второго здорового глаза пациента (лимбальной трансплантации — ЛТ) [3, 4]. Однако при этом глаз-донор лишается достаточно большого сектора лимба, что нежелательно из-за возможности спровоцировать на нем ятрогенную ЛН. По этой же причине ЛТ просто противопоказана, если лимб глаза-донора даже в минимальной степени, но тоже был поврежден.
В литературе имеются сообщения об успешном восстановлении роговичного эпителия на глазах с ЛН посредством имплантации ЛЭСК, полученных методом культивирования. Процедура включает выделение и выращивание in vitro аутологичных
| ОФТАЛЬМОЛОГИЯ
или аллогенных ЛЭСК из лимбального биоптата площадью от 1 до 2 мм2 [5-7]. В настоящее время разработаны различные способы культивирования и установлено, что наиболее подходящим субстратом для размножения и сохранения ЛЭСК в культуре является амниотическая мембрана (АМ) человека [8]. Подобная технология устранения ЛН в последние годы находит все большее распространение в мире. При этом оптимальной считается трансплантация аутологичных культивированных ЛЭСК, не требующая иммуносупрессии. Несмотря на очевидную актуальность этой проблемы, в нашей стране вопросам культивирования ЛЭСК посвящены единичные сообщения.
Цель работы — исследовать возможность применения культивированных на амниотической мембране аутологичных ЛЭСК для лечения ЛН в эксперименте.
Материал и методы
Исследование выполнено на глазах 20 половозрелых кроликов породы шиншилла (40 глаз) весом 2,5-3,5 кг. На всех глазах имел место тотальный фиброваскулярный паннус, образовавшийся через 30 дней после предварительно выполненной нами механической модели Лн [9]. Животные были разделены на две группы наблюдений: основная (10 кроликов, 20 глаз) с использованием для устранения ЛН нативной АМ с культивированным на ее поверхности слоем ЛЭСК (выделенных из фрагментов аутологичной ткани роговичной части лимба ферментативным способом по методу Sefaletal. [10] в нашей модификации [11], и контрольная — (10 кроликов, 20 глаз) с использованием для лечения ЛН только нативной АМ.
Всем животным выполняли поверхностную ке-ратэктомию. Седацию выполняли с помощью подкожного введения 0,5 мл 2%-ного раствора ксила-зина гидрохлорида, местная анестезия включала ретробульбарное введение 0,3 мл 2,0%-ного раствора лидокаина и инстилляцию в конъюнктиваль-ную полость 0,5%-ного раствора проксиметакаина. Удаление фиброваскулярного паннуса роговицы осуществляли с захватом на 2-3 мм перилимбаль-ной конъюнктивы. Обнаженную строму роговицы орошали раствором Бетадина. На подготовленную таким образом для трансплантации глазную поверхность в основной группе укладывали Ам, содержащую на внутренней (обращенной к строме
роговицы) стороне культивированные ЛЭСК, а в контрольной — одну только АМ (рис. 1).
АМ укладывали на поверхность роговицы, захватывая зону лимба и на 2-3 мм обнаженную пери-лимбальную склеру, с последующей фиксацией по краям узловатыми швами 8-0 к эписклере. После этого выполняли простую блефарорафию одним П-образным швом сроком на семь дней. В послеоперационном периоде всем животным выполняли инстилляции 0,3%-го раствора нетилмицина в монодозах 4 раза в день в течение 14 дней. Наблюдение за клиническим течением заживления и состоянием роговицы осуществляли на 7-й, 10-й, 15-й, 20-й, 30-й, 60-й и 90-й дни после операции.
Интенсивность помутнения роговицы оценивали по 10-балльной шкале Войно-Ясенецкого В.В. [12], степень васкуляризации роговицы — по 4-балльной шкале Inatomi T. [13]. Биомикроскопию выполняли на щелевой лампе Carl Zeiss (Германия) при увеличении 10х и 16х, для оценки деэпителизации окрашивали роговицу 1,0%-ным раствором флюо-ресцеина натрия.
Статистическую обработку результатов исследования проводили в программе Statistica-10.0, определяли среднее значение и стандартное отклонение. Для сравнения данных, распределенных по закону отличного от нормального, применяли непараметрический критерий (U-критерий Манна — Уит-ни). Различия между группами считались значимыми при р<0,05.
