CC BY
83
УДК 612.112.95
НОВЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О МЕХАНИЗМЕ ЗАЩИТНОЙ РЕАКЦИИ КЛЕТОК КРОВИ НА ЭКСТРЕМАЛЬНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ
Ю.А. АНТОНИШКИС*, Ю.В. ЛОБЗИН*, A.A. НЕСМЕЯНОВ*,
A.A. ХАДАРЦЕВ**, В.М. ЕСЬКОВ***
На основании обзора литературы и собственных экспериментов с общим гамма-облучением животных (белые крысы, морские свинки) в разных дозах, используя специальные методы гематологического исследования (ядерную формулу нейтрофилов, моноцитограмму, лимфоцитограмму), авторы описали неизвестный ранее механизм защитной реакции системы крови в первые часы и сутки от начала любого экстремального воздействия. Установлено, что суть защитной реакции заключается в дедифференцировке всех видов лейкоцитов с превращением части более зрелых клеток в менее зрелые, которые являются функционально неактивными или малоактивными и вследствие этого отличаются пониженной чувствительностью к патологическим стимулам. В свою очередь это служит объяснением повышения в этот период неспецифической и специфической резистентности организма. Морфологическим выражением такой трансформации клеток (дедифференцировки) является изменение формы ядра. Точно так же причиной начального нейтро-филеза при экстремальном воздействии с возрастанием относительного и абсолютного содержания моносегментоядерных нейтрофилов в русле крови является переход значительной части полисегментоя-дерных нейтрофилов в статус моносегментоядерных нейтрофилов, которые имеют самые низкие показатели функциональной активности и энергетического обмена.
Ключевые слова: общий лучевой синдром, нейтрофилы, моноциты, лимфоциты, трансформация ядер лейкоцитов, защитная реакция крови.
Несмотря на большие достижения в деле изучения перспективных фармакологических средств профилактики радиационных поражений, до настоящего времени не создано радиопротекторов, полностью удовлетворяющих требованиям времени. Практика показала, что наиболее успешными поиски средств защиты могут быть только при наличии глубокого понимания механизмов взаимодействия живого организма с окружающей средой, адаптационных, компенсаторных, регенераторных процессов и статуса неспецифической резистентности организма [10]. Этим определяется актуальность проведенного исследования, проливающего дополнительный свет на резервы адаптационного процесса и формирование упомянутой неспецифической резистентности.
В нормальных условиях жизнедеятельность организма на всех уровнях тканевой организации - молекулярном, органоид-ном, клеточном - происходит непрерывное обновление структур, получившее название физиологической регенерации. Молекулярное и ультраструктурное обновление развертывается в пределах клетки, что обусловило появление термина «внутриклеточная регенерация». Последняя свойственна клеткам всех органов без исключения. Наиболее устойчивой структурой клетки является ее ядро, индуцирующее и регулирующее все биосинтетические процессы в цитоплазме. При усиленном функционировании в клетках развиваются гиперпластические процессы, которые выражаются в полиплоидизации ядер, увеличении числа и размера ядрышек, появлении двухъядерных клеток [8,20]. Под препаративной регенерацией» понимают полное восстановление утраченной части тела (органа, ткани, клетки, части клетки). Восстановление же массы или размера безотносительно к структуре образования составляет суть процесса гипертрофии.
Давно установлен факт функциональной неоднородности клеточных представителей всех гемопоэтических рядов в русле крови [23,26]. Но, что особенно важно, вопреки устоявшемуся мнению о том, что ядро клетки функционирующего пула крови теряет способность к преобразованию, а сама зрелая клетка постепенно утрачивает функциональную активность, многие авторы указывают на сохраняющуюся полипотентность ядер зрелых клеток, их способность в определенных условиях возвращаться к ретро-, де- или дисдифференцированным аналогам с пролиферативной активностью [1]. Нами в более раннем исследовании было обосновано положение о том, что сегментация ядер нейтрофилов характеризует собой не степень зрелости клетки, а уровень ее функциональной активности и реактивности системы
* Научно-исследовательский испытательный центр медико-биологической защиты научно-исследовательского испытательного института военной
медицины Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова Миноборо-
ны Российской Федерации Тульский государственный университет, 300012, г. Тула, пр-тЛенина, д. 92 Сургутский государственный университет, 628412, Тюменская обл., ХМАО-Югра, г. Сургут, пр-т Ленина, 1
крови [4,6,7].
При различных неблагоприятных воздействиях, особенно под влиянием ионизирующих излучений, закономерно регистрируется реакция ПК в виде нарастания числа нейтрофильных гра-нулоцитов со сдвигом ядерной формулы нейтрофилов (ЯФН) влево. При этом реакция оказывается тем выраженнее, чем выше доза облучения [13,17]. Сдвиг ЯФН влево с тенденцией к лейко-цитопении отмечался в том числе и у людей, подвергшихся фракционированному облучению в малых дозах в период ликвидации последствий аварии на ЧАЭС [9]. Механизм этого явления до конца не был выяснен.
Большой интерес представляют сообщения о том, что под влиянием облучения в ПК и костном мозге (КМ) нарастает число малодифференцированных и микроформ лейкоцитов, клеток с двойными и аномальными ядрами [3,11,25]. Подобные превращения ядер клеток крови и изменения реакции бласттрансформа-ции лимфоцитов (БТЛ) отмечались также при воздействии на организм неспецифических (в том числе болевых) раздражителей, цитостатиков, под влиянием космического полета и в процессе раневого воспаления. Из этого можно заключить, что трансформация ядра клеток крови также представляет собой общебиологичекое явление и отражает течение защитной реакции организма. Более того, нарастание в ПК и КМ числа молодых, мало- и недифференцированных (или же дедифференциро-ванных) клеток является непременным условием успешного течения репаративной регенерации [17].
