CC BY
7
УДК 6-14.7-07: [612.6.052 +616-055.51.7-076.5
Е. Н. Антипенко, О. И. Тимченко
О ПЕРСПЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ АНАТЕЛОФАЗНОГО МЕТОДА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА КЛЕТОК ПЕЧЕНИ КРЫС В ГИГИЕНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
Киевский НИИ общей и коммунальной гигиены им. А. Н. Марзеева
В современных условиях взаимодействия человека и биосферы все большее значение приобретает изучение реакции организма на относительно слабые, но систематически и длительно воздействующие факторы. Это, к сожалению, не учитывается в существующих рекомендациях по экспериментальным методам оценки мутагенной опасности, хотя в последние годы накапливается все больше данных о том, что в механизмах биоэффектов могут быть принципиальные различия при разной интенсивности воздействия на организм одного и того же фактора.
Для выявления мутагенной опасности факторов окружающей среды, применяются различные тест-системы [2, 8, 9], в том числе для выявления повреждений хромосом рекомендуется использовать костный мозг крыс или мышей in vivo, а также культуру лимфоцитов периферической крови человека, исследуя клетки в мета-|»фазе. Однако наряду с определенными достоинствами эти тест-системы обладают существенными недостатками, которые затрудняют, а иногда и делают невозможным использование их при оценке генетической опасности факторов слабой интенсивности в длительных экспериментах.
Костный мозг является весьма разнородной и, что особенно важно, часто обновляющейся тканью: продолжительность жизненного цикла клеток костного мозга у крыс не превышает 12 ч [7]. В таких тканях быстро осуществляется элиминация клеток с поврежденными хромосомами: среднее время существования аберрации в клетке костного мозга около 1,5 клеточного цикла [19]. Это делает костный мозг непригодным для оценки генетической опасности хронически действующих факторов или веществ. Что каса-
ется культуры лимфоцитов, то, естественно, человек не может быть объектом экспериментального изучения индуцированного мутагенеза, а экстраполяция данных, полученных в опытах in vitro, с культуры на целостный организм затруднительна.
Между тем в числе объектов, рекомендуемых для изучения мутагенной активности, не упоминается печень, хотя клетки ее паренхимы в некоторых отношениях более, чем костный мозг и лимфоциты, соответствуют требованиям, которым должны отвечать тест-системы, используемые для гигиенического нормирования мутагенов.
Паренхима печени у взрослых животных в обычных условиях является тканью, практически не делящейся. Митотический индекс в ней составляет 0,01—0,02% [12]. Это означает, что деление клетки печени взрослого животного происходит приблизительно в 100 раз реже, чем клетки костного мозга. В то же время, будучи стимулированной к размножению, печень активно регенерирует [24]. Это позволяет наблюдать деление клеток и, следовательно, оценивать состояние их хромосомного аппарата.
Практическое отсутствие регенерации обусловливает способность клеток печени накапливать мутагенные эффекты длительно воздействующих экзогенных и эндогенных факторов, что, в частности, проявляется возрастанием со временем спонтанного уровня клеток с аберрациями хромосом. Количество аберрантных клеток в печени коррелирует с возрастом. Это установлено как для мышей [10], так и для крыс (табл. 1). Если принять процент клеток с аберрациями хромосом у 3-месячных животных за 100, а у животных в возрасте 4 мес количество абер-
Таблица 1
Процентное содержание клеток с аберрациями хромосом в печени крыс разного возраста (М±т)
Возраст животных, нес I II III IV V VI VII VIII
3 8±0,8 (9) 6±0,2 (10) 9±1,2 (10) 14±1,1 (10) 7+0,3 (10) 14±1,6 (7) 14±0,7 (10) 11±1,0 (10)
3,5 11 ±1,9 (10) 9±1,4 (10) — — — — — —
4 — — 14±1,3 (10) 18±0,9 (9) — — — —
5 — ' — — — 14±0,4 (10) 27±0,7 (7) 28±0,4 (10) —
14 — — — — — — — 43±1,4 (10)
15 — — — — — — — 44±!,3 (8)
Примечание. Приведены данные Е. Н. Антипенко я соавт. П). Здесь и в табл. 3 в скобках — число животных. У каждого животного проанализировано 100 клеток в анателофазе. I—VIII — повторности.
