CC BY
16
УДК 577.112.5
О.В. Богатова1, Т.В. Ракитина2, И.А. Костанян2, В.М. Липкин2
1 Московский физико-технический институт (Национальный исследовательский университет) 2 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
О о «»
клеточной локализации и потенциальных партнерах взаимодеиствия
нового белка гапонина
Ранее в клетках линии промиелоцитарного лейкоза человека HL-60 был обнаружен новый белок гапонин (haponin, HLDF-alike protein), обладающий структурной гомологией с фактором инициации трансляции EIF1A. Транзиентная трансфекция зеленого флуоресцентного белка, слитого с гапонином, выявила эффект ядерного накопления продукта экспрессии в клетках CHO-K1, что было подтверждено методами конфокальной микроскопии и вестерн-блоттинга. Стабильный клон, экспрессирующий слитый белок, пролиферировал значительно медленнее, чем исходная линия CHO-K1 или клетки, содержащие GFP. Продуцируемый в бакуловирусной системе гапонин с 6-гистидиновым тагом на М-конце соосаждал из клеточных лизатов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH) и фактор элонгации 2 (EF2), которые являются его предполагаемыми белковыми партнерами.
Ключевые слова: гапонин, EIF1A, ГАФД, GAPDH, EF2, ядро клетки, пролиферация.
I. Введение
В 2007 году при исследовании фактора диф-ференцировки клеток линии промиелоцитарного лейкоза человека HL-60 (HLDF) были получены пептиды и заклонирована кДНК, принадлежащая гипотетическому белку человека [1]. Оказалось, что аминокислотная последовательность данного белка предсказана и в базе данных Национального центра биотехнологической информации США и называется EIF1AD (eukaryotic translation initiation factor 1A domain containing protein). Этот белок обладал структурной гомологией с трансляционным фактором EIF1A и, как большинство белков семейства S1, содержал PHK-связывающий домен. По данным [2] одним из вероятных партнеров взаимодействия EIF1AD в двугибридной системе является транскрипционный фактор STAT1 [3], который при проведении сигнала транслоцируется в ядро клетки [4].
Обнаруженный белок назвали гапонин (haponin, HLDF-alike protein). Длина его аминокислотной цепи 165 а.о. (рис. 1), расчётная молекулярная масса 19,2 кДа. Примечательно также, что аминокислотная последовательность гапони-на содержит неканонические сигналы ядерной локализации (рис. 1).
Целью данной работы является изучение распределения гапонина в клетке, а также определение партнеров взаимодействия белка.
1 MSQATKRKHV VKEVLGEHIV PSDQQQIVRV LRTPGNNLHE VETAQGQRFL 51 VSMPSKYRKNIWIKRGDFLI VDPIEEGEKV KAEISFVLCK DHVRSLQKEG 101 FWPEAFSEVA EKHNNRNRQT QPELPAEPQL SGEESSSEDD SDLFVNTNRR
Рис. 1. Аминокислотная последовательность гапо-нина. Выделены потенциальные сигналы ядерной локализации
II. Результаты и обсуждения
На первом этапе исследований была изучена экспрессия эндогенного гапонина в разных типах клеток млекопитающих. Для этого выделена тотальная РНК и приготовлены лизаты 6-ти клеточных линий человека: U87-MG (глиобластома), Нек293 (эмбриональные клетки почки), Рапс1 (рак поджелудочной железы), Мс£7 (рак молочной железы), Ма-Н460 (рак лёгких), К562 (мие-лоидный лейкоз) и клеток яичника китайского хомячка СНО-К1. Количество специфической РНК оценивалось методом ПЦР с обратной транскрипцией, а количество белка — вестерн-блоттингом с антителами к полноразмерному гапонину, экс-прессированному в бакуловирусной системе. Результаты свидетельствуют о том, что эндогенный гапонин присутствует в большинстве эукариотиче-ских клеточных линий и его количество примерно одинаково (рис. 2). Также оказалось, что элек-трофоретическая подвижность природного белка соответствует молекулярной массе около 30 кДа, что указывает на наличие в исследуемом белке посттрансляционных модификаций.