Другое важное наблюдение радиобиологов: в первые часы, сутки после острого облучения в крови экспериментальных животных отмечаются не только угнетение пролиферации родоначальных клеток (блокирование митозов), но и существенное снижение функциональной активности нейтрофилов (уменьшение активности щелочной фосфатазы, миелопероксидазы, угнетение фагоцитоза). Такое же угнетение функциональных свойств лимфоцитов и особенно нейтрофилов наблюдается также и при других неблагоприятных воздействиях на организм: при высоких физических нагрузках у спортсменов [24]; при воздействии на организм повышенной температуры и шума; у моряков после длительного плавания в низких широтах; у людей при акклиматизации в условиях Арктики и Антарктиды; у животных после введения радиопротекторов. При этом оказалось, что в условиях упадка функциональной активности клеток в тканях, в том числе в системе кроветворения, радиорезистентность организма повышается [18]. Закономерность изменений показателей функционального состояния лейкоцитов состоит в том, что их наибольшее снижение отмечается тогда, когда количество лейкоцитов увеличивается. Это дало основание некоторым авторам высказать суждение о том, что указанные процессы в организме играют защитную роль и являются составной частью общебиологического феномена охранительного торможения с понижением чувствительности клеток к любым экстремальным воздействиям [12].
Важное значение имеет и признание той точки зрения, что временное ослабление функциональной деятельности с подавлением практически всех видов обмена необходимо клетке для осуществления последующей активизации на более высоком уровне - так называемого «метаболического взрыва». Сейчас известно, что профилактическое действие различных пептидов (тимогена, интерлейкина-1р и др.), диэтилстильбэстрола, а также цистамина при радиационном воздействии связано с подавлением клеточных биоэнергетических процессов и нуклеопротеидного обмена [2]. Именно в этих условиях регистрируется состояние максимальной радиорезистентности организма.
Таким образом, можно считать установленным: что функционирующий пул системы кроветворения представлен в русле крови клетками с разным уровнем функциональной активности; что число лейкоцитов в ПК может иметь обратную зависимость от этого уровня; что под влиянием различных специфических и неспецифических воздействий в ПК нарастает количество малодифференцированных форм клеток, клеток с двойными и аномальными ядрами; что ядра зрелых форм лейкоцитов сохраняют свою полипотентность и способность в определенных условиях трансформироваться в более молодые и дисдифференцированные аналоги; что при наличии упадка функциональной активности клеток в системе кроветворения радиорезистентность организма в целом тем не менее повышается. В то же время механизмы перечисленных биологических процессов в организме, подвергающемся различным неблагоприятным воздействиям, остаются
до конца не раскрытыми, что и послужило целью настоящего исследования.
Материалы и методы исследования. Экспериментальные исследования проводились с соблюдением международных принципов Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (2000) и «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (1977) [19].
В работе использованы результаты опытов на беспородных белых крысах-самцах в количестве 41 особи с массой тела 170380 г (преимущественно в пределах 200-290 г) и 15 морских свинках с массой тела 285-390 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Для углубленного изучения показателей белой крови исследовались ядерная формула нейтрофилов (ЯФН), лимфоцитограмма (ЛфГр) и моноцитограмма (МнГр).
Ядерная формула нейтрофилов представляет собой процентное распределение нейтрофильных гранулоцитов по числу сегментов в ядре. Ее составление не исключает определенные трудности в связи с разными подходами при разграничении отдельных долей ядра, т.е. сегментов. В своей работе мы пользовались рекомендациями классических руководств: в полисегмен-тоядерном нейтрофиле (ПСЯН) сегменты ядра связаны между собой нитями (единичный контур), в палочкоядерном (ПЯН) -связи между отдельными частями ядра шире (в виде мостиков с двойным контуром). Сегментом мы считали только ту часть ядра, которая была четко отделена от других частей нитевидными перемычками.
Таблица 1
Характеристика клеток лимфоцитограммы
Название клетки Морфологическое описание элемента
Лимфобласт К 1 Клетка обычно крупная. Ядро круглое, нежно-зернистое или сетчатое, возможны нуклеолы. Узкий ободок интенсивно голубой цитоплазмы
Пролимфоцит К 2 Клетка крупная. Ядро круглое сетчатое, но с признаками конденсации хроматина (более грубая сетка), как правило, с нуклеолами. Цитоплазма выражена, светло-голубая
Лимфомоноцит К 3 Клетка средних размеров с бобовидным или лопастным крупносетчатым ядром и выраженным ободком более или менее интенсивно окрашенной прозрачной голубой цитоплазмы
Стимулированный лимфоцит К 4 Клетка небольшая, с интенсивно голубой цитоплазмой и полиморфным (двойным, бобовидным, лопастным или свернутым в конвалют), иногда сетчатым ядром. Цитоплазма нередко «ворсинчатая» с одного или обоих краев, клетка может иметь вытянутую или веретенообразную форму
Малый узкоцито-плазменный лимфоцит К 5 Клетка небольших размеров с узким ободком голубой цитоплазмы и круглым гомогенным компактным, иногда глыбча-тым чаще темным ядром
Широкоцито-плаз-менный лимфоцит К 6 Клетка средних или крупных размеров. Ядро круглое, плотное, светлое. Широкий ободок светло-синей или почти бесцветной прозрачной цито-плазмы, очень часто с немногочисленными азурофильными гранулами
Плазмобласт К 7 Крупная клетка с большим круглым ядром моноцитоидной или ретику-лярной структуры и заметным ободком интенсивно синей цитоплазмы
Плазмоцит К 8 Характерная плазматическая клетка часто с эксцентрично расположен-ным плотно-глыбчатым темным ядром, иногда имеющим «колесовидную» структуру. Достаточно широкая интенсивно синяя цитоплазма нередко с зоной просветления вокруг ядра, иногда с единичными вакуолями
Нами разработана методика составления ЛфГр по морфологическому описанию лимфоцитарных клеток ПК с отражением доли каждой субпопуляции лимфоцитов в процентах. Исходя из указаний литературы на то, что «бласты» в результате антигенного (митогенного) воздействия образуются из малых узкоцито-плазменных лимфоцитов, мы назвали малые лимфоциты с переходной формой ядра «стимулированными лимфоцитами». По нашему представлению, они составляют промежуточное звено в процессе трансформации узкоцитоплазменных лимфоцитов в «бласты» (лимфомоноциты, пролимфоциты и лимфобласты). Широкоцитоплазменные лимфоциты также образуются из узкоцитоплазменных лимфоцитов, и их количество в известной мере характеризует цитотоксический потенциал ПК. Плазмобласты и плазмоциты формируют группу активных В-лимфоцитов, т.е. плазматических клеток. Оптические характеристики клеток представлены в табл. 1.
