CC BY
155
УДК 574.6+574.52+574.62+574.632
А.В. Дагуров1, Д.И. Стом1, О.Ф. Вятчина2. А.Э. Балаян1, Д.Ф. Кушнарев2
О МЕХАНИЗМЕ АНТИДОТНОГО ДЕЙСТВИЯ ГУМАТОВ ПО ОТНОШЕНИЮ К НЕФТЕПРОДУКТАМ
1 Научно-исследовательский институт биологии при Иркутском государственном университете (Иркутск) 2Иркутский государственный университет (Иркутск)
Изучали механизм, обусловливающий способность гуматов снижать токсическое действие нефти и нефтепродуктов. Показано, что в основе антидотной активности, гуматов по отношению к углеводородам. нефти лежат, их поверхностно-активные свойства.
Ключевые слова: гуминовые вещества, детергенты, поверхностная активность, дафнии, бактерии
ABOUT THE MECHANISM ANTIDOTE ACTIONS OF HUMATES IN RELATION TO MINERAL OIL
A.V. Dagurov1, D.I. Stom1, O.F. Vyatchina2, A.E. Balajan1, D.F. Kushnarev2
1 Scientific Research Institute of Biology attached to Irkutsk State Unversity, Irkutsk
2 Irkutsk State University, Irkutsk
The authors studied, the mechanism, causing ability of humates to reduce toxic action of oil and mineral oil. It is shown, that the basis of antidote activity of humates in relation to hydrocarbons of oil are their surface-active properties.
Key words: humic substances, detergents, surface activity, Daphnias, bacteria___________________________________
Нефть и получаемые из нее нефтепродукты по общему объему и по токсичности являются доминирующими загрязнителями [12]. Естественно, что изучение путей снижения их негативного влияния на биоту представляется крайне актуальной задачей. Согласно ряду сообщений, гуминоподобные вещества (ГВ) ослабляют отрицательное действие отдельных загрязнителей на биологические процессы [6, 17]. Ранее нами было обнаружено, что препараты ГВ способны выступать в роли антидотов углеводородов нефти [10]. Более того, обработка ГВ тест-объектов, подвергнутых воздействию нефтепродуктов, приводила к обратимости негативных эффектов, инициированных углеводородами нефти [3]. Кроме ГВ из огромного числа испытанных нами веществ только поверхностно-активные соединения («Tween-20» и «Triton X-100») ослабляли токсичность углеводородов нефти и устраняли негативные их последствия при последующей обработке. Основываясь на этих экспериментах, было выдвинуто предположение о связи антидотной активности ГВ с их поверхностно-активными свойствами. Цель данного сообщения проверка выдвинутой гипотезы.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
При проведении исследований источником ГВ служил препарат «Гумат-80» (ООО «Гумат», Россия). Его получают с помощью безэкстракционной переработки углей [5]. Кроме того, использовали «Powhumus» (гумат калия из леонардита) производства «Humintech GmbH.» (ФРГ). Там, где дополнительно не указано, в качестве ГВ брали препарат «Гумат-80».
Из нефтепродуктов использовали: дизельное топливо, топочный мазут М-40, алифатические углеводороды: октан, изооктан, нонан, декан, унде-кан, додекан, гексадекан. Все углеводороды были марки х.ч., ч.д.а., или их чистили непосредственно перед опытом. Эмульсии анализируемых нефтепродуктов получали перемешиванием в течение 60 мин на магнитной мешалке [7]. В качестве детергентов брали «Tween-20».
Маточный раствор гумата готовили, растворяя навеску 0,5 г сухого препарата «Гумат-80» в 1 л воды. Затем его центрифугировали при 7 тыс.
об./мин в течение 5 минут. После фильтрации через бумажный фильтр (белая лента) отделяли нерастворившуюся часть.