Для исследования клеточной локализации га-понина на основе вектора pEGFP-C1 (С1оП;есЬ, США), позволяющего экспрессировать GFP в эу-кариотических клетках, была создана рекомби-нантная конструкция, кодирующая слитый белок GFP-Haponin, и проведена транзиентная трансфекция клеток линии СНО-К1. При этом обнаружено ядерное накопление белка GFP-Haponin, тогда как GFP не проявлял такого эффекта (рис. 3). Известно, что GFP благодаря своим небольшим размерам (27 кДа) может проникать сквозь ядерную пору и накапливаться в ядре [5], поэтому для клеток, трансфицированных пустым вектором, характерно диффузное окрашивание ядер.
б, antiHaponin
а. hapoiiin primers
PANC1 Hek293 MCF7 K562 CH0-K1 Nci-H460
a, GAPDH primers
PANC1 Hek293 MCF7 K562 CH0-K1 Noi-H460
H
К562 PANC1 MCF7 Nci-H460 Нек293 СНО-К1
б, Ponso-Red
К562 PANC1
MCF 7 Nci-H46Q Hek293
Рис. 2. Экспрессия эндогенного гапонина в различных эукариотических линиях: U-87 MG, Hek293, CHO-K1, Pane 1, Mcf7, Nei-H460, K562: а — ПЦР с обратной транскрипцией на матрице кДНК клеточных линий с праймерами, синтезированными по нуклеотидной последовательности гапонина. Контроль — ген GAPDH; б — вестерн-блоттинг тотальных клеточных лизатов с антителами к полноразмерному гапонину, синтезированному в бакуловирусной системе
W Т;
/
v° .'.г гг
Рис. 3. Транзиентная трансфекция клеток CHO-K1: а, б — плазмидной конструкцией, экспрессирующей GFP-Haponin; в, г — вектором, экспрессирующим GFP; а, в — флуоресценция (488/507); б, г — светлое поле. Фотографии сделаны через 24 ч после трансфекции, микроскоп OlympusCX 41, InfinityX DeltaPix Camera
Рис. 4. ПЦР с обратной транскрипцией СНО-К1 и её стабильных клонов: а — ПЦР с праймерами, синтезированными по нуклеотидной последовательности гапонина, б — контроль (ген ОАРЮН)
Рис. 5. Вестерн-блоттинг ядерных и цитоплазматических лизатов клеток линии СНО-К1 и её стабильных клонов: а — гибридизация с моноклональными антителами к ОРР, б — окрашивание мембраны Ропво-Иеф 1-3 — ядерная фракция, 4-6 — цитоплазматическая фракция, 1,6 — СНО-К1-ОРР, 2, 5 — СНО-К1, 3, 4 — СНО-К1-ОРР-Нарошп
Рис. 6. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия (Nikon TE-2000, Japan) клеток исходной линии CHO-K1 (а, б) и её производных, стабильно экспрессирующих GFP-Haponin (в, г) и GFP (д, е); а, в, д — флуоресценция, 543 нм; б, г, е — окрашивание ядерного хроматина DAPI, 488 нм. Сигнал исходной линии CHO-K1 в зеленом канале отсутствует
На основе линии СНО-К1 мы вывели стабильные клоны, экспрессирующие GFP-Haponin, а также клоны, экспрессирующие GFP. Появление PHK, кодирующей слитый белок GFP-Haponin, было подтверждено методом ПЦР с обратной
транскрипцией на матрице тотальной PHK, выделенной из клеток линий СНО-К1, CHO-GFP и CHO-GFP-Haponin (рис. 4). В качестве эндогенного контроля использовали ген GAPDH. Усиление яркости полосы гапонина свидетельствует об
увеличении количества РНК гапонина в клетках СНО^ЕР-Нарошп.
