CC BY
41
БРЮ
f ЕПАРАТЫ
НОВЫЙ ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ АЛЛЕРГЕН ИЗ ПЫЛЬЦЫ ЗОЛОТАРНИКА КАНАДСКОГО
Бержец В.М., Пронькина О.В., Хлгатян С.В., Петрова Н.С.
ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН, Москва
г ч
Впервые в РФ разработана технология получения регионального диагностического
аллергена из растения золотарник канадский. В качестве сырья использовали пыльцу и
соцветия золотарника канадского. Согласно проведенным исследованиям показано, что
полученные аллергены по своим физико-химическим и иммунобиологическим свойствам
соответствуют основным требованиям, предъявляемым к стандартизации диагностических
аллергенов. Приготовленные препараты стабильны, безопасны и специфически активны.
Выявлена, низкая частота встречаемости у пациентов сенсибилизации к соцветиям
золотарника. Препарат аллергена из пыльцы золотарника канадского обладает
выраженными аллергенными и сенсибилизирующими свойствами. Новый препарат
I аллергена из золотарника канадского позволит расширить панель пыльцевых аллергенов для
диагностики пыльцевой сенсибилизации.
Ключевые слова: диагностические аллергены, золотарник канадский, поллинозы, сенсибилизация, аллергия
у У
По результатам эпидемиологических исследований в структуре поллинозов преобладают клинические формы, обусловленные поливалентной сенсибилизацией. Чаще всего обнаруживается сенсибилизация к злаковым травам, пыльце деревьев и к растениям семейства сложноцветных [1,3,8].
В последнее время в средней полосе РФ отмечают высокую сенсибилизацию к растению семейства сложноцветных — золотарнику канадскому (Solidago Canadiens — ЗК). Однако данные о наличии аллергенных свойств у ЗК довольно противоречивы. По-видимому, это связано с тем, что обычно причиной пыльцевой аллергии являются ветроопыляемые растения (анемо-фильные), способные вызывать респираторные аллер-гозы, а ЗК относится к насекомоопыляемым (энтомо-фильное) растениям [1]. Известно, что пыльца ЗК имеет склонность к склеиванию и образованию микрокомочков, способных вызывать контактные аллергические реакции. Следовательно, высокая сенсибилизирующая активность данного растения может быть связана с аллергенными свойствами его пыльцы.
В Европейских странах, в частности в Чехии, крупнейший производитель аллергенов Sevapharma, выпускает наборы для диагностики и лечения аллергозов, вызванных ЗК. Эффективность данных препаратов при проведении специфической иммунотерапии доказана нашими исследователями [4]. Помимо Sevapharma, аллерген из ЗК содержит и диагностические панели известных производителей Allergopharma (Германия).
Однако в нашей стране диагностического препарата аллергена из пыльцы ЗК не производится.
В связи с вышеизложенным, нами была поставлена цель разработать технологию получения диагнос-
тических аллергенов из соцветий и пыльцы ЗК и изучить их физико-химические и иммунобиологические свойства.
Материалы и методы
Нами были приготовлены экстракты аллергенов из соцветий и пыльцы ЗК по методу Coca [6]. В полученных препаратах аллергенов определяли количественное содержание белка в единицах белкового азота (PNU) по методу Несслера [6].
Анализ фракционного состава аллергенных экстрактов, полученных из соцветий и пыльцы ЗК, проводили методом вертикального электрофореза в 15% полиак-риламидном геле.
Сенсибилизирующие свойства приготовленных препаратов аллергенов изучали в опытах анафилаксии на морских свинках в соответствии с методическими указаниями к первичной экспериментально-клинической апробации новых форм аллергенов [7]. Результаты регистрировали путем вычисления анафилактического индекса по формуле Вейгла.
Для оценки специфической активности — аллергенных и иммуногенных свойств экстрактов из ЗК — проводили тест непрямой дегрануляции тучных клеток крыс (НДТК) [6], иммуноферментный анализ (ИФА) [2] и иммуноблотинг [5].
Для выявления аллергенных свойств у полученных препаратов (аллергенные экстракты из соцветий и пыльцы ЗК) использовали метод ИФА и НДТК. Методом ИФА определяли специфические lgE-антитела в сыворотках больных с пыльцевой сенсибилизацией. Иссле-
£ Март-июнь 2009 г.
довали 60 сывороток больных, страдающих повышенной чувствительностью к пыльце сложноцветных растений, сенсибилизация к которым была подтверждена скарификационными пробами. Уровень специфических lgE-антител оценивали в условных единицах и классифицировали по классам от 0 до 4. В тесте НДТК исследовали 20 отобранных сывороток пациентов с повышенным уровнем специфических lgE-антител к ЗК канадскому и водно-солевые экстракты аллергенов из соцветий и пыльцы ЗК. Контролем служила спонтанная дегрануляция тучных клеток крыс.