Результаты
На 7-й и 10-й день после операции в основной группе животных АМ полностью покрывала роговицу без признаков лизиса. В параоптической и оптической зоне прозрачность роговицы была незначительно снижена за счет легкого помутнения покрывающей АМ — степень помутнения в среднем составила 2,1 балла. Отмечали нарастание конъ-юнктивального эпителия на АМ на 1-2 мм. Роста новообразованных сосудов не наблюдали. Степень васкуляризации стромы составила 1,2 балла за счет остаточных сосудов. В контрольной группе АМ также равномерно покрывала роговицу, степень помутнения роговицы — 2,85 балла. Отмечали нарастание на АМ эпителия со стороны лимба на 2-3 мм. За счет начала нарастания со стороны конъюнктивы на АМ новообразованных сосудов степень васкуляризации роговицы составила 1,8 балла.
Рисунок 1. Трансплантация нативной АМ на глазную поверхность
70 практическая медицина
'9 (110) сентябрь 2017 г. / том 2
Рисунок 2. Изменения в роговице на 7-10-й, 15-й и 20-й день наблюдения после операции
На 15-й день в основной группе отмечали начало васкуляризации роговицы на 1-2 мм (1,5 балла) со стороны лимба. Прозрачность роговицы незначительно снизилась за счет легкого отека АМ (2,0 балла). В контрольной группе отмечали помутнение роговицы до 3,55 балла тоже за счет набухания АМ, а также врастание сосудов со стороны лимба на 3-4 мм (2,1 балла). Нарастание конъюн-ктивального эпителия на АМ увеличилось до 4 мм.
На 20-й день в основной группе АМ покрывала роговицу полностью, периферическая васкуля-ризация составила 1,65 балла, помутнение — 1,7 балла. В контрольной группе эпителизация практически полностью покрыла амниотический покров роговицы. Васкуляризация роговицы носила более активный характер (2,25 балла) с помутнением роговицы до 4,5 балла. Данные клинического наблюдения за состоянием роговицы в основной и контрольной группе на 7-10-й день, 15-й и 20-й день представлены на рис. 2.
На 30-й день в основной группе АМ покрывала роговицу полностью; неоваскуляризация (1,2 балла) и помутнение роговицы (1,4 балла) незначительно уменьшились. Отмечали нарастание на АМ конъюнктивального эпителия с распространением на 2-3 мм на периферию роговицы. В контрольной группе васкуляризация роговицы увеличилась до 2,95 балла, прозрачность продолжала снижаться (5,7 балла). Амниотический покров роговицы был полностью эпителизирован. Наблюдали шероховатость, умеренную отечность и неравномерное окрашивание флюоресцеином наросшего эпителия.
Рисунок 3. Изменения в роговице и эпителизация на 30-й, 60-й и 90-й день наблюдения после операции
На 60-й день в основной группе отмечали полную деструкцию АМ и самопроизвольное отделение от поверхности роговицы. Строма роговицы под АМ оказалась полностью эпителизированной, практически прозрачной, без врастания новообразованных сосудов. Степень васкуляризации составила 0,65 балла, степень помутнения роговицы — 1,35 балла. В контрольной группе АМ полностью покрывала роговицу и была эпителизирована. При этом эпителий оставался утолщенным, слегка отечным, поверхность его была неравномерной, с остаточным островковым окрашиванием флюоресцеином. Отмечали заметное нарастание помутнения стромы (до 7,2 балла) с формированием умеренно васку-ляризированного бельма. Степень васкуляризации снизилась до 2,3 балла.
На 90-й день на всех глазах основной группы роговица была практически прозрачной (1,2 балла). Врастания сосудов в строму практически не отмечали (0,45 балла). Эпителиальный покров был гладким, с блестящей поверхностью, и флюоресцеином не окрашивался. В контрольной группе помутнение стромы (7,15 балла) и ее васкуляризация (1,25 балла) остались практически на прежнем уровне. Эпителий роговицы был шероховат, умеренно отечен и неравномерно окрашивался 1,0%-ным раствором флюоресцеина натрия. Данные клинического наблюдения за состоянием роговицы в основной и контрольной группе на 30-й, 60-й и 90-й день представлены на рис. 3.
При проведении статистического сравнения основной и контрольной группы по степени васкуля-ризации и прозрачности роговицы были выявлены статистически значимые различия (р<0,05) между этими группами.