Экспрессия химерного белка также была подтверждена с помощью иммуноблоттинга ядерных и цитоплазматических фракций клеток выведенных клонов и исходной линии с моноклональны-ми антителами к GFP (рис. 5). Экспрессируемый комплекс GFP-Haponin присутствует и в ядерной, и в цитоплазматической клеточных фракциях и имеет ожидаемый размер 55-60 кДа.
Для подтверждения ядерной локализации гапонина в клетках мы провели окрашивание ядерного хроматина DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол) фиксированных препаратов клеток исходной линии СНО-К1 и ста-
бильных клонов. В процессе проведения эксперимента были подобраны условия пермеабилизации с использованием мягкого детергента дигитонина, так как использование Тритон-Х-100 приводило к вымыванию GFP из цитоплазмы клеток. Полученные фотографии флуоресцирующих клеток (рис. 6) анализировали с помощью программы ImageJ, позволяющей сравнить среднюю интенсивность флуоресценции в области ядра и цитоплазмы клетки. Для каждой культуры обсчитывали не менее 50 клеток. Полученные данные подтверждают ядерную локализацию GFP-Haponin (рис. 7) и, так как размер слитого белка превышает размер ядерной поры, указывают на наличие механизмов активного ядерного транспорта.
Рис. 7. Отношение среднего сигнала в области ядра клетки к среднему сигналу в области цитоплазмы. Усреднение по 50 клеткам. Подсчёт выполнен в программе ImageJ
Рис. 8. Кривые пролиферации СНО-К1 и её стабильных производных: а — флуоресценция прикрепившихся клеток, б — измерение уровня АТФ с помощью люминисцентного тест-набора (Promega)
При культивировании CHO-K1, CHO-GFP и CHO-GFP-Haponin было замечено, что клетки, экспрессирующие GFP-Haponin, пролиферируют значительно медленнее других двух линий. Для сравнения скорости пролиферации клеток мы определяли количество живых клеток в культуре в разные временные точки двумя способами. Во-первых, для флуоресцирующих линий CHO-GFP-Haponin и CHO-GFP с помощью флуоримет-ра измеряли флуоресценцию клеток, прикрепившихся ко дну плашки. Во-вторых, для всех трёх линий производили измерения количества АТФ в клеточных лизатах с помощью набора реагентов Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega). Оба метода подтвердили, что скорости пролиферации клеток CHO-K1 и CHO-GFP практически совпадают, что говорит о том, что экспрессия GFP не оказывает существенного влияния на клетку, а клетки двух клонов, экспресси-рующих GFP-Haponin, пролиферировали в 1.5 и 2 раза медленнее (рис. 8). Примечательно, что по литературным данным активация STAT1, вероятного партнера гапонина, может ингибировать пролиферацию [6].
В процессе исследования белка была получена экспрессия гапонина с полигистидиновым тагом на N-конце в бакуловирусной системе. Экспрес-сированный гапонин использовали для получения поликлональных антител на полноразмерный белок и для поиска белка-партнера гапонина методом соосаждения (pull-down). Для эксперимента использовали посаженный на Ni-NTA-сефарозу гапонин, выделенный из клеток насекомых, и тотальный лизат клеток CHO-K1. Связавшиеся с Ni-NTA-сефарозой и гапонин-содержащей смолой белковые фракции разделялись на ПААГ, и продукты специфического связывания направлялись на LC-MS. Было показано, что предполагаемыми партнерами гапонина являются глицеральде-гид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) и фактор элонгации 2 (EF2) (рис. 9). Кроме того, белки актин и белок теплового шока 90 кДа (Hsp-90) были обнаружены как в специфической, так и неспецифической фракциях.