Оценку токсичности гуматов и нефтепродуктов проводили на лабораторной культуре ветвистоусых рачков Daphnia magna (Straus) [9]. При его применении основным критерием токсичности служит выживаемость рачков. Вместе с тем, в острых опытах чувствительность дафний к нефтегенным загрязнителям при использовании гибели как тест-реакции явно недостаточна для оперативного контроля. Поэтому в наших опытах основным индикатором негативного действия испытуемых веществ на дафний служило количество рачков перешедших на поверхность раздела воздух — водная среда через 24 часа [14]. Эта тест-реакция является значительно более чувствительным показателем на наличие эмульсий нефти и нефтепродуктов, чем гибель дафний [8]. Методика наблюдения всплытия дафний в эмульсиях нефтепродуктов в поверхнос-
тный слой дана в [11]. Содержание, культивирование и эксперименты проводили в лабораторных условиях согласно общепринятым методикам [13].
Для выращивания дафний и контроля использовали отстоянную воду. Для опытов отбирали молодь одного помета в возрасте 2-х суток. В каждый экспериментальный сосуд объемом 50 мл помещали по 10 рачков. Опыт и контроль имели не менее 6 повторностей при трех параллелях в каждой.
В качестве объектов исследований использовали также споры бактериальных культур Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki и Bacillus cereus 9. Споры бактериальных культур получали по [2].
Оценку гидрофильно-гидрофобных свойств бактериальных спор вели по [16]. Гидрофобность поверхности спор оценивали по количеству спор, перешедших из водной бактериальной суспензии в гексадекан. Для этого определяли оптическую плотность с фильтром при максимуме X = 400 нм. Нефтепродукты после обработки ими бактериальных спор удаляли двукратным центрифугированием и последующим ресуспендированием спор с доведением оптической плотности до исходного показателя (0,6).
Для исследования влияния гуматов непосредственно на эмульсии нефтепродуктов использовали метод подсчета числа капель эмульгированных нефтепродуктов в 1 см3 эмульсии [4]. Кроме того, определяли средний диаметр капель эмульсии, рассчитывали среднее значение площади одной капли и ее средний объем, а также площадь поверхности раздела фаз [1].
Аккумуляцию нефтепродуктов на дафниях наблюдали с помощью люминесцентного микроскопа «Люмам И-1». Для возбуждения флуоресценции (X = 365 нм) применяли ртутную лампу ДРШ 250-3 и светофильтр УФС 6, для выделения света флуоресценции — ЖС 3. Для подкрашивания нефтепродуктов использовали краситель «Судан 2».
Для статистической обработки полученных данных пользовались общепринятыми методами [15] с применением пакета программ Statgraf 3.0 и Excel 97. Достоверность различия определяли с помощью критерия Стьюдента. Выводы сделаны при вероятности безошибочного прогноза Р > 0,95.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Люминесцентное микроскопирование выявило следующее. Капли эмульсии нефтепродуктов давали характерное синее свечение. Подобная же синяя пленка обнаруживалась и вокруг тел дафний, всплывших на поверхность. Накопление нефтепродуктов на поверхности дафний, всплывших на границу раздела жидкость — воздух, подтвердила также световая микроскопия. Рачки, переходившие в таких эмульсиях на поверхность, имели вокруг тела красный ободок. Точно такой же цвет приобретали и капли нефтепродуктов, окрашенные суданом. При этом важно отметить, что у рачков, извлеченных из толщи этих же эмульсий, подобный ободок отсутствовал.
