Новые направления в газохроматографическом анализе фармацевтических препаратов Текст научной статьи по специальности «Математика»

УДК 661.12+543.544

Новые направления в газохроматографическом анализе фармацевтических препаратов*

Н. Сноу

1

НИКОЛАС СНОУ (Nicholas Н. Snow) — профессор кафедры химии и биохимии Университета г. Сетон Холл (США). Область научных интересов: газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография, пробоподготовка, фармацевтический анализ, анализ полимеров с молекулярными отпечатками.

Department of Chemistry and Biochemistry, Seton Hall University, 400 South Orange Avenue, South Orange, N J 07079, 973-761-9035 (ph), 973-761-9772 (fax), E-mail [email protected]

Газовая хроматография, оформившаяся как инструментальный метод примерно 50 лет назад

[1], стала одним из наиболее широко используемых методов анализа в различных областях промышленности. Высокое разрешение, отличная чувствительность, возможность количественных определений и легкость применения — все эти качества выделяют ее среди остальных аналитических методов. Используя высокоэффективные капиллярные колонки, можно достичь эффективности разделения в сотни тысяч теоретических тарелок и чувствительности на пикограммо-вом уровне. Газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией стала мощным рутинным средством разделения и идентификации. Нашла она свое применение и в фармацевтической промышленности. Основное приложение газовой хроматографии в фармацевтической промышленности — это анализ летучих органических примесей в фармацевтических продуктах. На основании литературного поиска можно заключить, что хотя на фармацевтических фирмах проводится большое количество хроматографиче-ских анализов, публикуется только незначительная часть этих работ. Из последних публикаций, посвященных некоторым современным приложениям газовой хроматографии, отметим обзор

[2]. В этой работе рассматриваются новые приемы в газовой хроматографии, которые можно применить к аналитическим задачам в фармацевтической промышленности.

В настоящее время в качестве метода разделения лекарственных веществ и сырья доминирует ВЭЖХ, а газовая хроматография нашла применение как дополнительный метод подтверждения

* Перевод с английского докт. хим. наук A.A. Курганова.

результатов ВЭЖХ и как основной метод анализа примесей, в первую очередь легколетучих веществ, таких как остатки растворителей.

В данной статье рассмотрены три аспекта приложения газовой хроматографии в фармацевтической промышленности: быстрый анализ остаточных растворителей, твердофазная микроэкстракция лекарственных веществ и темпера-турно-программируемое введение пробы при анализе фармацевтических препаратов.

Быстрый газохроматографический анализ остаточных растворителей

Анализ остаточных растворителей, которые могут присутствовать в фармацевтических продуктах, промежуточных соединениях и сырье, является в настоящее время основным приложением газовой хроматографии в фармацевтической промышленности. Практически все нормативные акты, утвержденные национальными и международными регулирующими организациями, предписывают проведение такого анализа для всех фармацевтических продуктов, выпускаемых на рынок. В США фармацевтический анализ регламентируется Американской фармакопеей, метод иБР 467 [3]. Этот метод содержит методические указания по определению наиболее токсичных растворителей и дает специальные рекомендации по выбору колонок, хроматографов, детекторов и экспериментальных параметров. Аналогичные методы включают фармакопеи других государств, как, например, Европейская фармакопея [4] и Японская фармакопея [5]. Но надо сказать, что ни один из этих методов не является всеобъемлющим, и они

многократно критиковались за несоответствие современным методам и технологиям. В 1997 году Международная конференция по гармонизации (МКГ) обнародовала новые нормы, которые объединяют и расширяют нормы, представленные различными национальными фармакопеями и регулирующими организациями. Нормы МКГ охватывают около 80 растворителей и подразделяют их на четыре группы:

1) растворители, которые не следует применять (высокотоксичные);

2) растворители средней токсичности;

3) нетоксичные растворители;

4) растворители неизвестной токсичности.