GAPDH в изобилии присутствует в клетке и играет важнейшую роль в энергетических процессах, но, с другой стороны, обладает широким набором функций, не связанных с гликолизом: регуляция трансляции, ядерный экспорт PHK, репликация и репарация ДНК, апоптоз [7-9]. Разнообразие функций, показанных для GAPDH, в особенности наличие у него ядерных функций, указывает на возможность взаимодействия с гапонином.
Основной функцией EF2 является катализ транслокационного перехода с участием ГТФ при трансляции белка на рибосоме [10]. Наличие у га-понина PHK-связывающего домена и его структурная гомология с EIF1A позволяют предположить участие белка в рибосомальном синтезе, что
подразумевает взаимодействие с другими рибосо-мальными белками.
л б
Рис. 9. Pull-down из тотальных лизатов клеток культур CHO-K1 с использованием гапонина, экс-прессированного в бакуловирусной системе, посаженного на Ni-NTA-сефарозу: а — специфическое связывание, б — неспецифическое связывание; 1 — гапонин (30 кДа), 2 — GAPDH (37 кДа), 3 — актин (42 кДа), 4 — Hsp-90 (90 кДа), 5 -EF2 (95 кДа). Денатурирующий электрофорез в 13%-полиакриламидном геле
Таким образом, в данной работе было продолжено исследование недавно открытого белка га-понина [1]. Было показано, что эндогенный гапо-нин присутствует в разных типах эукариотиче-ских клеток. Стабильная экспрессия слитого белка GFP-Haponin в клетках CHO-K1 вызывает два эффекта: во-первых, наблюдается ядерное накопление продукта экспрессии. Во-вторых, экспрес-
сия химерного белка вызывает замедление пролиферации клеток по сравнению с контрольными линиями CHO-K1 и CHO-GFP. Также были идентифицированы вероятные партнеры гапони-на — белки GAPDH и EF2, позволяющие предположить связь гапонина с рибосомой и процессом трансляции. Однако для подтверждения нашей гипотезы требуется проведение дальнейших экспериментов по иммунопреципитации гапонина антителами против GAPDH и EF2 и изучение его PHK-связывающей способности. Также остаётся открытым вопрос о взаимодействии гапонина со STAT1.
III. Экспериментальная часть
III.1. Материалы
В работе использованы следующие реагенты: среда сухая DMEM, пенициллин-стрептомицин, неомицин, раствор трипсин / ЭДТА (Sigma, США), эмбриональная бычья сыворотка (ПанЭко, Россия), трансфекционный агент Transfast, эндонуклеазы рестрикции BamHI, EcoRI, Sali, Taq-полимераза (Promega, США), вектор pEGFP-C1 (Clontech, США), остальные реактивы — фирмы Sigma, США. Также использовали набор для выделения тотальной PHK «RNeasy mini Kit» (Quiagen, США), набор для выделения плазмидной ДНК и набор для люминесцентной детекции живых клеток «Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay» (Promega, США).
Для экспрессии гапонина в бакуловирусной системе Bac-to-Bac (Invitrogen) применяли вектор pFastBacHT-B, клетки E. Coli DH10Bac, клетки насекомых SF9 (Invitrogen)
Для иммунохимических исследований использовали сыворотку кролика, содержащую поликло-нальные антитела на экспрессированный в бакуло-вирусной системе гапонин. Моноклональные мышиные антитела против GFP были любезно предоставлены к.б.н. Т. Ерохиной, ИБХ РАН. Также использовали козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, овечьи антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (US BioLogical, USA).
III.2. Методы
ПЦР, электрофорез нуклеиновых кислот и белков, вестерн-блоттинг, трансформация бактериальных клеток, культивирование, транзиентная и стабильная трансфекция эукариотических клеток проводились, как описано, повсеместно.