В следующей серии экспериментов дафний погружали на 5 сек. в гексадекан или другие нефтепродукты. Благодаря этой процедуре поверхность тела
рачков покрывалась пленкой углеводорода. Пленку хорошо было видно при люминесцентном микроско-пировании или после окрашивания нефтепродуктов суданом. После этого в первом случае дафний помещали в воду. Во втором варианте — рачков, обработанных нефтепродуктами, опускали в раствор гума-та с концентрацией 0,1 г/л и затем перемещали в чистую воду. В третьем случае дафний последовательно погружали в углеводород, затем в растворы ПАВ (0,1 мл/л) и помещали в воду. Наблюдения показали, что все дафнии, обработанные углеводородами нефти и перенесенные в воду, находились на границе раздела жидкость — воздух. Дафнии, последовательно помещенные в нефтепродукты, а затем в растворы гумата или ПАВ и перенесенные в чистую воду, переходили в толщу инкубационного раствора и там активно плавали. Это свидетельствовало в пользу связи затрудненности перехода рачков в толщу эмульсии с повышением гидрофобности поверхности их тела, вследствие адсорбции на покровных тканях нефтепродуктов. Переход же дафний в толщу инкубационных сред после их обработки гуматами или ПАВ в этом случае можно было предположительно объяснить увеличением гидрофильности поверхности рачков. При микроскопировании рачков после обработки ГВ и ПАВ ни в световом микроскопе, ни в люминесцентном пленка углеводородов на панцире ракообразных не обнаруживалась.
Высказанная гипотеза подтверждается результатами опытов по оценке гидрофильно-гидрофобных свойств поверхности бактериальных спор. Выдерживание спор B. thuringiensis в эмульсиях нефтепродуктов приводило к повышению гидрофобности их поверхности (табл. 1).
Из таблицы 1 видно, что после инкубирования в растворах гумата индекс гидрофобности поверхности бактериальных спор B. thuringiensis был значительно ниже, чем у исходной бактериальной суспензии. Так, после обработки «Гумат-80» индекс гидрофобности снизился на 47 %, а в случае «Powhumus» — на 31 %.
Гуматы не только уменьшали гидрофобность поверхности исходных бактериальных спор, но и спор, обработанных различными нефтепродуктами. Например, после инкубирования в мазуте индекс гидрофобности составлял 72 %. После обработки тех же бактериальных суспензий 0,5 г/л «Гумат-80» индекс снизился на 45 %. Подобное действие на споры, находившихся в нефтепродуктах, оказывали и ПАВ (табл. 1). Аналогичный эффект гуматов и ПАВ обнаружен и при проведении экспериментов с бактериальными спорами B. cereus. Так до обработки мазутом индекс гидрофобности B. cereus составлял 25 %, после — 48 %. Если же споры B. cereus последовательно обрабатывали мазутом, а потом растворами гумата или ПАВ, то индекс гидрофобности снижался до 27 % и 30 % соответственно.
Таким образом, гуматы и ПАВ, действуя на бактериальные споры, изменяли гидрофильно-гидрофобный показатель их поверхности в сторону повышения гидрофильности. Обработка нефтепродуктами суспензий спор бактерий приводила к
Таблица 1
Индекс гидрофобности спор штамма бактериальной культуры Bacillus thuringiensis после обработки гуматами, ПАВ и нефтепродуктами
Состав суспензии Индекс гидрофобности, %
Исходная суспензия бактериальных спор 55,7 ± 1,7
Суспензия после обработки «Гумат-80» (0,1 г/л) 8,2 ±0,3
Суспензия после обработки «Pow^шmus» (0,1 г/л) 23,9 ± 1,8
Суспензия после обработки ПАВ «Tween-20» (0,1 мл/л) 22,8 ± 1,3
Суспензия после обработки мазутом (0,1 мл/л) 72,3 ± 2,1