Моноцитограмма составлялась по характеристикам, предложенным О.П. Григоровой (1958), с нашей модификацией. Нами, вслед за П.С. Фрейдлин (1984), установлено, что изменение формы ядра у моноцитов отражает состояние функциональной активизации клеток, а не процесс их созревания [5]. По этой при-
чине моноциты ПК нами классифицируются следующим образом: моноциты 1 класса - неактивные, клетки с круглым, овальным или неправильных очертаний монолитным ядром без вдавлений и засечек; моноциты 2 класса - стимулированные, но малоактивные клетки с крупным ядром бобовидной, почкообразной формы, с легкими фестончатыми вдавлениями, или с толстым, плотно сложенным вдвое неразвернутым ядром; моноциты 3 класса - активированные, наиболее функционально полноценные клетки с сочным крупным развернутым ядром в виде широкой ленты, или с ядром лопастным, причудливой формы, глубоко сегментированным.
В соответствии с рекомендациями литературы и собственными разработками для изучения динамики ЛфГр в пострадиационном периоде в зависимости от степени выраженности острого лучевого синдрома (ОЛС) 29 крыс по клиническим признакам распределили на следующие группы: субклиническая форма ОЛС (лучевая реакция), доза облучения 1 Гр; ОЛС I степени тяжести -3 Гр, II степени - 5 Гр, III степени - 7 Гр, IV степени - 10 Гр. Контрольную группу составили 9 животных с ложным облучением, еще 3 крысы были подвергнуты воздействию интенсивного шума. Морские свинки в количестве 15 особей составили 3 группы: ложное облучение - 3 штуки, субклиническая форма ОЛС (доза облучения 1 Гр) - 6 штук, ОЛС I степени тяжести (доза 2 Гр) - 6 штук. Облучение животных производилось на исследовательской гамма-установке ИГУР-1 (137С2) при мощности излучения от 1,197 до 0,9814 Гр/мин. Неспецифический шумовой стресс у крыс вызывали путем воздействия интенсивного шума с характеристиками: уровень воздействия 120 дБ, длительность 30 мин, импульс прямоугольный.
Полученные данные обрабатывали методами вариационной статистики с использованием Тжритерия Стьюдента при определении достоверности различия средних с исходными параметрами. Кроме того, вычисляли отклонение показателей в динамике от исходных значений в процентах.
Результаты и их обсуждение. Исследование крови у морских свинок, получивших тотальное гамма-облучение в дозах 1 и 2 Гр, показало следующее. В группе ложнооблученных животных (группа I) на протяжении 20-суточного наблюдения регистрировалось повышенное (по сравнению с исходным показателем) абсолютное содержание ПСЯН при стабильном количестве моносегментоядерных нейтрофилов (МСЯН). Содержание последних повысилось через 15 суток после начала эксперимента одновременно с нарастанием общего числа лейкоцитов, лимфоцитов и ПСЯН. Моноцитограмма у интактных морских свинок характеризовалась стабильно повышенным содержанием активированных моноцитов и колебаниями в сторону повышения удельного веса малоактивных форм клеток. Влияние стресса, связанного с иммобилизацией животных и взятием крови накануне облучения, проявилось в снижении числа лейкоцитов (р<0,05), МСЯН, лимфоцитов и особенно моноцитов (до моноцитопении с максимальным удельным весом активированных моноцитов - 90 %) через 1 сутки от начала опыта. При этом в течение первых суток наблюдения отмечалось усиление процесса сегментации нейтрофилов, что указывало на оживление клеточной защитной реакции организма животных при задержке поступления из КМ всех остальных форм лейкоцитов.
У свинок, облученных в дозе 1 Гр (группа II), через 1 сутки после облучения динамика форменных элементов белой крови была такой же, как и в группе ложнооблученных животных, что говорило о неспецифическом механизме реакции системы крови. Но уже через 2 суток преобладала цитопеническая тенденция: наблюдалось снижение числа нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов. Через 15 суток изменения в содержании нейтрофилов и моноцитов были максимально выраженными при стабилизации числа лимфоцитов. Наблюдались гиперсегментация нейтрофилов и сдвиг МнГр влево. Спустя 20 суток после облучения цитопеническая тенденция сохранялась, но МнГр приблизилась к исходным показателям.
В группе морских свинок, подвергнутых общему облучению в дозе 2 Гр (группа III), изменения клеточного состава крови через 1 сутки после воздействия повторяли в общих чертах динамику показателей в предыдущих группах. Но в реакции ПК через 4 ч после облучения по группам животных имелись определенные различия. У свинок после ложного облучения в эти сроки наблюдалось нарастание численности ПСЯН с тенденцией к гиперсегментации ядер нейтрофилов и увеличение количества моноцитов за счет их стимулиро-
ванных (малоактивных) форм. У фактически облученных животных через 4 ч после воздействия нарастало содержание МСЯН (в группе III достоверно) одновременно с угнетением процесса сегментации ядер нейтрофилов, со снижением числа лимфоцитов и моноцитов. При этом удельный вес неактивных и малоактивных моноцитов в МнГр также увеличивался.
