CC BY
217
УДК612.111.11/13:542.2
НОВЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИКИРОВАННОГО ГЕМОГЛОБИНА
В.А. Королев
Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского
ДП «Клинический санаторий Мисхор» ЗАО Укрпрофздравница Крымское республиканское учреждение «Территориальный центр экстренной медицинской помощи службы медицины катастроф»
Для лучшего понимания клинико-диагностического значения гликированного гемоглобина нами разработан экспериментальный метод, который включает изоэлектрическое фокусирование с последующей фотоколориметрией (метод ИЭФ+ФК). Проанализированы основные критерии аналитической надежности ИЭФ+ФК. Метод апробирован на 157 больных, из которых 76 больных сахарным диабетом (СД) и 81 больной с отсутствием явного СД.
Ключевые слова: гемоглобин, методы определения.
For the best comprehension of the clinicodiagnostic value of glycated hemoglobin we developed an experimental method which includes isoelectric focusing with subsequent photocolorimetry (the IEF+PhC method). The basic criteria of analytical reliability of the IEF+PhC method were analysed. The method was tested on 157 patients, from which 76 had diabetes mellitis (DM) and 81 patients had no obvious DM.
Key words: hemoglobin, methods of determining.
Введение
Различают более 30 апробованных методов для определения гликозилированного гемоглобина (НЬА1с). Они начинаются с малоточных лабораторных систем или ручных микроколоночных методов до высокоточных автоматизированных систем для определения. Существующие способы определения НЬА1с могут быть разделены на три группы [12, 17]. Первая группа включает методы, основанные на различии электрического заряда молекул гликозилированного и негликозилированного гемоглобина. Например, катион-обменная хроматография (КОХ) и хроматография под высоким давлением [27], электрофорез в агаровом геле [21], изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) [23]. Вторая группа включает приемы, основанные на структурном различии между гликированны-ми и негликированными компонентами. Например, бо-ронат аффинная хроматография [19] и иммунологический способ [9]. Третья группа включает методы, которые основаны на химической рективности НЬА1с. Это фотоколориметрические методы [1].
Несмотря на многообразие способов определения НЬА1с, данный показатель все еще остается «экзотическим». Уровень НЬА1с регулярно определяют менее 1% больных сахарным диабетом (СД) [5]. Для определения уровня в настоящее время поставлен вопрос о разработке альтернативных, принципиально новых методов определения НЬА1с [26]. В последние годы появились данные, свидетельствующие о том, что показатель гликози-лированного гемоглобина понимается не должным образом [24].
Цель работы. Для лучшего понимания клинико-диагностического значения гликозилированного гемоглобина нами создан экспериментальный метод, включающий ИЭФ с последующей фотоколориметрией (метод ИЭФ+ФК).
Материалы и методы
Обследовано 157 больных, среди которых 76 больных сахарным диабетом (СД) и 81 больной с различными заболеваниями, которые составляют варианты метаболи-
Таблица - Условные сокращения, часто встречаемые в тексте статьи
HbA1c гликозилированный гемоглобин
КОХ катион-обменная хроматография
ИЭФ изоэлектрическое фокусирование
СД сахарный диабет
ИЭФ метод изоэлектрического фокусирования с последующей фотоколориметрией
ЧДА чистый для анализов
ХЧ химически чистый
ТБК тиобарбитуровая кислота
ТХУ трихлоруксусная кислота
E экстинкция при определенной длине волны
Гл уровень гликемии
пре Гл препрандиальная гликемия
Гл 12 гликемия в 12 часов
Гл 17 гликемия в 17 часов
Гл 21 гликемия в 21 час
СГ глюкозурия за сутки
СП протеинурия за сутки
ИМТ индекс массы тела
ОХС общий холестерин сыворотки
ДЗ длительность заболевания
ВБ возраст больных
М молярная концентрация
pI изоэлектрическая точка
ческого синдрома и влияют на СД [3]. Нормальные значения уровня HbA1c были получены из National Glycohemoglobin Standardization Program [20].