По содержанию остаточных растворителей МКГ разделяет их на три класса (см. таблицу). Следует заметить, что необходимость соблюдения норм МКГ создает значительно более сложную аналитическую проблему в отношении анализа остаточных

растворителей, чем предшествующие нормативные акты. Согласно данным МКГ, содержание растворителей в фармацевтических продуктах может составлять 2—5000 ррш. Кроме того, анализу и регулированию подлежат многие из тех растворителей, как, например диметилсульфоксид, которые традиционно используются в качестве разбавителей в аналитических методах. В то же время МКГ не выдвигает каких-либо особых требований к колонкам и методам.

Остаточные растворители в фармацевтике обычно определяют путем растворения пробы в соответствующем растворителе и его последующего анализа методом газовой хроматографии с прямым вводом пробы или паровой фазы. Типичная методика с использованием статической экстракции паровой фазы представлена в работе [6]. В этой работе описан общий метод для анализа всех 30 растворителей, применяемых в про-

Таблица

Классификация остаточных растворителей по содержанию в фармацевтических продуктах.

Нормативы Международной конференции по гармонизации

Класс 1 (2—1500 ррш)

Класс 2 (50—4840 ррш)

Класс 3(5000 ррш)

Бензол

Четыреххлористый углерод 1,2-Дихлорэтан 1,1 -Дихлорэтилен 1,1,1 -Трихлорэтан

Ацетонитрил

Хлорбензол

Хлороформ

Циклогексан

1,2-Дихлорэтилен

Дихлорметан

Диметоксиэтан

Т^,Т^-Диметилацетамид

Т^,>}-Диметилформамид

1,4-Диоксан

2-Этоксиэтанол

Этиленгликоль

Формамид

Гексан

Метанол

2-Метоксиэтанол

Метилбутилкетон

Метилциклогексан

И-Метилпирролидон

Нитрометан

Пиридин

Сульфолан

Тетралин

Толуол

1,2,2-Трихлорэтилен Ксилол

Уксусная кислота

Ацетон

Анизол

Бутанол-1

Бутанол-2

Бутилацетат

Метил-/ире/и-бутиловый эфир Кумол

Диметилсульфоксид Этанол Этил ацетат Диэтиловый эфир

Этиловый эфир муравьиной кислоты

Муравьиная кислота

Гептан

Изобутилацетат

Изопропилацетат

Метилацетат

З-Метилпропанол-1

Метилэтилкетон

Метилизобутилкетон

2-Метилпропанол-1

Пентан

Пентанол-1

Пропанол-1

Пропанол-2

Пропилацетат

Тетрагидрофуран

изводстве. Разделение осуществляется на длинной капиллярной колонке с толстым слоем неподвижной фазы. Продолжительность одного анализа примерно 1 час. Методика хорошо опробована и широко используется во всем мире для многих приложений. В реальных анализируемых пробах обычно присутствуют от 3 до 6 растворителей из 30, и предложенный общий метод позволяет использовать одни и те же условия анализа независимо от конкретного растворителя и фармацевтического препарата.

Разработаны новые приемы быстрых газохро-матографических разделений |7—9]. Многие из них, такие как Е7-Р1а811™, позволяют использовать широкий набор колонок, и выбор их определяется самим покупателем, что, однако, может привести к проблемам с регулирующими органами. В других методах, менее пригодных для хро-матографирования с быстрым программированием температуры, рекомендуется использование только коротких колонок и модифицированных стандартных устройств.

На рис. 1 показаны результаты быстрого анализа типичной смеси шести остаточных растворителей в фармацевтической пробе с использованием хрома-тографической системы Ег-РМт™. Анализ заканчивается примерно за 15 с. Временной интервал между двумя анализами, включая ввод пробы с делением потока, составляет примерно 4 мин (сюда же входит время на нагрев и охлаждение колонки с целью очистки). Следует отметить, что разделение смеси полностью происходит за время изотермической части температурного градиента. Это указывает на то, что основная польза от скоростной газовой хроматографии состоит, возможно, в быстром температурном программировании цикла очистки колонки между процедурами анализа.

0 0,05 0,10 0,15

Рис. 1. Результаты быстрого газохроматографического анализа шести растворителей методом EZ-Flash:

У — этанол; 2 — этилацетат, 3 — бутанол-1; 4 — гептан; 5— толуол, 6— М,М-диметилформамид; 7— ди-метилсульфоксид (разбавитель).