Спустя 2 суток после облучения и до 6 суток пострадиационного периода в группе III снижалось содержание нейтрофилов, особенно МСЯН. Однако дальнейшее снижение числа лимфоцитов прекращалось, отмечалось некоторое увеличение количества моноцитов с достоверным сдвигом в сторону неактивных элементов. Через 10 суток регистрировался как бы абортивный подъем числа нейтрофильных гранулоцитов наряду с резко выраженной моноцитопенией, возрастанием удельного веса активированных моноцитов (до 92%) и исчезновением их неактивных форм. Через 15 суток на фоне увеличения количества лимфоцитов выявлялись минимальные значения нейтрофилов и моноцитов, как и в группе II. Через 20 суток появлялись признаки восстановления в гранулоцитарно-моноцитарном ростке, показатели МнГр и ЯФН приближались к исходным параметрам.
У белых крыс мы провели сопоставление параметров числа нейтрофилов со степенью тяжести ОЛС, определяемой по разработанной нами методике количественной оценки степени тяжести лучевого поражения. Результаты исследования представлены в табл. 2. Уже в первые 6 ч после воздействия, начиная с группы животных с ОЛС II степени тяжести, нами было отмечено увеличение абсолютного числа нейтрофилов тем более существенное, чем более была выражена тяжесть ОЛС. В группе крыс с субкли-нической формой поражения в течение первых суток в большинстве случаев наблюдалось снижение числа МСЯН и ПСЯН (достоверное спустя 6 ч после облучения). К исходу 24 ч нейтрофилез во всех группах животных с выраженными клиническими проявлениями лучевого поражения нивелировался и переходил в ней-трофилопению, которая к 6 суткам пострадиационного периода достигала максимальной выраженности. У крыс же с субклини-ческой формой ОЛС абсолютное содержание нейтрофилов быстро восстанавливалось.
Таблица 2
Динамика общего числа нейтрофилов в периферической крови крыс под влиянием острого общего облучения в зависимости от тяжести поражения
Примечание: * - различия с исходным параметром достоверны, р<0,05 (в скобках - отклонение от исходного параметра в процентах)
Можно высказать мнение, что увеличение в ПК в первые часы и сутки после любого воздействия количества МСЯН представляет собой общебиологическую защитную реакцию системы крови, которая вряд ли связана с демаргинацией нейтрофилов из кровяных депо, как это трактуется в настоящее время. Увеличение числа нейтрофилов можно объяснять их демаргинацией лишь в том случае, если одновременно возрастает в ПК численность лимфоцитов и моноцитов. Однако после радиационного воздействия нейтрофилия регистрируется на фоне прогрессивной убыли моноцитов и особенно лимфоцитов. Кроме того, считается, что лейкоциты (в первую очередь нейтрофилы) задерживаются в сосудистых депо (капилляры, венулы) благодаря свойству прилипания к поверхности эндотелия. В таком случае как предста-
вить себе выход секвестрированных нейтрофилов в циркуляцию, если их адгезивная способность в первые часы и сутки после облучения резко возрастает? Наиболее вероятно то, что суть этой реакции заключается в трансформации функционально активных клеток в менее активные формы. Кроме того, что при облучении животных в сублетальных дозах происходит реактивная задержка митозов в КМ в первые 4-10 ч (при больших дозах - до 24 ч) после облучения, и поступление ПЯН в ПК из КМ резко замедляется или становится невозможным. Следовательно, численность МСЯН в циркуляции нарастает преимущественно за счет трансформации ПСЯН. О том, что МСЯН представляют собой функционально менее активную клеточную форму, можно судить по следующему примеру.
А.Н. Гребенюком (1995) изучался функциональнометаболический статус нейтрофильных гранулоцитов ПК крыс в условиях воздействия малых доз ионизирующих излучений (0,25-
0,5-1,0 Гр). В качестве метода исследования использовалось определение количества катионных белков (КБ) с помощью лизо-сомально-катионного теста. В ходе экспериментов было установлено, что к 5 суткам после облучения в указанных дозах в ПК животных появлялось большое количество ПЯН и метамиелоцитов с высоким содержанием КБ. Полисегментоядерные нейтрофилы чаще содержали минимальное количество КБ или совсем их не содержали. В тот период времени (90 годы прошлого столетия) было принято считать высокое содержание в клетке КБ проявлением ее максимальной функциональной активности. Однако известно, что основная барьерная функция нейтрофила реализуется через его интенсивную экскрецию во внешнюю среду биологически активных веществ путем усиленной дегрануляции клеток - экзоцитоза, что наиболее характерно именно для ПСЯН. Следовательно, существенное возрастание среднего цитохимического коэффициента катионных белков на фоне обогащения русла крови ПЯН и метамиелоцитами, цитоплазма которых была наполнена гранулами диформазана, говорило о том, что этим элементам как раз свойственен низкий уровень экзоцитоза, т.е. низкий уровень функциональной активности. Это обстоятельство подтверждалось также тем, что в рассматриваемый отрезок пострадиационного периода (через 1 сутки после облучения в дозе 0,25 Гр) у крыс в нейтрофилах наблюдалось угнетение всех видов энергетического обмена (активности лактатдегидро-геназы, сукцинатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы). В последующем показатель лизосомальных КБ достоверно снижался на фоне выраженного усиления секреции нейтрофилами щелочной фосфатазы и значительного повышения активности миелопе-роксидазы.