Сущность метода «ИЭФ+ФК» для определения уровня HbA1c заключается в следующем. Сначала готовят градиентные растворы. Для этого создают исходный трис-боратный буфер - к 1 литру дистиллированной воды добавляют 0,01 М борную кислоту (620 мг) и вносят трис (C4H11O3N) до рН 7,8-8,0 (примерно 500-700мг). Затем готовят три раствора: раствор N1 - 4 мг рибофлавина и 0,04 мл тетраэтил-метилендиамина (темеда) добавляют к 100 мл исходного буфера; раствор N2 - 0,24 мл темеда и 24 мл раствора N1 добавляют к 600 мл исходного буфера, измеряют рН; раствор N3 - 45 мл раствора N2 добавляют к 55 мл глицерина (ЧДА или ХЧ), тщательно перемеши-вают,измеряют рН. Значения рН растворов N 2 и N 3 являются конечными точками графика, по которым определяли значения рН двух градиентных растворов для ИЭФ
6,9-7,5, соответствующих изоточке HbA1c(pI при ИЭФ в борат-полиольной системе 7,2-7,3). Эти два градиентных раствора готовят путём титрования раствора N 3 в раствор N 2, соответственно, в двух тёмных сосудах (по 50 -100 мл). К градиентным растворам добавляют акрила-мид и метиленбисакриламид, соответственно, 68 и 2,03 мг на 1 мл раствора. Тёмные сосуды с градиентными растворами подписывают (номер, рН, дата приготовления) и хранят при температуре +1 +4ОС в холодной камере. Перед исследованием берут капилляры - стандартные (диаметр 1 мм, длина 60 мм). Заполняют капилляры сначала градиентным раствором с более щелочным рН, затем с более кислым рН. В начале капилляра оставляют свободное место (примерно 1/5 часть капилляра) для внесения исследуемого материала. Осуществляют фотополимеризацию под лучами дневного света (не менее 5-6 часов) до образования гелей. Капилляры с полиакри-ламидным гелем вставляют в аппарат для электрофореза (использован аппарат ПЭФ-1 с резиновыми пробками с заранее проколотыми иглой отверстиями). Перед исследованием у пациента берут цельную кровь и готовят ге-молизаты любым способом. Гемолизаты вносят в капилляры при помощи шприца на 2,0 или инсулинового, вставляют капилляры в аппарат для электрофореза, последний заполняют трис-боратным буфером, проводят ИЭФ не менее 14 часов при напряжении не менее 20 в/см и температуре +1 +4 С ( в холодильной камере). После проведения ИЭФ каждый капилляр извлекают из аппарата и проводят гомогенизацию с 2 мл дистиллированной воды. Помещают 2 мл гомогената в пробирку с притёртой пробкой, приливают 1 мл 0,6 М щавелевой кислоты, перемешивают встряхиванием. Пробы помещают на 1 час на кипящую водяную баню. Охлаждают до комнатной температуры на воздухе. Приливают 1 мл 40% трихлорук-сусной кислоты (ТХУ), перемешивают встряхиванием. Через 10 минут центрифугируют в течение 10 минут при 3000 об/мин. К 3 мл центрифугата приливают 0,75 мл 0,05 мл ТБК, перемешивают встряхиванием. Инкубируют 40 минут при 40 градусах С на водяной бане. Колориметри-руют на спектрофотометре при длине волны (X) 443 нм против холостой пробы. Приготовление холостой пробы: 2 мл Н2О + 1 мл 0,3 н щавелевой кислоты + 0,75 мл 0,05 М ТБК - инкубировать вместе с опытными пробами. Расчёт проводят по формуле:
E
—^ * 3,3 = %HbA1c 0,029
где E443 значение оптической плотности исследуемой пробы; 0,029 - значение оптической плотности, соответствующее 1% гликозилированного гемоглобина, 3,3 - коэффициент, учитывающий, что гидролиз неполный и осуществляется на 30%. Использовали международную классификацию болезней 10 пересмотра, классификацию манифестного (явного) СД [2] и цели лечения этого заболевания, предложеннные European Diabetes Policy Group в1998-1999 [13, 14].
Результаты
Для оценки аналитической надежности метода ИЭФ+ФК изучали воспроизводимость, чувствительность метода, специфичность его, а также сравнивали значе-
Таблица 1 - Воспроизводимость метода ИЭФ+ФК в различных сериях
Показатель Примеры
1 2 3 4 5
HbA1c, % 4,32 3,18 2,62 4,89 2,39
4,55 3,64 3,40 4,89 2,50
4,55 3,86 3,41 5,12 2,61
4,77 3,86 3,76 5,12 2,61
4,89 3,98 3,98 6,14 2,84
5,00 4,43 4,10 6,26 3,07
5,35 4,55 4,20 7,39 3,53
5,35 5,00 4,67 7,85
4,67 8,31
n 8 8 9 9 7
Хср 4,847 4,063 3,868 6,219 2,793
Ха 4,860 4,098 3,917 6,346 2,817
а 0,376 0,573 0,658 1,340 0,395
Sx 0,133 0,203 0,219 0,447 0,149
V% 7,763 14,103 17,006 21,543 14,152
Примечание: п -арифметическое введенных введенных показателей, а стандартная ошибка средней арифметической, V/ - коэффициент вариации.
