CC BY
105
УДК 579.222
НОВІ ШТАМИ-ПРОДУЦЕНТИ БІОБУТАНОЛУ. I. ВИДІЛЕННЯ ТА ІДЕНТИФІКАЦІЯ
О. О. Тігунова ДУ «Інститут харчової біотехнології та геноміки»
С. М. Шульга НАН України, Київ
E-mail: [email protected]
Отримано 12.07.2012
Одержання нових продуктивних штамів мікроорганізмів, які продукують біобутанол, стає нагальною і актуальною проблемою. Вивчення морфофізіологічних властивостей виділених штамів, відпрацювання умов їх культивування, оптимізація синтезу біобутанолу — основні передумови для створення економічно доцільного технологічного процесу. Мета роботи полягала в пошукові та ідентифікації штамів-продуцентів біобутанолу і масляної кислоти (його попередника). Об’єктами дослідження були мікроорганізми, виділені з ґрунтів та мулів водойм міста Києва. За результатами скринінгу виділених культур отримано три перспективних штами, які ідентифіковано як Clostridium acetobutylicum, C. tyrobutylicum, C. butylicum. Модифіковано середовище з урахуванням потреб нових культур. З метою максимального накопичення цільових продуктів досліджено метаболічні особливості продуцентів.
Ключові слова: біобутанол, біосинтез, АБЕ-ферментація, штами-продуценти.
Дослідження ензиматичних процесів з метою одержання біопалива розвиваються достатньо швидко. Біобутанол — один із видів біопалива, який одержують за допомогою мікробного синтезу в результаті ацетон-бутанол-етанол (АБЕ)-ферментації з використанням як субстрату глюкози або сахарози.
Для економічно доцільного виробництва біобутанолу штам-продуцент має продукувати виключно біобутанол та/або використовувати дешеву сировину-субстрат.
Бактерії Clostridium acetobutylicum у класичній АБЕ-ферментації спочатку продукували масляну, пропіонову, молочну та оцтову кислоти (стадія утворення кислоти), згодом водневий показник знижувався і починалася стадія продукування розчинників з утворенням бутанолу, ацетону й етанолу [1].
Одну з нових двостадійних технологій отримання біобутанолу [2] було розроблено в останні роки. На першій стадії штам-про-дуцент виробляв масляну кислоту, а на другій — інший штам-продуцент виробляв біобутанол [3]. У процесі накопичення масляної кислоти, попередника біобутано-лу, його синтез інтенсифікувався, підвищувалася швидкість накопичення та збільшувались об’єми цільового продукту. Розроблення цієї технології стимулювало пошук нових продуктивних штамів продуцентів з використанням дешевої відновлю-вальної сировини [4-7].
У роботі проведено пошук та здійснено ідентифікацію нових штамів-продуцентів біобутанолу і масляної кислоти [8].
Матеріали і методи
Об’єктами дослідження були мікроорганізми, виділені з ґрунту та мулу водойм м. Києва (табл. 1).
Зразки ґрунтів відбирали стерильним шпателем з глибини 20 см, вносили їх у стерильні флакони з етикетками, на яких було вказано дату, назву зразка і місце відбору.
Ґрунтову суспензію для виявлення колоній та підрахунку мікроорганізмів отримали методом граничних розведень у співвідношенні 1:10 000.
Живильне середовище, бобово-пептон-ний агар (БПА) на основі бобового екстракту, було використано для визначення кількості мікроорганізмів у зразках. Екстракт виготовляли за схемою: 250 г насіння бобових замочували в 1 л води, кип’ятили протягом 1 год, відвар зливали і доводили його об’єм до 1 л відстояною водопровідною водою. Додавали 10 г сахарози і стерилізували протягом 20 хв (тиск — 0,5 атм). Для приготування БПА до 1 л екстракту додавали: сахарозу — 20 г, пептон — 5 г, ЫаС1 — 5 г, СаС03 — 20 г, агар — 30 г, потім стерилізували упродовж 30 хв (тиск — 1 атм).