Суспензия после последовательной обработки мазутом (0,1 мл/л) и «Гумат-80» (0,1 г/л) 26,8 ± 2,6
Суспензия после последовательной обработки мазутом (0,1 мл/л) и «Tween-20» (0,1 мл/л) 32,4 ± 2,5
Таблица 2
Влияние 0,1 г/л «Гумат-80», 0,1 мл/л ПАВ «Tween-20» и их смесей на количество и размер капель
в эмульсиях нефтепродуктов (3 мл/л)
Нефтепродукт Параметры эмульсии Эмульсия Эмульсия + гумат Эмульсия + ПАВ Эмульсия + гумат + ПАВ
Дизельное топливо Количество капель в 1 см3 эмульсии (7,2 ± 0,4) x 107 (4,3 ± 0,3) x 107 (4,2 ± 0,4) x 107 (2,5 ± 0,3) x 107
Средний диаметр капли, мкм 22,7 ± 3,5 7,2 ± 0,6 3,5 ± 0,5 2,1 ± 0,2
Мазут Количество капель в 1 см3 эмульсии (6,4 ± 0,5) x 107 (3,4 ± 0,2) x 107 (3,1 ± 0,1) x 107 (2,3 ± 0,2) x 107
Средний диаметр капли, мкм 19,6 ± 2,0 5,7 ± 0,6 5,9 ± 0,4 3,3 ± 0,5
Гексадекан Количество капель в 1 см3 эмульсии (6,8 ± 0,4) x 107 (4,3 ± 0,3) x 107 (3,6 ± 0,3) x 107 (2,5 ± 0,1) x 107
Средний диаметр капли, мкм 16,8 ± 1,8 6,3 ± 0,5 3,5 ± 0,1 2,6 ± 0,3
возрастанию гидрофобности их поверхности. Под влиянием ГВ и ПАВ индекс гидрофобности поверхности спор бактерий предварительно подвергнутых воздействию нефтепродуктов снижался.
Как видно из таблицы 2, добавление 0,1 г/л гума-та и 0,1 мл/л ПАВ «Tween-20» к эмульсиям нефтепродуктов (3 мл/л) и углеводородов нефти приводило к уменьшению размера и количества капель в 1 см3 объема по сравнению с эмульсиями нефтепродуктов и углеводородов нефти без добавления гумата и ПАВ.
Известно, что ПАВ снижают долю эмульгированной фазы гидрофобных веществ в гидрофильной дисперсионной среде. При этом происходит увеличение отношения площади поверхности капель к их объему [1]. Кроме того, ПАВ солюбилизируют органические вещества малорастворимые в воде. Следовательно, уменьшение дисперсной фазы и диаметра капель нефтепродуктов под действием ПАВ, а также гуматов и усиление эффектов ГВ и детергентов на эмульсии при их совместном действии можно рассматривать, как свидетельство того, что ГВ способны выступать как аналоги детергентов, то есть ГВ снижают поверхностное натяжение на границе раздела фаз нефть-вода и солюбилизируют нефтепродукты.
Таким образом, общий характер влияния гуматов и детергентов на реакции дафний в присутствии эмульсий нефтепродуктов представляет собой следующее:
1) способность обеих групп веществ предотвращать всплытие рачков на границу раздела вода-воздух;
2) способность вызывать обратный переход дафний в толщу эмульсии;
3) сходное влияние этих веществ на дисперсное состояние эмульгированных нефтепродуктов, выражающееся в уменьшении размеров и числа капель в эмульсиях углеводородов нефти;
4) взаимоусиление их эффектов при совместном действии;
5) противоположное действие ГВ, ПАВ и нефтепродуктов на степень структурированности воды свидетельствуют о том, что одним из механизмов антидотного действия ГВ по отношению к углеводородам нефти лежит их способность выступать в роли аналогов ПАВ.
Авторы признательны И.В. Перминовой за предоставление препарата «Powhumus».
Работа выполнена частично при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 05-04-97237).
ЛИТЕРАТУРА
1. Абрамзон А.А. Поверхностно-активные вещества. Синтез, анализ, свойства, применение: учеб. пособие для вузов / А.А. Абрамзон, Л.П. Зайченко, С.И. Файнгольд. — Л.: Химия, 1988. - 200 с.
2. Вятчина О.Ф. Штаммы Bacillus thuringiensis, выделенные при эпизоотии лиственничной мухи (Hylemyia laricicola) в Камчатской области / О.Ф. Вятчина // Сибирский экологический журнал. - 2004. - № 4. - С. 501 -506.