количество показателей, Хср - среднее показателей, Хq - среднее геометрическое - среднее квадратическое отклонение,
Sx
ния НЬА1с, полученных нашим способом, с методом КОХ. Внутрисерийная воспроизводимость на недиабетическом уровне составила значения, представленные в таблице 1. Чувствительность метода ИЭФ+ФК проверена исследованием жидкостей с различной концентрацией вещества. Для этого мы провели изоэлектрофокуси-рование физиологического раствора и 50% раствора альбумина. Представляем экстинкции Еоп при Х=443нм физиологического раствора, отсортированного в порядке возрастания 0,09 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,11 0,11 0,11 0,11 0,11 0,12 0,12 0,13. А чувствительность физиологического раствора можно представить как Хср=0,106±0,0001. Чувствительность 50% альбумина существенно не отличалась от таковой физиологического раствора. Еоп при 1= 443 нм, отсортированные в порядке возрастания 0,09 0,09, 0,09, 0,09 0,09 0,09 0,09 0,09 009 0,10; 0,10; 0,10 0,10 0,11 0,13 0,13 0,14 0,16, чувствительность Хср=0,105±0,00048. При сравнении метода катион-обменной хроматографии (КОХ) с ИЭФ обнаружено, что эти два метода отличаются друг от друга (таблица 2). Специ-
Таблица 2 - Сравнение уровней НЬА1с, определенного методами КОХ и ИЭФ+ФК (введенные значения, их разности и ранги, отсортированы в порядке возрастания абсолютных величин разностей)
№ п/п X Y X-Y Ранг
1 2.02 1.88 0.14 1.00
2 7.50 8.30 -0.80 2.00
3 7.60 6.37 1.23 3.00
4 6.90 8.19 -1.29 4.00
5 9.13 10.89 -1.76 5.00
6 8.80 11.03 -2.23 6.00
7 6.30 9.10 -2.80 7.00
8 9.30 4.67 4.63 8.00
9 11.80 6.94 4.86 9.00
10 12.00 5.23 6.77 10.00
11 10.50 3.18 7.32 11.00
12 18.10 5.57 12.53 12.00
13 24.96 7.74 17.22 13.00
14 28.30 9.78 18.52 14.00
15 27,50 8,88 18,62 15,00
Примечание: критерий Т = -3.067; так как абсолютная величина Т больше 1,96, то имеются различия этих двух связанных выборок с уровнем значимости Р<0,05. X - значения уровня НЬА1с (%) при использовании метода КОХ, Y - значения уровня НЬА1с при использовании метода ИЭФ.
Рисунок 2 - Гистограмма уровня НЬА1су больных СД
Рисунок 1 - Электрофоретическая миграция (слева -направо) опытных гемолизатов (1,2), сфокусированного
гемолизата (3, 5), стандарта НЬА1с (по заряду) («Бое^^гг mannheim») серии 3с(4). Вверху «-», внизу «+»
фичность изучаемого метода проанализирована нами следующим образом. Для этого в плоском полиакрила-мидном геле изучили миграцию опытных гемолизатов, сфокусированных гемолизатов при различных типах СД и стандарта НЬА1с («Воеп^ег шаппИет»). Опытные ге-молизаты были представлены довольно выраженным фоном, а фракция НЬА1с в относительно небольшом размере мигрировала до уровня стандарта. И только сфокусированные гемолизаты имели небольшой фон, а фракция НЬА1 также мигрировала до уровня стандарта (рис. 1). с