Для виділення спорових і знешкодження неспорових мікроорганізмів усі зразки
Таблиця 1. Характеристики місць відбору зразків
Зразок Місця відбору
IFBG C1M Мул озера «Міністерське». Піщаний, близько 1% коренів рослин, 20% рослинних решток
IFBG C2M1 Ґрунт озера «Міністерське». Чорнозем, 30% піску, 40% рослинних коренів, 20% рослинних решток
IFBG C3U Мул з анаеробного біореактора очисних споруд м. Києва
IFBG C4B Ґрунт озера «Водяне». Глинистий, 20% піску, 20% рослинних решток, 5% коренів рослин, близько 1% мушель
IFBG C53 Термічно оброблений мул очисних споруд м. Києва
IFBG C6H Ґрунт озера «Наливне». Дерново-підзолистий, наявні рослинні рештки та близько 20% коренів
IFBG C7P Регенерований мул очисних споруд м. Києва
IFBG C83 Ґрунт затоки річки «Дніпро». Пісчаний, переважають рослинні корені (майже 85% від проби), близько 5% чорнозему, наявні рослинні рештки
IFBG C9Б Ґрунт озера «Бетонне». Чорнозем, переважають рослинні корені (майже 95% від проби), близько 1% становить пісок, наявні часточки решток рослин
піддавали термічній обробці, яку проводили протягом 10 хв на водяній бані за температури 80 °С.
Бобово-пептонний бульйон (БПБ) використовували для накопичення культур мікроорганізмів. Для приготування БПБ до 1 л екстракту додавали: сахарози — 20 г, пептону — 5 г, ЫаС1 — 5 г, СаС03 — 20 г, далі стерилізували протягом 30 хв (тиск — 0,5 атм)
Для накопичення культур 1 г кожної проби (ґрунту або мулу) вносили в колбу об’ємом 50 мл, стерильно доливали до верху колби БПБ і закривали стерильною пробкою з газовідвідною трубкою, кінець трубки занурювали в пробірку з водою і вміщували в термостат при 30 °С.
Селективним середовищем слугувало середовище Ешбі такого складу: водопровідна вода — 1 л, сахароза — 20 г, К2НР04 —
2 г, М^04 — 2 г, ЫаС1 — 2 г, ^04 — 1 г, 1%-й розчин Ее804 — дві краплі, СаС03 — 5 г. Середовище стерилізували протягом 30 хв (тиск — 0,5 атм).
Для виявлення клостридіальних культур у колбу об’ємом 50 мл вносили 1 г кожної проби (ґрунту або мулу) та 30 мл середовища Ешбі. Колби зі зразками вміщували в ексикатор.
Як тестові використовували два середовища: Виноградського (дистильована вода — 1 л, глюкоза — 5 г, К2НР04 — 1 г, М^04 — 0,5 г, ЫаС1 — 0,01 г, Ее804 — 0,01 г, Ии804 —
0,01 г), яке стерилізували протягом 30 хв, тиск — 0,5 атм, та середовище зі скибок картоплі, натертих крейдою. Для приготування останнього картоплю ретельно мили, очищували, знову мили, нарізали скибочками
завтовшки 0,5-0,7 см, натирали крейдою та розкладали у чашки Петрі на два шари фільтрувального паперу. Чашки стерилізували протягом 1 год (тиск — 1 атм).
Середовище Виноградського (об’єм 30 мл) розливали у 50 мл колби, додавали 1 г відібраних зразків і вносили до ексикатора.
Для очищення культур та отримання окремих колоній було створено модифіковане агаризоване середовище Виноградського (МАВ) такого складу (г/л): дистильована вода — 1 л, глюкоза — 20 г, K2HPO4 — 1 г, MgSO4 — 0,5 г, NaCl — 0,01 г, FeSO4 — 0,01 г, MnSO4 — 0,01 г, CaCO3 — 20 г, дріжджовий екстракт — 2 г, вітамін В1 — 0,01 г, вітамін В12 — 0,01 г, тіаміну гідрохлорид — 0,25 г, параамінобензойна кислота — 0,001 г, агар — 30 г. Середовище стерилізували протягом 30 хв (тиск 1 атм).