Методом дот-блота оценивали антигенные свойства полученных аллергенов [5]. Экстракты из пыльцы и соцветий ЗК, растворенные в жидкости Эванса-Кока, наносили на нитроцеллюлозную мембрану в объеме 1 мкл (концентрация белка в препарате 1 мкг/мкл). В качестве негативного контроля использовали экстракты из бытовых аллергенов в той же концентрации, бычий сывороточный альбумин и буфер Эванса-Кока. В качестве положительных контролей наносили по 1 мкл суммарные IgG человека и кроличьи IgG против иммуноглобулинов человека (в концентрации 50 мкг/мл в смеси гли-церин/Трис буфер 1/1; состав Трис-буфера: 20 тМ Трис-HCI, 150 mM NaCI, рН 7,5). Приготовленные мини-эрреи отмывали 2 раза в ТБТ буфере (20 тМ Трис-HCI, 150 тМ NaCI, рН 7,5, 0,06% Твин 20) и инкубировали 1 ч в растворе 5%-го молока. Затем эрреи инкубировали с сыворотками (разведение 1:300) больных с пыльцевой сенсибилизацией в течение ночи на качалке при 4±1 °С. После трехкратной отмывки мембран в ТБТ-буфере, эрреи инкубировали 1 ч при комнатной температуре с вторичными антителами, меченными щелочной фосфатазой (Jackson Immunoresearch). Для проявки эрреев использовали субстраты NBT (нитро-тетразолий синий, «Диа-М») и BCIP (5-бромо-4-хло-ро-3-индолил фосфат, Sigma). Интенсивность окрашивания эрреев оценивали денситометрически в абсолютных значениях с помощью программы ImageQuant. Результаты обрабатывали статистически, используя программу Microsoft Excel.
Результаты и обсуждение
Современные требования, предъявляемые к разработке региональных пыльцевых аллергенов, затрагивают вопросы распространенности данного вида на конкретной территории, концентрацию пыльцы в воздухе в период цветения, а также наличие аллергенных
свойств у растения. Если пыльца не принадлежит к ветроопыляемым растениям, то она должна продуцироваться в достаточно больших количествах, способных вызвать сенсибилизацию организма. Что касается ЗК канадского, то по данным одних авторов, сенсибилизация к данному виду встречается редко, что, вероятно, связано со склонностью пыльцы ЗК к склеиванию и образованию комочков [11]. По другим источникам, различные виды ЗК внесены в списки растений наиболее часто вызывающих поллиноз [10, 13]. Невозможность исследовать эту проблему в связи с отсутствием отечественного диагностического препарата аллергена ЗК послужила основанием для разработки технологии приготовления данного аллергена и изучения его свойств.
При разработке технологии получения препаратов аллергенов из ЗК, наиболее важным был этап подбора соотношения сырья и экстрагирующей жидкости. Экспериментально показано, что при приготовлении препаратов из соцветий и пыльцы ЗК оптимальным является соотношение 3:100 г/мл (сырье и экстрагирующая жидкость, соответственно). Экстракцию проводили в течение 3 дн. при температуре 4-8 °С, pH 7,0-7,2. Содержание белкового азота в аллергенах из соцветий золотарника составило 6700 PNU, а в препаратах аллергенов из пыльцы — 8400 PNU.
Безвредность полученных препаратов проверяли на белых мышах. Каждому животному вводили препарат в объеме 0,5 мл и в дозе в 10 000 раз превышающей дозу, применяемую при постановке скарификационных проб. Гибели мышей отмечено не было, что свидетельствует о безвредности аллергенных экстрактов из ЗК.
Приготовленные пять серий аллергенов испытывали на стабильность. Препараты хранили при температуре от 2 °С до 8 °С. Определение содержания белка, оценку физико-химических свойств и безвредности полученных препаратов проводили через 1, 1,5 и 2 года. Доказано, что препараты аллергенов не изменяли свои свойства при хранении в течение двух лет (табл. 1).
Анализ фракционного состава аллергенных экстрактов, полученных из соцветий и пыльцы ЗК, проводили методом вертикального электрофореза в 15%-м полиакриламидном геле. Результаты электро-форетического разделения показали, что исследуемые препараты гетерогенны. Электрофоретические фракции аллергена из соцветий золотарника не содержали высокомолекулярных компонентов и были сильно пигментированы. Электрофоретическое разделение аллергена из пыльцы золотарника позволили
Физико-химические свойства препаратов аллергенов из соцветий и пыльцы золотарника канадского
Таблица 1.
Экстракты аллергена
pH
Цвет препарата
Безвредность
Белковый азот (PNU)
Стабильность
Соцветие
Пыльца
7,2
7,2
Темно-коричневый
Светло-желтый
Безвреден
6700
8400
Стабилен
э
т ш'АТы
Таблица 2.