III.3. Клонирование
Первоначально кДНК гапонина была заклони-рована в вектор pGem-T-Easy (Promega, США), затем по сайтам EcoR1 переклонирована в полилинкер экспрессирующего вектора pEGFP-C1
(Clontech, США). Клоны, содержащие кДНК гапонина в правильной ориентации, отбирали с помощью ПЦР, а сохранение рамки считывания при переходе от кДНК GFP к кДНК гапонина подтверждали определением нуклеотидной последовательности. Полученный конструкт pEGFP-Haponin далее использовали для изучения клеточной локализации гапонина.
III.4. Конфокальная микроскопия
Подготовка клеточных препаратов для окрашивания DAPI проводилась по стандартной методике [11], в качестве пермеабилизующего агента использовали 0,2% дигитонин. После окрашивания регистрацию проводили на инвертированном микроскопе Nikon TE-2000 (Japan), снабженном конфокальной лазерной системой C1, лазерами Ar (488), G-NeHe (543), под объективом CF1 fluor 100x oil, violet corrected, фотографировали и анализировали распределение интенсивности в зеленом и синем каналах с помощью программы ImageJ и встроенных плагинов.
III.5. Анализ пролиферации
Для сравнения уровней пролиферации клеточных линий клетки, достигшие 80% конфлю-ентности, рассеивали на 96-луночную плашку с затемненными стенками по 1000 клеток в лунку, по 2 ряда на клеточную линию и культивировали в С02-инкубаторе при 37 °C. Крайние ряды лунок заполняли средой. Для измерений использовали прибор Universal Microplate Analyzer Fusion-Alpha FP HT (Perkin Elmer, США) со встроенным люминометром и флуори-метром. Ежедневно измеряли интенсивность флуоресценции клеток, прикрепившихся к пластику, а также, используя набор «Promega Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay», определяли количество АТФ в клеточных лизатах по люминис-ценции. Ежедневно лизировали по 4 лунки, засеянные клетками каждой линии. Лунки со средой выступали в качестве контрольных. Результаты обрабатывались в программе MS Excel и представлялись в виде зависимости клеточного прироста от времени культивации.
III.6. Выделение гапонина из клеток насекомых. Pull-down
В бакуловирусной системе экспрессии «Bac-to-Bac» (Invitrogen, США) была получена экспрессия рекомбинантного гапонина, содержащего по-лигистидиновый таг на N-конце. Продукт экспрессии был очищен методом аффинной хроматографии на №2+-сефарозе и использовался для получения поликлональных антител на гапонин и для поиска белка-партнера методом pull-down.
Осадки (3—4 г) клеток насекомых SF9, содержащие экспрессированный гапонин, лизировали в буфере А (0,5 MNaCl,
20 MMTWs-HClpH8,2, 0,1%Triton-X-100) с добавлением ДНКазы и ингибиторов протеаз. Детергент-растворимую фракцию лизатов инкубировали с 2 мл №2+-сефарозы при +4 °C в течение часа. Связавшийся гапонин отмывали буфером А, содержащим 30 мМ имидазола, до полного исчезновения белка в отмывке, элюировали буфером (0,5 MNaCl, 20 мМТНв-НС1рН8,2, 0,5 М имидазол) и пропускали через гель-фильтрационную колонку для обессоливания. Полученный гапонин иммобилизовали на небольшое количество №2+-сефарозы (250 мкл) в течение ночи при +4 °C и отмывали. Конфлюэнтные клетки CHO-K1 (50 млн) лизировали в буфере А, содержащим 0,5%Triton-X-100, ДНКазу, ингибиторы протеаз. К детергент-растворимой фракции ли-зата добавляли раствор 3% октилглюкозида в 20 мМТНв-НС1, доводя концентрацию NaCl до 150 мМ. Подготовленный таким образом лизат инкубировали с №2+-сефарозой (1 мл) при +4 °C в течение 40 мин. Затем фракцию, не связавшуюся со смолой, наносили на колонку с иммобилизованным гапонином. Колонку промывали отмывоч-ным буфером (0,5% октилглюкозид, 150 мМ^С1, 20 мМТНв-На, 0,3%Triton-X-100), затем элюиро-вали гапонин в комплексе с возможными белками-партнерами буфером для элюции. Полученные фракции анализировались с помощью электрофореза в ПААГ. Гели окрашивались по методу Кумасси, и интересующие полосы вырезались и сдавались на жидкостную хроматомасс-спектро-мектрометрию.