Аналогичные изменения цитохимических показателей нейтрофильных гранулоцитов наблюдались у экспериментальных животных в «пирогенном тесте» после инъекции бактериального эндотоксина. Авторы указывают, что высокая активность щелочной фосфатазы присуща только ПСЯН. Поступающие из КМ после того или иного воздействия молодые грануло-циты вначале имеют отрицательную или слабоположительную активность щелочной фосфатазы и формируют нейтрофильный пик с низкими показателями этого фермента. В последующем активность его растет одновременно с нарастанием численности ПСЯН. Важное значение имеет отмеченное многими авторами обстоятельство, что накопление в ПК молодых форм гранулоцитов, содержащих максимальное количество КБ при минимальной активности щелочной фосфатазы, свидетельствует о повышении устойчивости организма к экстремальным воздействиям, или
о выздоровлении после хирургических операций и при прочих заболеваниях. Снижение функциональной активности клеток крови играет роль защитной реакции и способствует повышению неспецифической резистентности организма.
Поскольку в литературе имеются указания на способность лимфоцитов ПК под влиянием различных воздействий (в том числе и проникающей радиации) изменять структуру своих ядер с переходом более зрелых клеток в менее зрелые формы, что получило официальное название спонтанной БТЛ, - мы решили изучить особенности ответной реакции лимфоцитарного ростка на общее острое облучение по результатам исследования динамики показателей предложенной нами ЛфГр. Для этого мы исследовали ЛфГр на протяжении 30 суток у белых беспородных крыс, подвергнутых общему относительно равномерному гамма-облучению в разных дозах, сформировавших интересующие нас различные клинические формы ОЛС: субклиническую форму,
Степень тяжести ОЛС Показатель, М±т, (х 109/л)
до облучения после облучения, часы (сутки)
6 24 (1) 48 (2) 144 (6) 240 (10) 480 (20) 720 (30)
Ложное облучение (п=9) 2,56±0,41 2,49±0,29 ( 3) 3,45±0,23 (+35) 3,46±0,68 (+35) 2,35±0,35 ( 8) 2,64±0,51 (+3) 2,54±0,34 ( 1) (9 І І+ ),
ОЛС, субкли-ническая форма (п=8) 2,82±0,47 0,82±0,26* ( 71) 2,84±0,78 (0) 2,89±0,49 (+2) 2,84±1,01 (0) 2,27±0,47 ( 20) Зі? ), 72 2,32±0,52 ( 18)
ОЛС I степени тяжести (п=7) 2,46±0,24 2,18±0,11 ( 11) 1,35±0,17* ( 45) 2,26±0,40 ( 8) 1,12±0,11* ( 54) 1,89±0,23 ( 23) 1,93±0,24 ( 22) 2,49±0,39 (+1)
ОЛС II степени тяжести (п=5) 2,68±0,33 4,75±0,54* (+77) 1,77±0,32* ( 34) 1,66±0,13 ( 38) 0,62±0,08* ( 77) 0,85±0,18* ( 68) 2,38±0,46 ( 11) 2,63±0,31 ( 2)
ОЛС III степени тяжести (п=4) 1,81±0,24 3,58±1,38 (+98) 2,26±0,40 (+25) 2 £ ), 92 0,38±0,08* ( 79) 0,59±0,21* ( 67) 5,94±2,81 (+228) 3,86±0,28* (+113)
ОЛС IV степени тяжести (п=5) 2,78±0,24 6,11±0,90* (+120) 1,11±0,17* ( 60) 1,81 ±0,30 ( 35) 0,10±0,05* ( 96) 0,09±0,00* ( 97)
ОЛС I степени тяжести, II, III и IV степеней тяжести. Часть крыс составила контрольную группу интактных животных после ложного облучения, дополнительно три особи для сравнения испытали неспецифический стресс в виде интенсивного шума. Клеткам в составе ЛфГр нами были присвоены следующие обозначения: К-
1 - лимфобласт, К-2 - пролимфоцит, К-3 - лимфомоноцит, К-4 -стимулированный лимфоцит, К-5 - малый узкоцитоплазменный лимфоцит, К-6 - широкоцитоплазменный лимфоцит, К-7 - плаз-мобласт, К-8 - плазмоцит (табл. 1).
На первом этапе мы проанализировали процентное и абсолютное содержание каждой субпопуляции лимфоцитов во всех обозначенных группах при начальном исследовании. Оказалось, что у животных в исходном положении независимо от облучения содержание лимфобластов и плазматических элементов было низким (доли процента), или эти клетки в ПК вовсе отсутствовали. Относительное содержание других субпопуляций колебалось в узких пределах: пролимфоцитов - от 1,27 до 2,75%, лимфомоноци-тов - от 2,0 до 3,18%, узкоцитоплазменных лимфоцитов - от 84,82 до 87,89%. Несколько большим разброс был в ряду широкоцито-плазменных лимфоцитов - от 0,5 до 3,67%. В ходе дальнейшего исследования наибольший интерес вызвала динамика процентного содержания элементов БТЛ, а именно субпопуляции стимулированных лимфоцитов (К-4) и конечного звена БТЛ - «бластов» -лимфомоноцитов, пролимфоцитов и лимфобластов (К-3, К-2, К-1). В связи с чем для более компактного изложения мы объединили последние три элемента в таблицах в одну группу.