Частота выявления ¡дЕ-АТ методом ИФА в сыворотках детей с пыльцевой сенсибилизацией к аллергенам из сорных трав и сравнение полученных результатов с данными скарификационных проб (п = 60)
Наименование аллергена
Полынь
Частота выявления IgE-AT, %
63,3
Скарификационные пробы, %
40,0
Амброзия
13,3
8,3
Золотарник канадский (соцветия)
Золотарник канадский (пыльца)
23,3 35,0
Не оценивали
определить четыре основные белковые группы данного препарата. Первая высокомолекулярная фракция от 90 кДа и выше, далее следует фракция от 45 кДа до 65 кДа, третья белковая фракция от 25 кДа до 32 кДа и, наконец, низкомолекулярная — 16 кДа и ниже. Белковые компоненты золотарника 37-38 кДа сравнимы по молекулярной массе с фракциями коммерческого препарата из пыльцы амброзии [12]. Не исключено, что фракции пыльцы ЗК с подобной молекулярной массой будут обладать сильными аллергенными свойствами [9].
Для выявления сенсибилизирующих свойств у полученных аллергенов проводили модельные эксперименты по воспроизведению анафилактического шока у морских свинок. Согласно полученным результатам, анафилактический индекс Вейгла у морских свинок, получавших аллерген из соцветий ЗК, был равен 1,4, а в группе животных, получавших аллерген из пыльцы ЗК, — 1,9. Этот факт свидетельствует об иммуноген-ности приготовленных препаратов.
Специфическую активность, а именно наличие аллергенных свойств у полученных препаратов из пыльцы и соцветий ЗК, оценивали методом твердофазного ИФА и в реакции НДТК.
Методом ИФА было проанализировано 60 сывороток пациентов с преимущественной сенсибилизацией к сложноцветным. Выявлена разница в уровне сывороточных 1дЕ-АТ к аллергенам из пыльцы и из соцветий ЗК. 1дЕ-АТ к аллергену из соцветий растения обнаружены в сыворотках 23,3% пациентов, а из пыльцы — у 35,0% пациентов. Следовательно, 1дЕ-АТ в сыворотках пациентов к аллергену из пыльцы ЗК встречались в 1,5 раза чаще, чем к аллергену из соцветий растения. Кроме того, уровень 1дЕ-АТ первого класса к аллергену из пыльцы ЗК был выявлен у 18,3% пациентов с поллино-зом, 2 класса — у 13,3% и 3 класс — у 3,3% обследованных пациентов (табл. 2). К аллергену из соцветий уровень 1дЕ-АТ в сыворотках соответствовал первому классу.
Для подтверждения наличия аллергенных свойств у полученных препаратов проводили тест непрямой дегрануляции тучных клеток крыс. Методом ИФА в опыт были отобраны 20 сывороток больных, имеющих уровень 1дЕ-АТ 2-3 класса к аллергену из пыльцы ЗК. Де-грануляция тучных клеток свыше 50% в ответ на аллерген из пыльцы ЗК была выявлена при пассивной
сенсибилизации тучных клеток одной из отобранных сывороток больных. В экспериментах с другими сыворотками наблюдали приблизительно 35%-ю дегрануля-цию тучных клеток в ответ на аллерген из пыльцы ЗК. Незначительная дегрануляция (около 15%) была выявлена при активации тучных клеток аллергеном из соцветий ЗК.
Таким образом, с помощью методов НДТК и ИФА показано, что полученные аллергены обладают специфической активностью. Согласно нашим исследованиям, препарат из пыльцы растения ЗК обладает аллергенными свойствами, в отличие от препарата из соцветий золотарника.
Для выявления антигенной активности препарата проводили иммунодот. Об уровне IgG-AT в сыворотках пациентов судили качественно по интенсивности окрашивания микроточек на нитроцеллюлозной мембране, инкубированной с сыворотками пациентов. Серопози-тивные реакции с аллергеном из пыльцы и соцветий ЗК могут свидетельствовать о наличие антигенных свойств у полученных аллергенов.
Таким образом, наиболее выраженными аллергенными и сенсибилизирующими свойствами обладает препарат аллергена из пыльцы ЗК. Он отвечает требованиям, предъявляемым к диагностическим аллергенам. Новый препарат аллергена из ЗК позволит расширить панель пыльцевых аллергенов для диагностики пыльцевой сенсибилизации.
Литература
1. Астафьева Н.В., Адо В.А., Горячкина В.А.//Расте-ния и аллергия. — Саратов. — 1986.
2. Гервазиева В.Б., Овсянникова И.Г., Райнис Б.Н., Воронкин Н.Г.//В сб. «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной аллергологии и иммунологии». — Каунас. — 1986.