Газ-носитель — гелий; ввод пробы: деление потока 100:1, давление -1,5-Ю3 Па; капиллярная колонка 5 м х 0,25 мм х 0,25 мкм Rtx-5 (подготовлена для скоростной хроматографии, ThermoOrion, Chelmsford, МА); программирование температуры: 20 с при 40 "С, затем подъем температуры до 300 "С за 1 мин; пламенно-ионизационный детектор, 300 °С

Потенциальные возможности скоростной газовой хроматографии с точки зрения эффективности разделения и использования в рутинном анализе ярко демонстрирует хроматограмма, показывающая разделение всего семейства остаточных растворителей класса 2 по МКГ (рис. 2). Разделение проводили на длинной колонке в условиях быстрого программирования температуры. Продолжительность разделения всех 28 компонентов составила примерно 4 мин. Общее время между двумя анализами примерно 8 мин.

Быстрая газовая хроматография потенциально может также значительно увеличить производи-

0 0.5 1,0 1,5 2 2,5 3

Рис. 2. Результаты быстрого газохроматографического анализа растворителей класса 2.

Газ-носитель — гелий; ввод пробы: 300 "С, деление потока 80:1, давление ~3 • 103 Па, колонка 25 м х 0,25 мм х 0,25 мкм HP-5MS; программирование температуры: 40 °С/1 мин, 5 °С/мин до 45 "С, 160 °С/мин до 300 "С; пламенно-ионизационный детектор, 300 °С, 100 Гц

тельность анализа остаточных растворителей в фармацевтических препаратах. Но здесь решающее значение имеет пробоподготовка, и возможности скоростной газовой хроматографии будут в значительной степени ограничены в случае сложной длительной пробоподготовки. В связи с этим заметим, что часто пользователи сами вносят некоторые изменения в системы для скоростной газовой хроматографии, поскольку в оригинальной форме они оказываются неработоспособными в условиях, предписываемых нормативными требованиями регулирующих органов.

Пробоподготовка методом

твердофазной экстракции

Для целей пробоподготовки все возрастающий интерес вызывает экстракция твердофазными экстрагентами. Доминирующая роль здесь принадлежит твердофазной микроэкстракции [10]. Эта операция детально описана в работе Павли-цына (Pavlizyn) [11], а также в многочисленных публикациях (более 500), собранных в руководстве, изданном фирмой «Supelco, Inc.» [12].

Имеющийся опыт использования твердофазной микроэкстракции в анализе лекарственных препаратов относится в основном к клинической и судебно-медицинской практике. Но данный метод может быть использован и в анализе лекарственных препаратов в фармацевтической промышленности. Заметим, что твердофазная микроэкстракция была эффективно использована именно при анализе остаточных растворителей [13].

Развитием этой техники пробоподготовки являются экстракция сорбентом, заполненным в капилляр, [14] и сорбционная экстракция при перемешивании [15]. Основная проблема применения этих методов в фармацевтической промышленности связана с тем, что обычная система пробоподготовки, имеющаяся в продаже, плохо приспособлена для работы в строгих нормированных условиях и, чтобы удовлетворять этим нормам, она должна быть автоматизирована. Недавно была представлена эффективная автоматизированная система пробоподготовки для твердофазной микроэкстракции Combi-PAL (CNI Ind., Швейцария). Следует заметить, что система Combi-PAL также пригодна для парофазной и жидко-жидкостной экстракции с последующим введением пробы в хроматографиче-скую колонку посредством шприца.

Пример использования твердофазной микроэкстракции в анализе фармацевтических препаратов продемонстрировали Карайц и Сноу [16], которые изучали процесс деградации дифенгидр-амина (обезболивающее средство) с проведением анализа по схеме твердофазная микроэкстракция — газовая хроматография/масс-спектрометрия. Показано, что твердофазная микроэкстракция является эффективным средством извлечения

/

2

4

3

к А. л л_1, i.......-л........ 1 1

12,0 13,0 14,0 15,0

Рис. 3. Результаты хромато-масс-спектрометрического анализа эстрогенов, модифицированных триметилхлор-силаном (ТМС) после экстракции на волокно:

/ — 17-р-эстрадиол-ТМС; 2 — 17-р-эстрадиол-ди-ТМС; 3 — син-норгестримат-ТМС; 4 — анти-норгестримат-

тмс

как основного вещества, так и продуктов разложения при исследовании деградации (термической, кислотной и основной).