У животных, облученных в малой дозе (1 Гр) с развитием субклинической формы ОЛС (табл. 3), уже с первых часов после облучения наблюдалось достоверное снижение общего числа лимфоцитов за счет К-5, которое не восстанавливалось до исходных значений и на 30-е сутки наблюдения. Одновременно отмечалась активизация процесса БТЛ, выразившаяся в достоверном увеличении после облучения относительного содержания К-4 (через 6 ч, 2 и 10 суток) и группы бластов (К-1, К-2, К-3), существенном в интервале 6-20 суток. При этом среднее абсолютное содержание лимфобластов (К-1) оставалось недостоверно повышенным до конца эксперимента, а абсолютное число К-3 через 20 суток после облучения в этой группе было вдвое выше исходного уровня. С возрастанием дозы общего облучения и утяжелением клиники ОЛС у крыс во всех группах наблюдались практически однотипные изменения показателей ЛфГр. В абсолютном исчислении с первого часа и до 20 суток пострадиационного периода падало общее содержание лимфоцитов вместе с числом К-5 и «переходных» форм лимфоцитов (К-4, К-3, К-2). Процесс восстановления при ОЛС I и II степеней тяжести начинался с 10 суток, а при ОЛС III степени тяжести - с 20 суток пострадиационного периода с увеличения содержания К-5. Но и после 30 суток нормализации показателелй не происходило. При крайне тяжелой форме ОЛС восстановления не наблюдалось. Если же рассматривать только динамику процентного содержания элементов БТЛ, то уже с первых часов после облучения у крыс всех экспериментальных групп отмечалось увеличение удельного веса стимулированных лимфоцитов, а также «бластов». На 6 сутки (при легчайшей форме поражения - через 2 суток, при крайне тяжелой -уже через 6 ч) в ряде случаев это увеличение оказывалось существенным. Абсолютное количество лимфоцитов с трансформированными ядрами (от К-4 до К-1) во всех группах облученных крыс, за исключением ОЛС IV степени тяжести, через 30 сутки достигало исходных значений, хотя число К-5 оставалось пониженным. Только в группе с крайне тяжелой формой ОЛС количество бластных форм снижалось до исчезновения. Это означает, что стимуляцию БТЛ следует рассматривать как защитную реакцию, которая исчезает накануне гибели облученного организма.
В группах животных, не подвергавшихся облучению, но испытавших неспецифические воздействия (это животные, пережившие, помимо ложного облучения, непродолжительный стресс, связанный с иммобилизацией и взятием крови из хвоста, и крысы, подвергнутые воздействию интенсивного шума), уже через 1 ч после воздействия, как и у животных после облучения, отмечалось заметное (в группе с ложным облучением - достоверное) снижение числа лимфоцитов за счет относительного и абсолютного уменьшения количества К-5 (функционально более активных клеток), которое не вернулось к исходному уровню до конца наблюдения, а также тенденция к увеличению удельного веса (у крыс после воздействия шума также и абсолютного содержания) бласттрансформированных форм лимфоцитов.
Таким образом, стимуляцию БТЛ на фоне более или менее выраженного снижения содержания лимфоцитов можно рассматривать как неспецифическое проявление гематологического стресс-синдрома и как реакцию, имеющую, по-видимому, защитное значение для организма. О стимуляции БТЛ под влиянием различных воздействий, включая ИИ, упоминают и другие авторы. Предполагается также, что стимуляция БТЛ крови является одним из компонентов защитного действия радиопротекторов [15]. При различных неблагоприятных воздействиях, особенно под влиянием ионизирующих излучений, закономерно регистрируется реакция ПК в виде нарастания числа нейтрофильных гра-нулоцитов преимущественно за счет МСЯН.
Таблица 3
Динамика показателей лимфоцитограммы у крыс с клиникой субклинической формы острого лучевого синдрома (облучение в дозе 1 Гр), п=8
Примечание: * - различия с исходным параметром достоверны, р<0,05
(в скобках - отклонение от исходного параметра в процентах)
Заключение. У животных разных видов в течение первых часов-суток после острого общего облучения в сублетальных дозах наблюдается повышение относительного и абсолютного содержания МСЯН, которое нельзя объяснить только одним механизмом - поступлением этих клеток из кровяных депо. Де-маргинация нейтрофилов из сосудистого ложа в эти сроки после облучения невозможна из-за возрастания адгезии нейтрофилов, а в КМ присутствует блок митозов. Цитохимические исследования доказывают наличие у МСЯН более низкого уровня функциональной активности со снижением всех видов энергетического обмена с одновременным повышением неспецифической и специфической резистентности организма в целом.
Динамика показателей МнГр под влиянием общего облучения указывает на то, что уровень реактивности системы фагоцитирующих мононуклеаров непрерывно меняется, что является важным механизмом адаптации организма к возникающим повреждениям. Конкретно сдвиг в МнГр в сторону неактивных и малоактивных моноцитов в течение экстремального воздействия характеризует благоприятную смену уровня реактивности организма. На примере динамики показателей нейтрофилов и МнГр у экспериментальных животных после тотального облучения в разных дозах можно заключить, что снижение функциональной активности клеток крови играет роль защитной реакции и способствует повышению радиорезистентности организма.