IV. Статистика проведения экспериментов
Эксперименты по определению уровня экспрессии гапонина в клеточных линиях, транзи-ентной трансфекции и соосаждению (pull-down) повторялись трижды с аналогичными результатами. По 2 стабильных клона, экспрессирующих GFP и GFP-Haponin, были получены и использованы для изучения локализации продукта экспрессии и скорости пролиферации клеток выведенных линий. Люциферазный и флуоресцентный анализ на пролиферацию и конфокальная микроскопия повторялись по 2 раза для каждого клона с аналогичными результатами. На фотографиях представлен типичный эксперимент, на гистограммах и графиках приведены средние значения для нескольких экспериментов и стандартные отклонения.
V. Благодарности
Авторы выражают благодарность И.М. Молот-ковской за проведение экспериментов по конфокальной микроскопии.
Данная работа выполнялась при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 08-04-01127-а) и гранта Российской академии наук по молекулярной и клеточной биологии.
Литература
1. Вонаршенко А.В., Радченко В.В., Га-пон М.В., Родионов И.Л., Бабиченко И.И., Каку-ев Д.Л., Артамонов И.Д., Гарковенко А.В., Дьяч-кова Л.Г., Липкин В.М., Костанян И.А. Идентификация и экспрессия нового белка гапонина из клеток линии HL-60 // Биоорг. химия. — 2007. — Т. 33, вып. 6. — С. 653-656.
2. Rual J.-F., Venkatesan K, Hao T., Hirozane-Kishikawa T, Dricot A, Li N, Berriz G.F. [et al.]. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network // Nature. — 2005. — V. 437. — P. 1173-1178.
3. Gil M.P., Salomon R., Louten J., Biron C.A. Modulation of STAT1 protein levels, a mechanism shaping CD8 T cell responses in vivo // Blood. — 2006. — V. 107. — P. 987-993.
4. Reich N.C. STAT dynamics // Cytokine & Growth Factor Reviews. — 2007. — V. 18. -P. 511-518.
5. Seibel N.M., Eljouni J, Nalaskowski M.M., Hampe W. Nuclear localization of enhanced green fluorescent protein homomultimers // Anal. Biochem. — 2007. — V. 368(1). — P. 95-99.
6. Ju H, Jove R. The stats of cancer: new molecular targets come of age // Nature rev., Cancer. — 2004. — V. 4. — P. 97-105.
7. Sirover M.A. New insights into an old protein: the functional diversity of mammalian glyceraldehyde-3-phosphate dehydrohenase // Biochimica et Biophysica Acta. — 1999. — V. 1432. — P. 159-184.
8. Hara R.M., Snyder S.H. Nitric Oxid-GAPDH-Siah: A novel cell death cascade // Cellular and molecular neurobiology. — 2006. — V. 26. — P. 527--538.
9. Mazzolla J.L., Sirover M.A. Subcellular localization of human glyceraldehydes-3-phosphate dehydrohenase is independent of its glycolitic function // Biochimica et Biophysica Acta. — 2003. — V. 1622. — P. 50-56.
10. Спирин А.С. Принципы функционирования рибосом // Соросовский образовательный журнал. — 1999. — Вып. 4. — С. 2-9.
11. Jin C, Ding P., Wang Y, Ma D. Regulation of EGF receptor signaling by the MARVEL domain-containing protein CKLFSF8 // FEBS Letters. — 2005. — V. 579(28). — P. 6375--6382.
Поступила в редакцию 15.01.2009.