3. Емельянов A.B., Федосеев Г.Б., Сергеева Г.Р.// Аллергология. — 2002. — № 2. — С. 10-15.
4. Манжос М.В., Молотилов Б.А., Мягкова М.А.//
В сб. «Иммунитет и болезни: от теории к терапии». — М. — 2005.
5. Михайлов А.Т., Симирский В.Н.//Методы имму-нохимического анализа в биологии развития. — М.: Наука. — 1991.
6. Фрадкин В.А.//Диагностические и лечебные аллергены. — М.: Медицина. — 1990.
€
-июнь 2009 г.
7. Фрадкин В.А., Прядкина М.Д., Рошаль Н.И., Ру-нова В.Ф., Полякова Т.М.//Методические указания к первичной экспериментальной апробации новых форм аллергенов. — Москва. — 1982. — 22 с.
8. Шевелюк И.М.//Аллергология. — 2001. — № 2. — С. 23-26.
9. De La Torre Morin F., Sanchez Marhin l.,Garsia Robana J.C.//lntenstig. Allergol. Clin. Immunol. — 2001. — V. 11(2). —P. 118-122.
10. De Long N., Vermeulen A., Gerth van Wijr R.// Allergy. — 1998. —V. 53(2). — P. 204-209.
11. European Pollen Information: http://www. ngdc.noaa.gov.
12. Olson J.R., Klapper D.G.//J. Immunol. — 1986. — V. 136(6). — P. 2109-2115.
13. Paterson R., Gramer L.C., Greenberger R.A.// Allergic Diseases. — Philadelphia-New York, LippincottRaven rublishers, 2000.
КОНГРЕССЫ, СЪЕЗДЫ, КОНФЕРЕНЦИИ
2009 г.
XIth WORKSHOP on LANGERHANS CELLS
September, 3-6
Funchal, Maderia, Portugal
Organized by Nikolaus romani & Georg Stingl
Innsbruck — Vienna, Austria
www.lc2009.at
39th ANNUAL EUROPIAN SOCIETY for DERMATOLOGICAL RESEARCH (ESDR) MEETING
September, 9-12 Budapest, Hungary. E-mail: [email protected]
Ist ISCT EUROPE REGIONAL MEETING
September, 14-16
Cultural Conference Center't Elzenveld, Antwerp, Belgium www.iscteurope2008.org
X ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ФОРУМ «МАТЬ и ДИТЯ»
29 сентября — 1 октября Москва, Конгресс-центр ЦМТ
AMERICAN COLLEGE of ALLERGY, ASTHMA & IMMUNOLOGY ANNUAL MEETING (ACAAI)
November, 6-11
Miami Beach, Florida, USA
AMERICAN ACADEMY of ALLERGY, ASTHMA & IMMUNOLOGY (AAAAI) - 66th ANNUAL MEETING
February, 26 — March, 2 Washington, DC, USA www.aaaai.org
XIVth INTERNATIONAL CONGRESS of IMMUNOLOGY
August, 22-27 Kobe,Japan www.ici2010.org
AMERICAN COLLEGE of ALLERGY, ASTHMA & IMMUNOLOGY (ACAAI) ANNUAL MEETING
November, 12-17 Phoenix, Arizona, USA
2011 r.
AMERICAN ACADEMY of ALLERGY, ASTHMA & IMMUNOLOGY (AAAAI) - 67th ANNUAL MEETING
March, 18-22
San Francisco, CA, USA
2012 r.
AMERICAN ACADEMY of ALLERGY, ASTHMA & IMMUNOLOGY (AAAAI) - 68th ANNUAL MEETING
March, 2-6 Orlando, FL, USA
IInd INTERNATIONAL CONGRESS on EXACERBATIONS of AIRWAY DISEASE
November, 13-15
Presidente Intercontinental Los Cabos Resort
Los Cabos, B.C.S.
Mexico
http://themacraegroup.com/default.htm 2010 r.
ASIA PACIFIC ASSOCIATION of ALLERGY, ASTHMA & CLINICAL IMMUNOLOGY - Vllth CONGRESS
Singapore
AMERICAN ACADEMY of ALLERGY, ASTHMA & IMMUNOLOGY (AAAAI) - 66th ANNUAL MEETING
February, 26 — March, 2 New Orleans, LA, USA
AMERICAN COLLEGE of ALLERGY, ASTHMA & IMMUNOLOGY (ACAAI) ANNUAL MEETING
November, 8-14 Anaheim, CA, USA
2013 r.
AMERICAN ACADEMY of ALLERGY, ASTHMA & IMMUNOLOGY (AAAAI) - 69th ANNUAL MEETING
February, 22-26 San Antonio, TX, USA
ASIA PACIFIC ASSOTIATION of ALLERGY, ASTHMA & CLINICAL IMMUNOLOGY - VIIIth CONGRESS
Taiwan