Общее облучение животных в сублетальных дозах закономерно вызывает снижение общего числа лимфоцитов (интенсивность и длительность лимфоцитопении зависит от степени тяжести ОЛС) с одновременным возрастанием в ЛфГр количества элементов с трансформированными ядрами. Принято считать, что наиболее функционально активными клетками среди субпопуляций лимфоцитов являются малые узкоцитоплазменные лимфоциты, способные трансформироваться в «бласты». Лимфобласты, пролимфоциты и другие «молодые» формы относят, соответственно, к функционально малоактивным элементам. Повышенное количество таких лимфоидных клеток содержится в крови младенцев и, очевидно, не случайно [21]. Отсюда вытекает, что стимуляция БТЛ с увеличением в крови количества малоактивных
Срок после облучения Число лимфоцитов, х109/л Общее содержание бластных клеток (К-1, К-2, К-3) Стимулированные лимфоциты (К-4) Узкоцитоплазменные лимфоциты (К-5)
% х109/л % х109/л % х10у/л
Исходные данные 16,261±1,335 4,0±0,6 0,660±0,127 9,13±1,53 1,515±0,316 85,0±1,67 13,775±1,105
Через 1 ч 10,60±2,017* (-35) 6,20±1,83 (+55) 0,584±0,134 (-12) 12,0±1,3 (+31) 1,191±0,175 (-21) 79,80±3,31 (-6) 8,539±1,705* (-38)
Через 6 ч 6,123±1,762* (-62) 7,67±3,67 (+92) 0,406±0,141 (-38) 16,67±2,60” (+83) 1,097±0,469 (-28) 74,67±4,91 (-12) 4,575±1,344* (-67)
Через 1 сут 7,921±3,805 (-51) 5,0±1,0 (+25) 0,358±0,111 (-46) 10,0±3,0 (+10) 0,678±0,143 (-55) 78,5±4,5 (-8) 6,389±3,343 (-54)
Через 2 сут 7,71±2,47* (-53) 11,0±4,0 (+175) 0,767±0,223 (+16) 20,33±1,76* (+123) 1,627±0,638 (+7) 63,67±2,85* (-25) 4,953±1,689* (-64)
Через 6 сут 8,093±1,270* (-50) 11,25±1,08* (+181) 0,941±0,218 (+43) 13,63±1,95 (+49) 1,173±0,378 (-23) 73,0±2,62* (-14) 5,817±0,770* (-58)
Через 10 сут 10,109±1,419* (-38) 8,75±0,75* (+285) 0,914±0,200 (+38) 15,13±0,44* (+66) 1,516±0,208 (0) 73,25*±1,11 (-14) 7,386±1,010* (-46)
Через 20 сут 12,072±0,969* (-26) 8,00±0,94* (+100) 0,959±0,114 (+45) 12,75±1,99 (+40) 1,608±0,373 (+6) 76,63±1,86' (-10) 9,209±0,697* (-33)
Через 30 сут 11,208±1,929 (-31) 3,88±0,88 (-3) 0,358±0,091 (-46) 12,50±1,61 (+37) 1,461±0,381 (-4) 82,88±1,61 (-2) 9,288±1,607 (-33)
лимфоцитов тоже является защитной реакцией. Накануне гибели облученного организма она исчезает. Регистрация аналогичных изменений в ПК крыс, подвергнутых ложному облучению или воздействию интенсивного шума, указывает на неспецифическую природу этой реакции.
Таким образом, на любое экстремальное воздействие система крови отвечает первоначальным увеличением в кровотоке числа лейкоцитов с пониженной функциональной активностью, что играет роль охранительного торможения с понижением чувствительности таких клеток к разнообразным стимулам и к повреждающему фактору. Эта защитная клеточная реакция реализуется путем изменения формы ядра всех форм лейкоцитов в сторону дедифференцировки («омоложения»). Запускается она гуморальным путем в результате появления в крови продуктов распада клеток и накопления в русле крови различных биологически активных веществ, которые служат стимулом для соответствующих компартментов системы кроветворения.
Литература
1. Акоее, И.Г. Биофизический анализ предпатологических и предлейкозных состояний / И.Г. Акоев, H.H. Мотлох.- М.: Наука, 1984. - 134 с.
2. Аксенова, Н.В. Экспериментальное обоснование использования интерлейкина-lß при различных вариантах радиационного воздействия: автореф. дис. ... канд. мед. наук/ Н.В. Аксенова; Воен.-мед. акад. им. С.М. Кирова.- СПб., 2004.- 28 с.
3. Антонишкис, Ю.А. Изменения лимфоцитограммы у крыс в процессе развития лучевого поражения / Ю.А. Антонишкис,
А.Н. Гребенюк, В.И. Легеза, Ю.В. Лобзин, A.A. Несмеянов // Приложение к журналу Межакадемический Информационный Бюллетень «Международная Академия».- 2011.- Вестник № 3 (57).- С. 65-76.
4. Антонишкис, Ю.А. Закономерность формирования защитной реакции нейтрофильных гранулоцитов системы крови человека и животных под воздействием окружающей среды: науч. открытие / Ю.А. Антонишкис, Ю.В. Лобзин, A.A. Несмеянов, A.C. Свистов // Диплом № 359 Международной академии авторов научных открытий и изобретений от 25.04.2008 г., Москва, регистр. № 449.
5. Антонишкис, Ю.А. Моноцитограмма как способ функциональной оценки системы мононуклеарных фагоцитов после радиационного воздействия / Ю.А. Антонишкис // Вестник Рос. Воен.-мед. акад. - 2008.- № 2 (22). - Приложение 2-с. - С. 243254.
6. Антонишкис, Ю.А. Сегментация ядер нейтрофилов как компенсаторная реакция системы крови на воздействие ионизирующего излучения / Ю.А. Антонишкис // Мед. радиол. и радиац. безопас. - 2006. - Т. 51, № 6. - С. 5-10.
7. Антонишкис, Ю.А. Сегментация ядер нейтрофилов: новый взгляд на природу явления / Ю.А. Антонишкис // Клин. лаб. диагностика. - 2006. - № 8. - С. 22-25.
8. Структурные основы адаптации и компенсации нарушенных функций: Руководство / Л.И. Аруин [и др.]; под ред. Д.С. Саркисова. - М.: Медицина, 1987. - 448 с.
9. Белъский, С.Н. Гематологические и иммунологические показатели у лиц, принимавших участие в ликвидации последствий аварии на ЧАЭС / С.Н. Вельский, Г.К. Ларченко // Актуальные проблемы разработки медицинских средств и методов сохранения и восстановления боеспособности личного состава Вооруженных Сил: сб. тез. докл.; под ред. Ю. Погодина. - Л., 1994. - С. 11-12.