Следует отметить, что уровень НЬА1с у больных СД находился в пределах от 5,9 до 44 % (таблица 3), что свидетельствовало о существенных сдвигах в компенсаторных возможностях обследованных больных СД. Хотя средний уровень НЬА1с был в пределах 13,0% (рис. 2), однако при анализе коробчатой диаграммы существенное количество значений данного показателя было удалено либо на 1/3 (помечено кружками), либо 2/3 (помечено звездочками) длины прямоугольника (то есть средних значений уровня НЬА1с) (рис. 3). У этих же больных отмечено повышение уровней других контрольных параметров: гликемии в течение суток (Гл), глюкозурии за сутки (СГ), индекса массы тела (ИМТ), общего холестерина сыво-
Таблица 3 - Представление уровня НЬА1с у больных СД
НЬА1с
Рисунок 3 - Блочная диаграмма уровня НЬА1с
Таблица 4 - Уровни НЬА1с у больных стационара и курорта с отсутствием явного СД
Стационар, все взрослые
Здоровые Больные:
кардиоло- нефрологи- гастроэнтеро- отделения
гического ческого логического интенсивной
отделения отделения отделения терапии
6,48 7,41 8,19 12,86 3,18
6,82 19,34 7,05 13,88 17,07
6,60 19,69 5,46 3,98 8,76
8,30 5,58 7,62 3,98 6,71
5,91 11,83 5,92 13,09 2,96
1,47 9,2 7,85 11,95 11,26
10,1 8,86 15,93 8,87
9,22 5,69 10,10
19,34 6,19 12,28
13,2 5,00 7,62
13,54 13,10
5,58
14,45
Курорт, взрослые
Здоровые Больные:
гипертониче- хроническими нейро-циркуляторной
ской болезнью бронхитами дистонией
7,06; 12,18; 6,14; 12,18;
7,70; 8,42; 6,37; 7,57;
7,16; 6,49; 11,38; 8,53;
7,74; 10,80; 9,10; 13,66;
8,82; 5,12; 8,53; 8,76; 8,53;
6,94. 7,17; 3,41; 6,60. 11,38.
6,37; 19,34
13,20; 8,08
9,44; 11,38
18,21; 14,79.
Таблица 5 - Представление основных параметров у обследованных больных СД
Таблица 6 - Уровень гликированного гемоглобина у детей с ювенильным ревматоидным артритом
95% доверитель- Мини- Макси- Средняя Ошибка
Параметр ный интервал маль- маль- арифме- средней
нижння верхняя ное ное тическая арифме-
граница граница тической
НЬА1с 11,07 14,90 5,9 44,4 12,99 0,96
(%)
Пре Гл 9,82 11,52 2,6 27,4 10,66 0,43
(ммл)
Гл 12ч 10,86 14,36 2,5 35,6 11,78 0,85
(ммл)
Гл 17ч 4,4 20,0 2,0 26,4 10,87 0,80
(ммл)
Гл 21ч 2,6 21,5 2,5 27,8 10,37 0,95
(ммл)
СГ 1,15 1,90 0,1 7,0 1,66 0,18
(г/л)
СП 0,48 0,93 0,02 4,12 0,67 0,11
(г/л)
ОБС 67,95 72,79 55,5 85,0 68,84 1,18
(г/л)
ИМТ 17,6 38,8 16,18 40,45 25,76 0,95
(кг/м2)
ДЗ 0,1 34,0 0 35,0 9,41 1,54
(годы)
Возраст 18,0 75,0 12,0 77,0 43,73 3,05
больных
(годы)
Больной Уровень гликированного гемоглобина (НЬА1с%)
1 5,69
2 10,81
3 8,65
4 5,69
5 6,83
6 11,38
7 6,69
8 5,12
9 5,92
10 3,41
11 6,94
12 7,97
Рисунок 4 - Области применения НЬА1с (наличие штриховки - корреляционный анализ, отсутствие штриховки - регрессионный анализ):1. Болезни печени (взаимоотношения НЬА1 (%) - СА (%); НЬА1 (%)- ЩФ (ед/л)); 2. Юношеский артрит (взаимоотношения: а1 -гл(%) - НЬАс(%0); 2. а2-гл(%) - НЬА1с (%); 3^-гл(%) - НЬА1с(%); 4.С-рб - НЬА1с(%); 5. гаптоглобин- НьА1с(%)); 3. ИБС и болезни, характеризующиеся повышенным кровяным давлением (взаимоотношения: 1. ПТИ (%)-НЬА1 (%); 2.
НЬА1 (%)-ФВ (%); 3. ОХС (ммоль/л) - НЬА1 (%)); 4. Сахарный диабепг (взаимоотношения: 1. СГ (г) - НЬА1с(%); 2. ОХС(ммоль/л) - НЬА(%); 3. ИМТ(кг/м2) -НЬА1с(%); 4. длительность СД (годы) - НЬА1с(%)). 5.ХГН и ТИН (взаимоотношения:1.