Приведем пример хромато-масс-спектромет-рического анализа эстрогенных гормонов с использованием твердофазной экстракции [17]. Эстрогены из противозачаточных таблеток экстрагировали на кондиционированные поли-акрилатные волокна (85 мм, Supelco, Беллафон-те, ПА), затем выделенные на волокне эстрогены модифицировали триметилхлорсиланом, полученные производные десорбировали и анализировали на системе газовый хроматограф/масс-спектрометр (рис. 3).

Автоматический анализ был проведен с использованием автоматического пробоотборника модели FOCUS (ATAS, Файерфвд, ОХ) на приборе модели 6890/5973, снабженном системой обработки данных (Agilent Technologies, Вил-мингтон, ДЕ). Газовый хроматограф был оборудован устройством ввода пробы с программированием температуры, модель Optic II PTV (ATAS, Файерфид, ОХ). Для разделения использовалась капиллярная колонка 15 м х 0,25 мм х 0,1 мм DB-5HT (J+W Scientific, Folsom, СА). Анализ начинался при 40 °С (3 мин), затем температура поднималась со скоростью 20 °С/мин до 300 °С. Полное время анализа составило 18 мин. В качестве газа-носителя использовался гелий. Условия ввода пробы в колонку: давление -1,5-Ю3 Па, 250 °С, расход газа-носителя 150 мл/мин (с делением потока). Температура интерфейса к масс-спектрометру составляла 280 °С.

Экстракцию эстрогенов проводили путем погружения в водный раствор пробы волокна при 50 °С на 5 мин. Перемешивание достигалось за счет вращения пробника. Следующую стадию — модификацию эстрогенов на волокне — осуще-

ствляли в герметичном пробнике для парофаз-ного анализа, куда помещалось 500 мкл чистого бис(триметилсилил)трифторацетата; волокно выдерживали в течение 10 мин при 50 °С. Соотношение количеств производного и исходного вещества контролировалось температурой и продолжительностью реакции при пост-экстракционной модификации.

Основное преимущество данного метода — возможность автоматизированного анализа полярных лекарственных веществ при легко контролируемых условиях модификации, в отличие от анализа с обычными методами модификации, когда неизбежно возникает проблема воспроизводимости результатов.

Введение пробы с программированием температуры инжектора

При анализе фармацевтических препаратов методом газовой хроматографии обычно сталкиваются с той проблемой, что вследствие контакта пробы с устройством ввода или с неподвижной фазой, в результате термического разложения или просто из-за недостаточной летучести анализируемое вещество не может эффективно транспортироваться через хроматографическую систему и, следовательно, не будет обнаружено детектирующим устройством. Реализация классических методов введения пробы, с делением потока и без деления, является одной из основных составляющих этой проблемы. О серьезности этой проблемы говорит тот факт, что Гроб [18] посвятил 600 страниц вопросам оптимизации устройств ввода пробы.

Для преодоления трудностей введения пробы в отсутствие деления потока Borr [19] в 1979 г. предложил метод введения пробы с программированием температуры инжектора. Однако до конца 1980-х годов, пока инжекторы с программированием температуры не стали коммерчески доступными, метод оставался мало распространенным и даже сегодня он еще не получил широкого применения. Принцип метода состоит в том, что проба вводится в охлажденный инжектор (обычно это стеклянный лайнер, заполненный сорбентом), который затем быстро нагревается (8 °С/с) без деления потока, что вызывает десорбцию пробы и переносит ее в колонку. По данному методу введения пробы опубликовано практическое руководство [20].