10. Владимиров, В.Г. Унитарная гипотеза механизма действия радиопротекторов / В.Г. Владимиров, И.И. Красильников // Военная медицина. Проблемы профилактики, диагностики, лечения экстремальных состояний: сб. ст.; под ред. И.М. Чижа. - М.: Воениздат, 1994. - С. 15-33.
11. Вовк, О.И. Морфофункциональное состояние лимфоцитов периферической крови у ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС / О.И. Вовк, С.А. Степаньков, И.Б. Тонкопий, Ю.Л. Пьянкова // Актуальные вопросы военнополевой терапии: тез. Всеармейск. конф. 15-17 мая 1997 г.; под общ. ред. А.Л. Ракова и А.Е. Сосюкина. - СПб., 1997. - С. 77.
12. Гаркави, Л.Х. Адаптационные реакции и резистентность организма / Л.Х. Гаркави, Е.Б. Квакина, М.А. Уколова. - 3-е изд., перераб. и доп. - Ростов н/Д.: Изд-во Ростов. ун-та, 1990. - 224 с.
13. Гогин, Е.Е. Сочетанные радиационные поражения / Е.Е. Гогин, В.М. Емельяненко, Б.А. Бенецкий, В.Н. Филатов. - М.: ППО «Известия», 2000. - 240 с.
14. Гребенюк, А.Н. Функционально-метаболический статус нейтрофильных гранулоцитов периферической крови в условиях воздействия экстремальных факторов радиационной природы: дис. ... канд. мед. наук / А.Н. Гребенюк; Воен.-мед. акад. им. С.М. Кирова. - СПб., 1995. - 246 с.
15. Нейтрофил и экстремальные воздействия /
A.Н. Гребенюк [и др.]; под ред. А.Н. Гребенюка и В.Г. Бовтюшко. - СПб., 1998. - 216 с.
16. Григорова, О.П. Роль моноцитарной системы в реактивности организма / О.П. Григорова. - М.: Медгиз, 1958. - 106 с.
17. Данилов, Р.К. Раневой процесс: гистогенетические основы / Р.К. Данилов. - СПб., ВМедА, 2007. - 380 с.
18. Мазурик, В.К. Некоторые биохимические детерминанты и маркеры радиорезистентности организма млекопитающих /
B.К. Мазурик, В.Ф. Михайлов // Радиац. биология. Радиоэкология. - 1997. - Т. 37, вып. 4. - С. 512-521.
19. Руководство по использованию лабораторных животных для научных и учебных целей в СПб ГМУ им. академика И.П. Павлова. - СПб.: ГМУ им. И.П. Павлова, 2003. - 57 с.
20. Саркисов, Д. С. Очерки по структурным основам гомеостаза / Д.С. Саркисов. - М.: Медицина, 1977. - 351 с.
21. Тодоров, Й Клинические лабораторные исследования в педиатрии / И. Тодоров. - 6-е рус. изд.; пер. с болгар. под ред. Г.Г. Газенко. - София: «Медицина и физкультура», 1968. - 1064 с.
22. Фрейдлин, И.С. Система мононуклеарных фагоцитов / И.С. Фрейдлин. - М.: Медицина, 1984. - 272 с.
23. Яковлев, Г. М. Резистентность, стресс, регуляция / Г.М. Яковлев, B.C. Новиков, В.Х. Хавинсон. - Л.: Наука, 1990. - 238 с.
24. Chinda, Daisuke. A competitive marathon race decreases neutrophil functions in athletes / Daisuke Chinda, Nacaji Shigeyuki, Umeda Takashi et al. // Luminescence. - 2003. - Vol. 18, No. 6. - P. 324-329.
25. Horvat, D. The combined use cytogenetic, haematological and capillaroscopic data for estimation of radiation damage / D. Horvat, R. Rozgaj, J. Racic // 3rd Int. Symp. Proc.: Radiol. Prot. - Adv. Theory and Pract., Inverness, 6-11 June, 1982. - Berkeley, 1982. -Vol. 1. - P. 376-380.
26. Lance, E.M. Immunosuppression / E.M. Lance // Immunology for surgeons; ed. by S.L. Castro. - Waschington, 1976. - P. 229257.
NEW REPRESENTATIONS ABOUT THE MECHANISM OF PROTECTIVE
REACTION OF BLOOD CELLS ON EXTREME INFLUENCE
YU.A. ANTONISHKIS, YU.V. LOBZIN, A.A. NESMEYANOV,
A.A KHADARTSEV, V.M. YESKOV
Military Academy after S.M. Kirov, Institute of Military Medicine, Research Centre of Medico-Biological Protection Tula State University, Medical Institute Surgut State University
On the basis of the review of the literature and own experiments with the general gamma irradiation of animals (white rats, porpoises) in different doses, using special methods hematological researches (the nuclear formula of neutrophils, monocytogramme, lymphocito-gramme), authors have described the mechanism of protective reaction of system of blood unknown earlier during the first hours and days from the beginning of any extreme influence. It rather turns out that protective reaction is in dedifferentiation of all kinds of leucocytes with making a part of ripe cells and less ripe which are functionally non-active or with low activeness and therefore differ from decreased sensitiveness to pathologic stimuli. In its turn it serves as an explanation of the rise of organism's non-specific and specific resistance in this period. The morphologic expression of such cells' transformation (differentiation) is nuclear form's alteration. Similarly the same reason of initial neutrophils at extremal effect with increase of relative poly-segmental neutrophils in the course of blood is the shift of the part of poly-segmental neutrophils in the state of mono-segmental neutrophils, which possess the lowest indices of functional activeness and energetic exchange.
Key words: general beam syndrome, neutrophils, monocytes, lymphocytes, leukocytes nuclear transformation, protective reaction of blood.