3. Дагуров А.В. Снятие некоторыми веществами эффектов нефтепродуктов на Cladocera / А.В. Дагуров, А.Э. Балаян // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2003. - №7. - С. 100-102.
4. Жмур Н.С. Методика определения токсичности вод, водных вытяжек из почвы, осадков сточных вод и отходов по изменению уровня флуоресценции хлорофилла и численности клеток водорослей / Н.С. Жмур, Т.Л. Орлова. - М.: АКВА-РОС, 2001. - 44 с.
5. Левинский Б.В. Все о гуматах. 4-е изд., пе-рераб. и доп. / Б.В. Левинский. - Иркутск: Корф-Полиграф, 2000. - 75 с.
6. Линник П.Н. Роль гумусовых веществ в процессах комплексообразования и детоксикации (на примере водохранилищ Днепра) / П.Н. Линник, Т.А. Васильчук // Гидробиол. журн. - 2001. -Т. 37, №4. - С. 98-112.
7. Миронов О.Г. Результаты изучения токсичности и биоразлагаемости некоторых дис-пергентов в морской воде / О.Г. Миронов, А.А. Лебедь, Г.Н. Семанов, И.А. Мурашев // Экспериментальная водная токсикология. - Рига: Зинатне, 1985. - Вып. 10. - С. 122- 129.
8. Патент №2152612 РФ, С 1 7 О 01 N 33/18 Способ биотестирования нефтепродуктов / А.Э. Балаян, Д.И. Стом, М.Н. Саксонов. -№ 96114126/04; Заявл. 96114126; Опубл. 10.07.2000.
- Бюлл. № 19.
9. ПНД Ф Т 14.1:2:3:4.5-2000 // Методика определения токсичности воды по смертности и изменению плодовитости дафний. - М., 2000. - 35 с.
10. Стом Д.И. Комбинированное действие нефтепродуктов и «Гумата» на дафний / Д.И. Стом,
А.В. Дагуров // Сибирский экологический журнал.
- 2004. - № 1. - С. 35-40.
11. Стом Д.И. Токсикологическая оценка неф-тезагрязненных вод с помощью ракообразных / Д.И. Стом, А.Э. Балаян, М.Н. Саксонов, Д.В. Лозовой // Сибирский экологический журнал. - 2003.
- №5. - С. 565-567.
12. Технологии восстановления почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Справочник.
- М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2003. - 258 с.
13. Fer^ndez-Alba A.R. Toxicity evaluation of single and mixed antifouling biocides measured with acute toxicity bioassays / A.R. Fernбndez-Alba, M.D. Hernando, L. Piedra, Y. Chisti // Analytica Chimica Acta. - 2002. - Vol. 456. - P. 303-312.
14. Method of biotesting of oil pollution based on be-havior of Daphnia magna / A.E. Balayan, M.N. Sa-xonov, D.I. Stom, V.P. Polovitkin et al. // Program and Proceedings of the Inter-national Symposium on Ecotechnology in Environmental Protection and Fresh Water Lake Management. - Natural Science Auditorium, PaiChai University. - 2000. - P. 254.
15. Piegorsch W.W. Statistics for Environmental Biology and Toxicology (Interdisciplinary Statistics) / W.W. Piegorsch, A.J. Bailer. - Chapman & Hall, 1997. - 579 p.
16. Rosenberg M., Gutiik D., Rosenberg E. // FEMS. Microbiol. Lett. - 1980. - N 9. - Р. 29.
17. Towards a quantitative structure activity relationship (QSAR) of dissolved humic substances as detoxifying agents in freshwaters / C.E.W. Steinberg, M. Haitzer, R. Bruggemann, I.V. Perminova et al. // Internat. Rev. Hydrobiol. - 2000. - Vol. 85. -P. 253-266.