Використовували також ензиматичне середовище такого складу (г/л): меляса — 55; (NH4)2SO4 — 0,6; (NH4^HPO4 — 1,6; CaCO3 — 10; рН — 6,2. Середовище стерилізували протягом 30 хв (тиск — 1 атм).
Культивування зразків проводили в колбах з рідким середовищем або на чашках Петрі в ексикаторі. Кришку ексикатора герметично притирали. Після притирання ексикатор тричі продували азотом і ставили в термостат, нагрітий до 30 °С.
Мікроскопіювання проводили за допомогою мікроскопа Laboval (Німеччина). Знімки робили фотоапаратом Canon PowerShot A640 (Японія).
Для виявлення в культуральній рідині масляної кислоти використовували якісну реакцію отримання маслянокислого заліза.
Реакція полягала в тому, що нейтральні розчини маслянокислих солей під час нагрівання з ЕеС13 набували коричневого забарвлення з утворенням маслянокислого заліза:
3Са(СН3СН2СН2С00)2 + 2ЕеС13 = 2Ее(СН3СН2СН2С00)3 + 3СаС12.
Для проведення такої реакції в пробірку наливали 5 мл культуральної рідини, додавали 5% -й розчин хлориду заліза (2 мл) і нагрівали на полум’ї пальника.
Розчин маслянокислого заліза у відбитому світлі набував бурувато-коричневого забарвлення, а в світлі, яке проходило, — криваво-червоного. Як негативний контроль застосовували стерильне ензиматичне середовище з додаванням ЕеС13. Кількість маслянокислого заліза, що утворювалось, визначали за допомогою фотоелектроколо-риметра (ФЕК) за довжини хвилі 540 нм. Вихідне середовище слугувало стандартом.
За допомогою ФЕК побудовано калібрувальний графік (ензиматичне середовище з різною концентрацією маслянокислого заліза) та визначено концентрацію масляної кислоти в культуральній рідині (рис. 1).
Для виявлення ацетону в культуральному середовищі використовували індикаторні смужки «Ацетонтест» (Україна) з діапазоном концентрацій від 0 до 15 ммоль/л. Негативним контролем слугувало стерильне середовище для культивування, а позитивним — чистий ацетон.
Після семи діб вирощування клітини осаджували за допомогою ультрацентрифуги ЪаЪо£^е 400И, Німеччина (швидкість 13 000 об/хв).
Наявність етанолу та бутанолу в культу-ральній рідині визначали за допомогою газового хроматографа з полум’яно-іонізаційним детектором. Використовували набивну колонку завдовжки 3 м, фаза — карбовакс
1500 на хроматоні N-A-W-DMSC (0,20-0,25 мм). Температура колонки 60±2 °С, випарювача 160+5 °С. Співвідношення потоків азот-водень-повітря 1:1:10.
Використовували м’ясопептонну желатину (склад, г/л: суха суміш поживного бульйону — 15, NaCl — 5, дрібно порізаної желатини — 150) для визначення параметра «розріджуваність». Середовище стерилізували протягом 30 хв (тиск — 0,5 атм).
Для фарбування джгутиків застосовували метод Лефлера з модифікацією, наведеною в роботі [9]. Середовища Гісса з індикатором Андреде використовували для встановлення «зброджуваності» цукрів. Для забарвлення препаратів із живими клітинами використовували розчин Люголя, а для вітального забарвлення — метиленовий синій.
Усі проби для виявлення гранульози було проаналізовано за допомогою мікроскопії. Культури відбирали з товщі середовища та готували препарат «роздавлена крапля» з додаванням розчину Люголя. Гранульоза, реагуючи з йодом, забарвлювалась синім. Для вітального фарбування відібрані бактерії за допомогою петлі наносили на предметне скельце з краплею води, фіксували над полум’ям пальника та фарбували метиленовим синім.
Для ідентифікації місця розташування спор у клітинах було застосовано метод фарбування спор, наведений у роботі [9].