НЬА} (%) - СП (г/л); 2. Длительность ХПН-НЬА. (%)); 6.Критические состояния (взаимоотношения: 1.КК(моль/л) - НЬА (%); 2. №+ - НЬА1 (%); 3. Фн (г/л) - НЬА1 (%);
4. СП(г/л) - НЬА1с/%); 5. ССЭ- НЬА1(}%)) с
3 9 _
ротки (ОХС), длительности заболевания (ДЗ) (таблица 4).У обследованных больных СД наблюдалась четко очерченная зависимость между уровнями СГ, протеинурии за сутки (СП), ОХС, ИМТ, ДЗ и НЬА1с .
Из обследуемых больных (обоего пола) с отсутствием явного СД мы выделили 69 взрослых и 12 детей. Больные находились на лечении в стационаре (41 человек) - в кардиологическом, гастроэнтерологическом и нефроло-гическом отделениях, а также в отделении интенсивной терапии. Также обследованы отдыхающие курорта (35 человек), среди которых 12 детей с ревматоидной патологией. Цифры НЬА1с у обследуемых с различными заболеваниями были в болыпинстве случаев выше, чем у здоровых доноров (таблица 5). Особенно существенно отличались уровни НЬА1с у больных кардиологического, гастроэнтерологического отделений и отделения интенсивной терапии. На курорте заметное повышение содержания этого показателя обнаружено у больных с кар-диальной и легочной патологией. При этом обнаружен параллелизм между основными биохимическими показателями и уровнем НЬА1с. СД представляет собой в отношении определения уровня НЬА1с не единственное заболевание, а лишь одно из патологических состояний, наряду с сердечнососудистыми заболеваниями, патологией печени, ревматоидной патологией, в экстремальных ситуациях как в стационаре, так и на курорте (рис. 4).
Обсуждение
Вновь разработанный метод определения НЬА1с имел существенные преимущества как перед стандартным ИЭФ, так и по сравнению с фотоколориметрическим способом. Во-первых, за счёт использования микрообъёма в 8,3 раза уменьшается количество реактивов по сравнению с таковым для ИЭФ. Во-вторых, уменьшается количество градиентных растворов с 6 в методе предшественнике до 2 в новом методе. В предлагаемом способе, как было уже отмечено, достаточно иметь только те градиенты, которые соответствуют изоточке НЬА1с, а в классическом методе необходимо чёткое отделение фракции НЬА1с от других фракций гемоглобина для проведения денситометрии, что возможно только при большом количестве градиентов (минимально 6). В-третьих, укорачивается время общего проведения опыта (до 1 сут). В-чётвертых, предлагаемый способ может быть использован практически в любой клинико-биохимической лаборатории, так как не требует специального оборудования, а классический метод ИЭФ - только в специализированных лабораториях, в которых есть денситометр. Нами установлены преимущества капиллярного метода определения НЬА1с по сравнению с фотоколориметрическим способом. Важным преимуществом первого метода перед вторыми является отсутствие необходимости измерения оптической плотности фона каждой пробы, так как подобраны градиенты, в которых происходит ИЭФ НЬА1с а остальные основные белки крови, изоточ-ка которых иная, переходят в раствор. Весьма важным и существенным фактом является то, что если предварительно перед фотоколориметрией проводить выделение фракции НЬА1с, то уровень этого показателя станет в 3 раза меньше, чем при фотоколориметрии без фокусировки. Причиной сниженого уровня НЬА1с является неполный гидролиз, который проходит на 30 % [4]. Если мы используем неочищенный гемолизат от других белков (не проводим ИЭФ), то фон других протеинов создаёт «ложный уровень НЬА1с».