Обсуждение результатов
Таким образом, полученные в исследовании результаты показали, что культивированные на АМ аутологичные ЛЭСК полностью прижились на поверхности обнаженной стромы роговицы после их миграции с внутренней стороны амниотического трансплантата. Под покровом АМ они и обеспечили нормальную эпителизацию роговичной стромы, в пользу которой свидетельствовали гладкая блестящая поверхность эпителия, прозрачность эпителия и стромы, а также практически полная аваскуляр-ность последней. С другой стороны, в контрольной группе трансплантат Ам, покрывавший роговицу, послужил субстратом для нарастания конъюнкти-вального эпителия, обеспечив ее полную конъюн-ктивализацию с формированием тотального фибро-васкулярного паннуса. В пользу конъюнктивального фенотипа этого эпителия свидетельствовали его отечность, шероховатость и неравномерное оста-
точное окрашивание флюоресцеином. Приведенные клинические признаки были подтверждены импрессионной цитологией, показавшей отсутствие бокаловидных клеток в эпителии роговиц основной группы и их наличие в эпителии контрольной группы.
Вывод
Предлагаемая методика трансплантации АМ с культивированными на ее поверхности ЛЭСК обеспечивает восстановление нормального эпителиального покрова роговицы на глазах с тотальной лимбальной недостаточностью в эксперименте.
ЛИТЕРАТУРА
1. Черныш В.Ф., Бойко Э.В. Ожоги глаз. Состояние проблемы и новые подходы / В.Ф. Черныш, Э.В. Бойко // 2008. — С. 11-17.
2. Shimazaki J., Aiba M., Goto E. et al. Transplantation of human limbal epithelium cultivated on amniotic membrane for the treatment of severe ocular surface disorders // Ophthalmology. — 2002. — Vol. 109. — Р. 1285-1290.
3. Lambiase A., Rama P., Aloe L., Bonini S. Management of neurotrophickeratopathy // Curr. Opin. Ophthalmol. — 1999. — Vol. 10. — Р. 270-276.
4. Бездетко П.А. Особенности формирования роговичного эпителия после пересадки аутотрансплантата при лимбальной недостаточности в эксперименте / П.А. Бездетко, Е.Н. Ильина, О.В. Наумова [и др.] // Офтальмолопчний журнал. — 2010. — №1. — С. 64-68.
5. Friend J., Thoft R.A. Corneal epitelial cell cultures on stroma carriers // Invest Ophthalmol. Vis. Sci. — 1982. — Vol. 23. — Р. 41-49.
6. Каспаров А.А., Труфанов С.В. Использование консервированной амниотической мембраны для реконструкции поверхности переднего отрезка глаза // Вестник офтальмологии. — 2003. — №3. — С. 45-47.
7. Pellegrini G. Long-term restoration of damaged corneal surfaces with autologous cultivated corneal epithelium / G. Pellegrini [et al.] // Lancet. — 1997. — Vol. 349. — Р. 990-993.
8. Pellegrini G., Bondanza S., Guerra L., De Luca M. Cultivation of human keratinocyte stem cell: current and future clinical application // Cell. Eng. — 1998. — Vol. 36. — P. 1-13.
9. Безушко А.В., Дубовиков А.С., Суетов А.А. и др. Модификация экспериментальной механической модели лимбальной недостаточности // Современные технологии в офтальмологии. — 2017. — №17. — С. 26-28.
10. Sefat F., McKean R., Deshpande P., Ramachandran Ch., J Hill Ch., Sangwan V., Ryan A., MacNei Sh. Production, sterilisation and storage of biodegradable electrospun PLGA membranes for delivery of limbal stem cells to the cornea. 3-rd International Conference on Tissue Engineering, ICTE2013. Procedia Engineering 59. — 2013. — Р. 101-116.
11. Колобов К.А., Дубовиков А.С., Конкиева А.В. и др. Об успешном культивировании лимбальных эпителиальных клеток роговичного эпителия в эксперименте // Материалы научной конференции офтальмологов «Невские горизонты — 2016» / СПбГПМУ. — СПб: Политехника-сервис, 2016. — С. 497-499.
12. Войно-Ясенецкий В.В. Разрастание и изменчивость тканей глаза при его заболеваниях и травмах. — К.: Вища школа, 1979. — 224 с.
13. Inatomi T., Nakamura T. et al. Midterm results on ocular surface reconstruction using cultivated autologous oral mucosal epithelial transplantation // American Journal of Ophthalmology. — 2006. — Vol. 141(2). — P. 267-275.