Для визначення відношення зразків до фарбування за Грамом провели дослідження з використанням відповідних барвників [10].
Статистичну обробку даних було здійснено за допомогою програми Microsoft Excel. Усі досліди проводили в 3 повторах. Дані вважали достовірними за Р < 0,05.
Результати та обговорення
Проби зразків ґрунту та мулу з водойм м. Києва (табл. 1) було відповідно оброблено та досліджено протягом першої доби. Для визначення кількості мікроорганізмів у кожному зразку були приготовлені і висіяні на БПА розведення відповідної суспензії з ґрунту та мулу. Кількість мікроорганізмів у відібраних зразках наведено в табл. 2.
Отримані дані про кількість мікроорганізмів у зразках дали змогу встановити оптимальне розведення суспензії для по-даль ших досліджень.
Для накопичення культур маслянокислих бактерій зразки було внесено в БПБ і залишено в термостаті за температури
Концентрація, г/л
Рис. 1. Калібрувальний графік визначення концентрації масляної кислоти
Таблиця 2. Кількість мікроорганізмів у зразках
Зразок Кількість мікроорганізмів, млн. КУО/г
ШВО С1М 105± 15
ІЕВО С2М1 199± 20
ІЕВО С3и 210± 18
ІЕВО С4В 800±50
ІЕВО С5З 900±52 І
ЕВО С6Н 248±20
ІЕВО С7Р 130±19
ІЕВО С8З 561±33
ІЕВО С9Б 634±41
30 °С. Для одержання анаеробних азотфікса-торів зразки розсіяли на тестове середовище Виноградського, перенесли їх до ексикатора та помістили в термостат при 30 °С. Спостереження за зразками вели впродовж тижня. Отримані дані щодо змін характеристик середовища подано в табл. 3.
З даних табл. 3 випливає, що в зразках ІЕВО С9Б, ІЕВО С6Н та ІЕВО С4В на БПБ відбувалось активне газоутворення, а в пробі ІЕВО С5З — незначне; на середовищі Виноградського — активне газоутворення та помутніння в зразках ІЕВО С2М1, ІЕВО С7Р, ІЕВО С3и, а неістотне — в ІЕВО С1М; на середовищі Ешбі активне газоутворення спостерігали в зразку ІЕВО С6Н, ІЕВО С8З, а незначне — у ІЕВО С5З. В усіх пробах було відзначено помутніння середовища та відчувався характерний запах масляної кислоти.
Проведено фарбування живих препаратів за допомогою розчину Люголя для встановлення належності відібраних культур бактерій до клостридіального типу. Клітини
бактерій групи клостридій містили в своєму складі гранульозу — крохмалеподібну речовину, яка за дії йоду забарвлювалась у синій колір (рис. 2).
В усіх пробах виявили одну або більше культур, які мали форму рухливих паличок
і містили гранульозу. В деяких пробах було виявлено суміш культур.
Усі зразки було висаджено на скибки картоплі, натерті крейдою та вміщені в чашки Петрі, для перевірки наявності маслянокислих та ацетонобутилових бактерій. Культивування проводили при 30 °С в ексикаторі. Отримані дані наведено в табл. 4.
IFBG C4В
IFBG C9Б
Гіч
к • "-і1“
0.(|іт
Рис. 2. Фотографії культур IFBG C4В та IFBG
C9Б (темним забарвлено гранульозу)
Таблиця 3. Характеристики змін середовища
Зразок Зміни середовища
Помутніння Газоутворення
БПБ Виноградського Ешбі БПБ Виноградського Ешбі
ІЕВО С1М +* + + _* ++ —
ІЕВО С2М1 + ++ + + +++ +
ІЕВО С3и + ++ + + +++ +
ІЕВО С4В ++* + - +++* ++ _
ІЕВО С5З + + + + _ +++
ІЕВО С6Н ++ ++ ++ +++ + +++
ІЕВО С7Р ++ +++ ++ + +++ +
ІЕВО С8З + + + ++ ++ ++
ІЕВО С9Б ++ + ++ +++ + +
* — Зміни відсутні; +,++,+++ інтенсивність змін.