3 Гигиена и санитария № 4
— 65 —
Таблица 2
Процентное содержание клеток с аберрациями хромосом при анателофазном я метафазном методах учета (М±т)
Доза облучения Анализ в анателофаее (печень облученных крыс) Анализ в метафазе (лимфоциты периферической крови человека, облученные In vitro)*
I и m IV V
38,7 мКл/кг (150 Р) 64,5 мКл/кг (250 Р) 34±2,3 (5) 57±2,5 (6) 35±1,0 (7) 57±3,0 (6) 30 ±0,9 (11) 51 ±2,9 (9) 32±1,5 (8) 49 ±0,8 (9) 33,5±1,1 (7) 55±3,0 (7) 31±1,9 (6) 55± 1,1 (7)
Примечание. I—V — повторности; звездочка — данные получены в нашей лаборатории Т. М. Волковой и А. А. Федоровой; в скобках — число животных или доноров в группе.
рентных клеток составит уже 130—155 %. у 5-месячных — 190—200 %, а у 14—15-месячных достигнет 400 %. Следовательно, темп накопления аберрантных клеток с 3 по 5 мес значительно выше, чем с 5 по 15 мес жизни животного. При этом необходимо отметить, что при использовании в опытной и контрольной группе по 10 животных в период с 3 по 5 мес не представляется возможным уловить возрастную разницу в 2 нед. Между тем этого количества крыс оказывается вполне достаточно для выявления различия (Я<0,02) в уровне аберрантных клеток при исследовании животных с разницей в возрасте 1 мес. В то же время для выявления различия (Я<0,001) между 3- и 5-месячными крысами достаточно, чтобы в опытной и контрольной группах было только по 7 животных. Не вызывает сомнения то большое значение, которое может иметь для экспериментальных гигиенических исследований изучение темпа старения. Изучение темпа накопления аберрантных клеток, коррелирующего в течение определенного периода развития животного с возрастом, открывает в этом плане новые перспективы: продолжительность соответствующего эксперимента может составлять только 1—2 мес, а количество животных в сравниваемых группах — 7—10. Как следует из представленных данных, в этих опытах предпочтительнее использовать крыс 3— 4-месячного возраста.
Печень обладает еще одной важной особенностью: ее клетки находятся преимущественно в фазе С0 клеточного цикла, они, естественно, синхронизированы. По однородности в этом отношении они превосходят не только ткань костного мозга, но и популяции лимфоидных клеток [14]. Поэтому при стимуляции печени к регенерации гепатоциты приходят к митозу приблизительно в одно и то же время [21]. Это дает возможность с большей надежностью, чем при использовании других тест-систем, регистрировать цитогенети-ческие изменения именно в первом митозе, что особенно важно при изучении мутагенов физической природы [19]. Процессы клеточного обновления и роста печени у млекопитающих подробно описаны [И, 18]. Относительно высокий и тем более возрастающий спонтанный уровень
аберрантных клеток в печени разрешает в естественных условиях оценивать возможное антимутагенное влияние изучаемых факторов, что полностью исключается при использовании костного мозга и лимфоцитов периферической крови. Известно, что у крыс 3—5 мес полиплоиди-зация клеток печени составляет около 80 % [5]. Поэтому на таком объекте, как печень, применение метафазного метода учета аберраций хромосом весьма затруднительно. В то же время известно, что в случаях, когда по каким-либо причинам невозможен метафазный учет или требуется только количественная оценка структурных мутаций, изучение наследственного материала проводится на стадии поздней анафазы и , ранней телофазы.