Несмотря на то, что референтным методом определения НЬА1с , по мнению Исследовательской группы по испытанию диабетического контроля и осложнений, считается [10] высокоэффективная жидкостная катион-обменная хроматография под высоким давлением, ряд исследователей полагают наиболее специфическими методами определения минорной фракции А1с электрофо-ретические приемы, особенно ИЭФ [6]. Уникальностью ИЭФ в отношении гликозилированного гемоглобина считается то, что его основная фракция А1с четко отделяется от основной фракции НЬА, тогда как другие минорные фракции НЬА1а, НЬА1Ь не отделяются [23]. Однако использование ИЭФ в натуральных рН-градиентах (амфолитах) затруднительно из-за того, что при использовании их расстояние между фракциями НЬА и НЬА1с настолько незначительно (до 1 мм), что требуется применение микроденситометра. Этот недостаток нивелируется при ИЭФ в искусственных рН-градиентах, при котором более четкое отделение искомой фракции. Считается, что ИЭФ в искусственных рН-градиентах (в частности, в борат-по-лиольной системе) является наиболее тонким методом разделения молекул [7]. Специфичность определения
НЬА1с позволяет считать его референтным по отношению к катион-обменной хроматографии и применять для повышения точности ее [25]. Считается, что коэффициент вариации классических методов определения НЬА1с не должен превышать 6 % [8]. Однако при неопределенном числе вариаций коэффициент может повышаться до 17%. Согласно литературным данным, чем ниже коэффициент вариации, тем точнее метод определения НЬА1с (для ионообменной хроматографии под высоким давлением коэффициенты вариации могут достигать 2%). Однако наши исследования показали, что коэффициенты вариации как внутрисерийной, так и межсерийной воспроизводимости для гликогемоглобина могут варьировать от 6 до 20% . Точность определения НЬА1с, на наш взгляд, должна в первую очередь определяться не столько правильностью, воспроизводимостью, чувствительностью, сколько специфичностью определения искомой фракции(это может отличать НЬА1с от других параметров). Мониторинг гликемического статуса, как обеспечение заботы за больными СД и здоровыми, в настоящее время рассматривается краеугольным камнем проблемы диабета. Результаты мониторинга используются для определения степени эффективности терапии, регулирования диеты, медикаментозных назначений и физических упражнений как ордер возможного достижения лучшего гликемического контроля [11]. Значение мониторинга гликемии особо важно для предупреждения сосудистых осложнений. Появление гипергликемии, СД связано с развитием кардиальной патологии, заболеваниями печени, ревматическими заболеваниями [22]. Будучи прогностическим показателем у больных СД, уровень НЬА1с остается таким же предиктором обменных нарушений (в первую очередь углеводного обмена) при других патологических состояниях внутренних органов. Имеются данные о том, что НЬА1с у диабетических и недиабетических субъектов является маркером критических состояний и летального исхода [18]. То есть определение данного показателя может иметь значение для обнаружения именно риска при угрожающих состояниях. Изучение НЬА1с в реанимационной практике представляется актуальным. Ведь возможное отражение НЬА1с окси-дантного стресса, что особенно важно при сепсисе, доказывает прогностическое значение этого белка. Доказано, что в отсутствии СД уровень НЬА1с ассоциируется с ОХС, индексом массы тела [15]. В наших исследованиях обнаружена также взаимосвязь между НЬА1с и некоторыми лабораторными и инструментальными данными у больных с отсуствием явного СД.
Вывод
Капиллярный метод определения НЬА1с, включающий ИЭФ НЬА1с в узком градиенте рН, соответствующем р1 НЬА1с, с последующей фотоколориметрией с 2-ТБК после неполного гидролиза со щавелевой кислотой, является альтернативным способом определения НЬА1с, так как значения данного параметра, определенного вышеуказанным приемом, отличаются при сравнении со значениями НЬА1с, определенного методом КОХ. А коэффициенты вариации при определении внутрисерий-ной и межсерийной воспроизводимости метода ИЭФ+ФК существенно отличаются от общепринятых
норм. В то же время уровень HbA1c является важным прогностическим показателем как на диабетическом, так и недиабетическом уровнях.
Литература
1. Викторова Л.Н., Городецкий В.К.Колориметрический метод определения неферментативно гликозилированного альбумина и гемоглобина //Лаб.дело.-1990.-Ы5.- C.15-18.
2. Ефимов А.С., Зуева Н.А., Тронько Н.Д., Скробонская Н.А. Малая энциклопедия врача-эндокринолога.-К.: Мед книга,2007.-360с.
3. Корнеева О.Н. Клинические варианты метаболического синдрома. Дисс. ... канд.мед.наук.-М.2007.
4. Лукичева Т. И. Гликозилированный гемоглобин. Методы определения: Обзор литературы // МРЖ. - 1988. - № 11. - C. 1619.
5. Пархоменко А.Д. Клинико-экономическая эффективность внедрения структурированной программы обучения пациентов с сахарным диабетом 2 типа. Дисс.канд.наук. Москва.- 2000.
6. Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование: Теория, методы и применение: Пер.с англ.-М.: Мир, 1986.- 398с.
7. Троицкий Г.В., Ажицкий Г.В. Изоэлектрическое фокусирование белков в самоорганизующихся и искусственных рН-гра-диентах.-Киев:Наукова думка.-1984.-220с.
8. Управление качеством клинических лабораторных исследований / Под ред.В.В.Меньшикова.-М., 2000.
9. Boz M., Gerard P., Scheen A. et al. Rapid determination by immunoassay of glycosylated hemoglobin in capillary blood compared to an affinity method for boronate and ion capturing on venous blood // Ann. Biol. Clin.- 1997.-V.55(2).-P. 183-144.
10. Diabetes Control and Complications Research Group// N. Engl. J. Med.- 1993.-V.329.-P.977-986.
11. Goldstein D.E., Little R.R., Lorenz R.A. et al.Tests of glycemia in diabetes //Diabetes care.-2004.- V.27.-P.1763-1773.
12. Goldstein D., Little R., Wiedmeyer H. et al.Glycated hemoglobin: methodologies and clinical applications // Clin. Chem.-1986.-V.32.-B64-B70.
13. Guidelines for Diabetes Care. A desktop Guide to type 2 Diabetes Mellitus. European Diabetes Policy Group.1998-1999.
14. Guidelines for Diabetes Care. A Deskto Guide to Type 1 Diabetes Mellitus. EDPG, 1998.
15. Herold D., Boyd J., Bruns D. et al. //Ann. Clin.Laboratory Science.-1983.-V. 13.-P.482-488.
16. Iso H., Kiyama M., Naito Y. et al The relation of body fat distribution and body mass with haemoglobin A1c , blood pressure and blood lipids in urban Japanese men//Int.J.Epid.-1991.-Vol.20.-P. 8894.
17. Little R.R., Goldstein D.E. Measurements of glycated haemoglobin and other circulating glycated proteins.In: Mogensen CE ,Standl E (eds). Research methodologies in human diabetes. Part I, 1994.-P.299-317.
18. Menon V, Greene T., Pereira A.A., Wang X., Beck G.J., KusekJ.W., Collins A. J., Levey A.S., Sarnak M.J. Glycosylated Hemoglobin and Mortality in Patients with Nondia-betic Chronic Kidney Disease // J. Am. Soc. Nephrol. - 2005. - Vol. 16. - P. 34113417.
19. Middle F.A. et al.Separation of glycosylated Haemoglobins using immobilized phenylboronic Acid//Biochem. J.-1983.- Vol.209.-P.771-779.
20. National Glycohemoglobin Standardization Program (web site) http://www.missuri.edu/diabetes/ngsp.html.
21. North M., Piffaut M., Blickle J., Cottreau P. Assay of glycosylated hemoglobin by agar gel electrophoresis in an acid pH. Value of the determination of the stable fraction in clinical biology// Pathol. Biol.- 1984.-V. 32.-P.779-784.
22. Selvin E., Coresh J., Golden S.H. et al. Glycemic control and coronary heart disease risk in persons with and without diabetes: the atherosclerosis risk in communities study // Diabetes Care.-2005.-V.28.-P. 1965-1973.
23. Spicer K.M., Allen R.C., Buse M.G.Asimplified assay of hemoglobin A1 c in diabetic patients by use of isoelectric focussing and quantitative microdensitometry // Diabetes.-1978.-V.27,N4.-P.384-388.
24. Skeie S., Thue G., Sandberg S.Interpretation of hemoglobin A1c (HbA1c) values among diabetic patients: implications for quality specifications for HbA1c // Scand.J.Clin.Lab.Invest- 2000.-V.60.-N.5.-P. 349-356. c
25. Vidal P., Dechert T., Hansen B., Welinder B.S.High-performance liqid chromatofocusing and column affinity chromatography of in vitro C 1 4-glycated human serum chromatography of in vitro C-glycated human serum albumin // J.Chrom.-1989.-V.476.-P. 467-475.
26. Vincenzi Jager A., Franco Maggi Tavares M. Novel approach for the analysis of glycated hemoglobin using capillary focusing with chemical mobilization// J.Chromatogr.- 2003.-V. 785(2).-285-292.
27. Willis A., Tobitt C., Jones S. et al.Measing glycated hemoglobin // BMJ.- 1992.-V.305.-P. 1020.
Поступила 15.11.2010