Таблиця 4. Морфологія колоній на скибках картоплі
Зразок Морфологічні ознаки
ІЕБО СІМ Жовті, невеликі, округлі, з нерівним краєм, з пухирцями повітря всередині
ШБС С2М1 Яскраво-жовтого кольору, плейоморфні, зморшкуваті, з пухирцями повітря всередині
ШБС С3и Сірувато-жовті, бліді, зморшкуваті, з пухирцями повітря всередині
ІЕБО С4В Темно-руді, округлі, гладенькі, з пухирцями повітря всередині, яскравого забарвлення
ІЕБО С5З Жовті, округлі, випуклі, з пухирцями повітря всередині
ІЕБО С6Н Білого кольору, округлі, гладенькі, з пухирцями повітря всередині
ШБС С7Р Білого кольору, округлі, зморшкуваті, з пухирцями повітря всередині
ІЕБО С8З Жовті, округлі, слизюваті, з пухирцями повітря всередині
ІЕБО С9Б Жовтувато-коричневі, гладенькі, дрібні, слизюваті з пухирцями повітря всередині
Як видно з табл. 4, наявність в усіх зразках характерних колоній білого та жовтого кольору свідчить про присутність маслянокислих бактерій. Колонії цих бактерій на поверхні картоплі мали опуклу форму, жовтуватий колір і пухирці газу всередині. Проаналізувавши форму, розміри, характер краю, забарвлення, структуру, консистенцію та поверхню колоній, дійшли висновку, що в усіх зразках виявлено різні штами маслянокислих бактерій.
Для очищення культур та отримання окремих колоній культури висіяли на МАВ і культивували в термостаті за температури 30 °С. На 5-ту добу одержано ізольовані характерні колонії білого і сірого кольору та колонії з жовтим відтінком. В результаті дослідження отримано колонії трьох основних типів: у формі «двоякоопуклої лінзи», «клаптика вати» або «літачка» із зоною просвітлення навколо всіх колоній. Найхарактерніші колонії трьох зразків подано на рис. 3.
Для підтвердження належності колоній до клостридій та чистоти культур було проведено мікроскопіювання з метиленовим синім. Результати типового зразка наведено на рис. 4.
В усіх зразках виявлено палички із заокругленими кінцями, розташовані поодинці, попарно або у вигляді ланцюжка. Спори були розміщені термінально або субтермі-нально.
Клостридіальні колонії переносили на рідке ензиматичне середовище та культивували протягом чотирьох діб. Після закінчення культивування визначали кількість масляної кислоти за допомогою реакції з ЕеС13 (рис. 5).
Найбільшу інтенсивність забарвлення з ЕеС13 було виявлено в культуральній рідині зразка ІЕБО С4В. Оптична густина культу-ральної рідини зразка ІЕБО С4В становила
0,64, концентрація масляної кислоти — 4,5 г/л.
Усі зразки перевірили за допомогою ацетон-тесту на наявність ацетону в культу-ральній рідині. Результати перевірки подано в табл. 5.
Рис. 4. Культура IFBG C9Б, забарвлена метиленовим синім
Рис. 3. Зразки IFBG C4В, IFBG C9Б, IFBG C6Н на середовищі МАВ
Рис. 5. Вміст масляної кислоти у культуральній рідині відібраних зразків:
* — різниця достовірна порівняно з контролем; контроль — найменша концентрація масляної кислоти у культуральній рідині
Таблиця 5. Вміст ацетону в культуральній рідині відібраних зразків
Зразки Концентрація ацетону, г/л
ШБО С3и -
ІЕБО С1М 0,21±0,05
ІЕБО С5З -
ІЕБО С9Б -
ШБО С7Р 0,23±0,05
ІЕБО С6Н 0,23±0,05
ІЕБО С4В -
З результатів, наведених у табл. 5, випливає, що ацетон виявлено в культуральній рідині культур ІЕБО С6Н, ІЕБО С7р та ІЕБО С1М. Концентрація ацетону в цих зразках за даними тесту — близько 0,2 г/л.