При сравнении анателофазного и метафазного методов учета аберраций хромосом можно отметить, что их чувствительность по уровню аберрантных клеток одинакова, о чем свидетельствуют данные литературы [4, 6] и результаты наших исследований (табл. 2). Это особенно важно, так как наиболее адекватным для экстраполяции данных с одного вида млекопитающих на другой является именно показатель количества клеток с аберрациями хромосом [17]. Что касается количества регистрируемых аберраций, то оно по сравнению с полученным метафазным методом может быть занижено [3, 16]. Большая фракция метафазных дицент-риков и кольцевых обменов не в состоянии проявиться в анафазных мостах, так как часть мо-стообразующих фракций разламывается. Кроме того, имеется постоянное (около 50 %) количество обменов, не образующих мостов в анафазах [23]. В то же время некоторые авторы указывают, что количество наблюдаемых фрагментов в анафазе может быть больше, чем в метафазе [13, 23]. Это объясняется тем, что некоторая часть фрагментов обнаруживается не в метафазе, а в анафазе при движении хромосом к полюсам. Кроме того, часть фрагментов образуется при разламывании мостов. Таким образом, в литературе имеются противоречивые мнения о сравнительной чувствительности анателофазного и метафазного методов по количеству регистрируемых аберраций.
L По количеству аберрантных клеток метод ци-Р тогенетического анализа в анателофазе имеет такую же, как метафазный [20, 22], высокую разрешающую способность, которая позволяет, например, на 7—8 животных в группе различать (Я<0,01—0,001) поражение от рентгеновского облучения в дозах, различающихся только в 1,25 раза. Этот метод пригоден и для изучения в широком диапазоне зависимости доза — эффект. Так, A. Conger и Н. Curtis [23] указывают, что патологические анафазы могут служить показателем тяжести лучевого поражения при облучении в дозах до 77 мКл/кг (300 Р). Такой же потолок отмечен при использовании мета-фазного метода [22].
Следует подчеркнуть, что анафазный метод применим при изучении тканей с различным темпом регенерации (табл. 3). Обращает на себя внимание равное повышение количества поврежденных клеток в ответ на воздействие равной интенсивности, хотя лимфатические узлы и костный мозг исследованы спустя часы, а печень — через несколько суток после воздействия. Это еще раз свидетельствует о способности гепатоцитов консервировать генетические повреждения даже после влияния радиации в относительно малых дозах (см. табл. 3).
Оценивая анателофазный метод, следует об-ратить внимание на относительную простоту приготовления препаратов [3], причем количество аберрантных клеток на препаратах печени, приготовленных по обычной гистологической (срезы толщиной 7—8 мк) и цитологической (метод «давленых» препаратов с последующим переводом их в постоянные с помощью сухого льда) методикам, не зависит от способа обработки материала [5], что позволяет пользоваться обеими в зависимости от условий эксперимента.
Необходимо отметить, что анафазный анализ гораздо менее трудоемок, чем метафазный. Продолжительность исследования 100 клеток в анафазе, по нашим данным, приблизительно в 5 раз меньше, чем анализа такого же количества клеток в метафазе.
В заключение следует подчеркнуть, что такой показатель, как количество клеток с аберрациями хромосом в печени крыс, отвечает целому ряду принципиально важных требований, предъявляемых их показателям, используемым в гигиеническом нормировании вообще и мутагенов в частности. Этот тест, будучи достаточно чувствительным, в то же время является интегральным (отражает темп старения) и. несомненно, биологически значимым, а направленность его изменений сама по себе может служить критерием полезности или вредности. Последнее пред-'' ставляется особенно важным, так как создает предпосылки для специальных исследований с целью установления трех нормативных уров-
Таблица 3
Процентное содержание клеток с аберрациями хромосом в костном мозге, лимфатических узлах и печени крыс после рентгеновского облучения (анателофазный анализ)
Группа животных Костный мозг Лимфатические узлы Печень
Необлученныо (1-я) 7,74 мКл/кг —30 Р (2 я) 12.6 мКл/кг —50 Р (3-я) р3~, 2.8±0.3 (5) 6,5 ±0.4 (6) <0.001 11. 7 ±1,6 (6) <0.01 4 ,1 ± 0,5 (5) 7,2± 1.3 (9) <0,05 12 ,6 ± I , 1 (8) <0,01 7,5 ± 0,6 (8) 11,7± 1,6 (8) <0,05 17,3± 1.4 (121 <0.05
Примечание. Показатели для костного мозга и лимфатических узлов взяты из работы Е. Н. Антипенко и соавт. (1].
ней — минимально необходимого, оптимального и предельно допустимого.