Було визначено вміст етилового спирту та бутанолу в культуральній рідині відібраних зразків (рис. 6).
Рис. 6. Вміст етанолу та бутанолу в культуральній рідині зразків IFCG C6H, IFCG C1M, IFCG C7P:
* — різниця достовірна вдносно контролю; контроль — найменша концентрація бутанолу та етанолу в культуральній рідині
Як видно з рис. 6, культуральна рідина штамів ІЕБО сбн, ІЕБО С7р містила бута-нол та етанол. Кількість етанолу й бутанолу в культуральній рідині становила близько 1,2 г/л. Зразок ШВО СІМ містив лише бутанол.
Для встановлення виду бактерій було проведено ідентифікацію зразків ІЕБО С4В, ІЕБО С6Н і ІЕБО С7Р. Ідентифікацію виконували в декілька етапів (рис. 7).
2
4
Рис. 7. Етапи визначення родової належності культур:
1 — фарбування за Грамом;
2 — фарбування спор;
3 — фарбування джгутиків;
4 — розрідження желатини
Етап перший
Відомо, що розрізнення грампозитивних та грамнегативних бактерій є першим кроком у диференціації бактеріального зразка за біохімічними властивостями їхньої клітинної стінки. Забарвлення за Грамом має велике значення у систематиці бактерій, тому було проведено дослідження штамів на відповідну реакцію.
Під час фарбування клітини набули темно-синього забарвлення, що свідчить про належність їх до грампозитивних бактерій (рис. 7, 1).
Етап другий
Готували мазок тридобових культур для виявлення спор та визначення їхніх характеристик. Спори фарбували за методом, наведеним у роботі [9]. На рис. 7, 2 показано
спори, забарвлені блакитним або синім кольором, та цитоплазму молодих клітин — рожевим або червоним. Зразки мали однакове розташування спор — субтермінальне. Спори мали овальну форму і начебто «роздували» клітину.
Етап третій
Джгутики добової культури зразків фарбували за методом, наведеним в роботі [9]. Результати дослідів подано на рис. 7, 3. Бактерії мали перитрихіально розташовані джгутики.
Етап четвертий
Для дослідження клостридіальних культур на розрідження желатини штами культивували на м’ясопептонній желатині. Порівняно з контролем зразки IFBG С7Р та IFBG С4В не розріджували, а зразок IFBG С6Н — розріджував желатину. Розрідження мало лійкоподібну форму з поверхнею у вигляді кратера (рис. 7, 4).
Етап п’ятий
Для визначення «зброджуваності» цукрів зразки висівали на кольорові середовища Гісса (Hiss). Результати досліджень подано в табл. 6.
У результаті ідентифікації бактерій за Бердже було виявлено, що зразок IFBG С6Н належав до виду Clostridium acetobutylicum, IFBG С4В — до C. tyrobutylicum, IFBG С7Р — до C. butylicum.
ЛІТЕРАТУРА
1. Tigunova O, Shulga S. Obtaining of new butanol producers // Abst. 15th Eur. Congr. Biotechnol., Istanbul, Turkey, 23-29 September 2012. — V. 29, Issue S. — P. S 43.
2. International patent US 5 753 474.
Continuous two stage, dual path anaerobic fermentation of butanol and other organic solvents using two different strains of bacteria /
D. E. Ramey. — Filed 20.12.1996; Published 19.05.1998.
3. Биобутанол: история, технологии, производители. — Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология». — 2009. — Онлайн ресурс: http://www.cbio.ru/article.php?sto-ryid=3355.
4. Ren Z, Ward T. E, Logan B. E., Regan J. M. Characterization of the cellulolytic and hydrogen-producing activities of six mesophilic Clostridium species // J. Appl. Microbiol. — 2007 — V. 103 (6). — P. 2258-2266.
5. Березина О. В. Целлюлазная и гемицеллю-лазная активности сольвентогенных кло-стридий // Сборник статей «Биотехнология будущего» в рамках Международного
Таблиця 6. Визначення «зброджуваності» цукрів
Вуглеводи Зразки
IFBG С4В IFBG С7Р IFBG С6Н
Глюкоза + + +
Сорбіт - - +
Фруктоза + + +
Арабіноза - - +
Аскулін - + -
Лактоза - + +
Целюлоза - - +
Галактоза - + +
Крохмаль - + +
Ксилоза + + +
Сахароза - + +
Маніт + - +
Рамноза - + +
Маноза + + +
+ зброджується; - не зброджується.
Ідентифікація культур нових штамів-продуцентів біопалива це — перший крок на шляху розроблення технології одержання біобутанолу з основними технологічними етапами — збільшенням виходу біобутанолу та використанням дешевої відновлювальної сировини.
симпозиума «ЕС — Россия: перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной программе». — М.: ОАО «Авиаиздат», 2006. — C. 4-5.
6. Ястремская Л. С., Васильченко О. А. Селекция анаэробного целлюлолитического термофильного штамма Clostridium thermo-cellum 5СТ // Б^технолопя. — 2011. — Т. 4, № 2. — C. 80-85.
7. Guillaume Bruant, Marie-Josee levesque et. al. Genomic Analysis of Carbone Monoxide Utilization and Butanol Production by Clostridium carboxidivorans Stain p7T. // Plose ONE. — 2010. — V. 5, Iss. 9. — P. 1-12.
8. Краткий определитель бактерий Берги / Под ред. Дж. Хоулта. — М.: Мир, 1980. — 495 с.
9. Слюсаренко Т. П. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых производств. Издание третье, переработанное и дополненное. — М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. — 208 с.
10. Энтеробактерии. Руководство для врачей / Под ред. В. И. Попровского. — М.: Медицина, 1985. — 317 с.
НОВЫЕ ШТАММЫ-ПРОДУЦЕНТЫ БИОБУТАНОЛА.
L ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ
Е. А. Тигунова С. М. Шульга
ДУ «Институт пищевой биотехнологии и геномики» НАН Украины, Киев
E-mail: [email protected]
Получение новых продуктивных штаммов микроорганизмов, продуцирующих бутанол, становится насущной и актуальной проблемой. Изучение морфофизиологических свойств выделенных штаммов, отработка условий их культивирования, оптимизация синтеза биобутанола — основные предпосылки для создания экономически целесообразного технологического процесса. Цель работы — поиск и идентификация штаммов-продуцентов биобутанола и масляной кислоты (его предшественника). Объектами исследования были микроорганизмы, выделенные из почвы и ила водоемов города Киева.
По результатам скрининга выделенных культур получены три перспективных штамма, которые идентифицированы как C. aceto-butylicum, C. tyrobutylicum, C. butylicum. Модифицирована среда культивирования с учетом потребностей новых культур. С целью максимального накопления целевых продуктов исследованы метаболические особенности продуцентов.
Ключевые слова: биобутанол, биосинтез, АБЕ-ферментация, штаммы-продуценты.
NEW PRODUCER STRAINS OF BIOBUTANOL.
I. ISOLATION AND IDENTIFICATION
O. A. Tigunova
S. M. Shulga
SO «Institute of Food Biotechnology and Genomics» of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: [email protected]
Getting new, more productive strains of microorganisms that produce butanol is a topical problem. Studing of morphological and physiological characteristics of the isolated strains, improvement of their cultivation conditions, optimization of biobutanol synthesis gives the possibility to organize a cost-effective butanol production technology. The aim of this work was searching new butanol and butyric acid producer strains, their identification and studying the main steps of the selective strains biosynthesis. The objects of this study were microorganisms that had allocated from soils and sludges samples of Kiev’s lakes. Obtained cultures have been screened. Three strains were obtained as promising and identified as C. acetobutylicum, C. tyrobutylicum, C. butylicum. Selective medium have been developed and modified for the microorganisms. Producer’s features were investigated in order to maximize the accumulation of target metabolites.
Key words: biobutanol, biosynthesis, ABE-fer-mentation, producer strains.