Все изложенное не умаляет достоинств мета-фазного метода, разработка которого явилась выдающимся достижением цитогенетики. Его использование совершенно обязательно во всех случаях, когда требуется индивидуальный анализ хромосом. Однако для подавляющего большинства исследований, связанных с гигиеническим нормированием мутагенов, в этом нет необходимости. Более того, учитывая описанные достоинства анателофазного метода, по-видимо-му, будет правильно отдавать ему предпочтение даже при использовании в качестве тест-системы костного мозга.
Литература. 1. Антипенко Е. Н., Пятовская Н. Н., Смирнов А. Д. Влияние цистамина на изменение пост-митотической и интерфазной гибели клеток лнфмати-ческих узлов и костного мозга крыс, облученных в дозах 50 и 400 Р. Л., 1970. (Рукопись депонирована в ВИНИТИ, № 1720—70).
2. Бочков Н. Я, —Природа, 1981, № 2, с. 32—39.
3. Бочков Н. П.. Демин Ю. С. — Генетика, 1972, №5, с. 133—141.
4. Ганасси Е. Э. Радиационное повреждение и репарация хромосом. М., 1976.
5. Дубинин Н. П., Дубинина Л. Г. — Радиобиология, 1963, № 2, с. 181—190.
6. Елисеенко Н. Н. — В кн.: Вопросы радиобиологии. Минск, 1969, с. 217—225.
7. Епифанова О. И.. Терских В. В. Метод радиоавтогра-фин в изучении клеточных циклов. М., 1969.
8. Журков В. С. — В кн.: Генетика человека. М., 1975, т. 2, с. 116—161.
Э.Захаров И. А. — В кн.: Генетические последствия загрязнения окружающей среды. М., 1977, с. 55—68.
10. Кертис Г. Дж. — В кн.: Восстановление и репаратив-ные механизмы в радиобиологии. М., 1972, с. 131 — 150.
11. Кириллов О. И. Процессы клеточного обновления и роста в условиях стресса. М., 1977.
12. Красовский Г. Н.. Соколовский В. Г.. Сусков И. И. и др. —Гиг. и сан., 1977, № 8, с. 27—29.
13. Лиознер Л. Д.. Сидорова В. Ф. — Бюлл. экспер. биол., 1959, № 12, с. 93-96.
14. Малиновский О. В., Михайлова Н. #., Сигалева Н. Я. и др. — Цитология, 1973, №8, с. 1048—1051.
15. Митрофанов Ю. А.. Восканян А. 3. — Биол. ж. Армении, 1972, № 8, с. 42—48.
16. Митрофанов Ю. А., Олимпиенко Г. С. Индуцированный мутационный процесс эукариот. М., 1980.
17. Михайлова Н. Я. Возрастная динамика количества аберрантных клеток в различных тканях облученного
3*
— 67 —
организма. Дис. канд. Л., 1972.
18. Морозова Л. УИ, Кондрина Л. Л, Осетрова Т. Д. — Радиобиология, 1971, № 5, с. 690—695.
19. Сидорова В. Ф., Рябинина 3. А., Лейкина Е. М. Регенерация печенн у млекопитающих. Л, 1966.
20. Стржижовский А. Д. — Генетика, 1972, № 2, с. 93—99.
21. Тимченко О. И., Антипенко Е. Н„ Беженар А. А. и др. — В кн: Радиочувствительность нормальной и опухолевой ткани. Алма-Ата, 1974, с. 110—113.
22. Pyatkin £. К- Alexandrov N. Л'., Vorobyev A. L et al. — Mutat Res., 1972, v. 16, p. 103—109.
23. Conger A. D.. Curtis H. J. — Radiat. Res., 1968, v. 33, p. 150-161.
24. Evalution and Testing of Drugs for Mutagenicity: Principles and Problems (WHO. Techn. Rep. Ser. № 482). Geneva, 1971.
25. Higgins G. M., Andersen R. M. — Arch. Path., 1931, v. 12, p. 186-202.
Поступила 20.07.83
Из практики
УДК 614.777:628.192:622.276
М. А. Галиев
НЕКОТОРЫЕ САНИТАРНО-ГИГИЕНИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ОРГАНИЗАЦИИ КОНТРОЛЯ ЗА СОСТОЯНИЕМ ВОДНЫХ РЕСУРСОВ НА ТЕРРИТОРИИ НЕФТЯ НЫХ МЕСТОРОЖДЕН И И
Уфимский НИИ гигиены и профзаболеваний
На всем пути от скважины до потребителя нефть и нефтепродукты являются потенциальными загрязнителями природных вод. Кроме того, в последние годы на нефтепромыслах широко используются различные реагенты (де-эмульгаторы нефти, ингибиторы коррозии и др.), которые нрн хранении, дозировке и перекачке со стоками также могут загрязнять водоисточники.
С целью выявления источников, причин и пути") их загрязнения на нефтедобывающих предприятиях необходима организация систематического лабораторного контроля по специально разработанной программе за качеством поверхностных водоемов и подземных вод.
Контроль за загрязнением природных вод рекомендуется начинать с предварительного гидрогеологического обследования водопунктов и рекогносцировочного осмотра нефтепромысловых плошадей в контуре нефтеносности каждого разрабатываемого месторождения с обязательным опросом местного населения об изменении вкусовых и других органолептических свойств питьевой воды.
На основании анализа материалов предварительного обследования и контроля за прошлые годы необходимо создать специальную сеть контрольных пунктов наблюдения за загрязнением поверхностных водоемов и подземных вод.
В связи с возникновением загрязнения водных ресурсов на новых участках территории нефтяных месторождений или с прекращением загрязнения вод на определенных участках сеть пунктов должна быть динамичной и ежегодно пересматриваться с учетом данных анализов и жалоб местных жителей.
Для создания сети контрольных пунктов составляются в одинаковом масштабе следующие карты: выкопировка с гидрогеологической карты с нанесением линий водоразделов, ограничивающих бассейны рек и напряжения движения подземных вод, схема промысловых коммуникаций и сооружений с нанесением всех возможных источников загрязнения пресных вод.
С целью охвата контролем всех основных водоносных горизонтов пресных подземных вод и поверхностных водоемов в сеть контрольных пунктов необходимо включить места отбора нроб воды на реках, ручьях, озерах, родниках. колодцах и скважинах.
Контрольные пункты сети подразделяются на режимные в эпизодические. На режимном водопункте наблюдения
пробы необходимо отбирать раз в месяц, на эпизодическом пункте — по необходимости. Под эпизодическим понимается пункт отбора проб воды для уточнения конкретного источника загрязнения водных ресурсов. —
На поверхностных водоемах должно быть не менее двух контрольных водопунктов, расположенных вблизи внешних контуров нефтеносности в верховьях (у истоков) и устьевой части. Если водоем (пруд, озеро, водохранилище) берет начало на этой площади, на данном водоеме должно быть не менее одного контрольного водопункта, расположенного у берега со стороны возможного источника загрязнения. В сеть контрольных пунктов включаются также скважины, пробуренные на водоносные горизонты, залегающие выше и непосредственно над кунгурским водо-упором и не имеющие на территории месторождения очагов разгрузки.
После обнаружения загрязнения вод сеть контрольных пунктов уточняется, для чего необходимо провести исследование (по зонам) подземных вод и осмотр территории месторождений по участкам с целью выявления причин загрязнения и его масштабов. Уточненная сеть пунктов должна позволять фиксировать изменение во времени загрязнения пресных вод как по площади, так и по разрезу. Дополнительно в уточненную сеть включаются эпизодические пункты для отбора проб поверхностных водоемов и подземных вод.
Наряду с контролированием сети водопунктов необходимо проводить не менее одного раза в квартал систематический учет герметичности эксплуатационных колонн, на-сосно-компрессорных труб, пакеров нагнетательных скважин и обследование состояния устьев как названных, так и скважин с незацементированными кондукторами или некачественным цементным кольцом. Следует также систематически учитывать аварийные разливы минерализованных вод, нефтепродуктов и химических реагентов, происходящие на нефтепромыслах, с фиксированием их в специальных журналах.
Для регулярного контроля качества подземных пресных вод и своевременного обнаружения признаков загрязнения ва территории нефтяных месторождений следует заложить специальные наблюдательные скважины. При этом для ^ обоснования их глубины, числа и мест расположения необходимо географическое, геологическое и гидрогеологическое изучение исследуемого района.