Основными преимуществами метода введения пробы замораживанием перед традиционным способом введения проб в горячий инжектор (с делением потока или без деления) являются отсутствие дискриминации компонентов пробы в игле шприца и уменьшение разложения пробы в инжекторе. Кроме того, при программировании температуры инжектора появляется возможность достичь более высокой температуры, чем темпе-

ратура колонки, которая обычно ограничена -350 °С. Стандартный инжектор с программированием температуры может нагреваться до 600 °С. Это позволяет вводить в колонку значительно большую пробу или пробу менее летучего соединения, чем это возможно в случае обычного инжектора. В сочетании с инжектором, функционирующем при программировании температуры, может использоваться колонка с тонким слоем стационарной фазы, что улучшает испарение труднолетучих компонентов.

Описанный метод особенно перспективен для практики анализа полимеров и добавок к полимерам. Примеры подобных разделений можно найти в работах Ван Лишоута с сотр. [21] и Ланкастера с сотр. [22]. В [21] сообщается об использовании инжектора при температуре около 600 °С, что позволяет десорбировать полимерные добавки из матрицы. При этом колонку нагревали до 425 °С. В качестве примера на рис. 4 приведена хроматограмма добавок в полимере, полученная хромато-масс-спектрометрическим методом с применением инжектора с программированием температуры.

Число публикаций, посвященных применению инжекторов с программированием температуры в анализе фармацевтических препаратов в промышленности, невелико, но имеется много публикаций по анализу лекарственных веществ этим методом в различных клинических и биологических матрицах (см., например, [23]). В работе [24] изучали условия и некоторые параметры ввода пробы (линейность, стабильность) при анализе лекарственных веществ из биологических жидкостей. В экспериментах использовали различные сорбенты для заполнения инжектора и различные растворители для ввода большого

1 5+6

3

4

L. . >. lJ-Jv^J 1

|

О 5 10 15 20

Время, мин

Рис. 4. Результаты анализа полимерных добавок хрома-то-масс-спектрометрическим методом с применением инжектора с программированием температуры:

7 — ионол СР; 2 — дрезинат; 3 — неизвестное вещество; 4 — циклический тример РВТ; 5 — ирганокс 1076; 6 - ирганокс РБ800

объема пробы лекарства, экстрагированного из плазмы твердофазной экстракцией Установлено, что большой объем пробы может улучшить чувствительность анализа При этом отмечается, что растворители и условия пробоподготовки должны выбираться очень тщательно, так как большой объем пробы приводит к усилению сигнала от примесей и загрязнений

Введение пробы прямо на колонку методом замораживания в фармацевтическом анализе продемонстрировано на ряде прекрасных примеров Сандрой и сотр [25] Они пришли к выводу, что введение пробы этим методом является лучшим тестом на определение, можно ли пробу анализировать газохроматографически, если другие методы в данном случае непригодны

Рассматриваемый метод введения пробы на колонку дает отличные результаты, но он может оказаться непригодным при условии соблюдения жестких требований, предписываемых регулирующими нормативами Многие фармацевтические пробы содержат примеси и посторонние вещества, которые могут испортить колонку при использовании метода ввода пробы замораживанием В одной из немногих опубликованных работ, непосредственно посвященной промышленному фармацевтическому анализу, [26] опробовали несколько методов введения пробы, включая замораживание пробы в колонке, для анализа нестойких эпоксидов В результате пришли к выводу о значительном снижении термического разложения эпоксида при использовании метода замораживания, что удалось установить при введении пробы без деления потока

* * *

Газовая хроматография как техника инструментального анализа используется уже более 50 лет, но ее потенциал еще не полностью реализован В фармацевтической промышленности для анализа лекарственных форм и примесей применяется ВЭЖХ, а газовая хроматография служит в основном для определения остаточных растворителей в продуктах, полупродуктах и сырье Новые варианты, такие как скоростная газовая хроматография, новые методы пробоподготовки, температурно-программируемая инжекция или введение пробы прямо на колонку могут расширить возможности газохроматографического анализа Основная проблема на пути внедрения этих новых методов и приемов в аналитическую практику фармацевтики связана с необходимостью адаптации их к жестким нормативным требованиям, гарантирующим качество фармацевтических продуктов Применение новых методов, которые стали теперь коммерчески доступными, наряду с исследовательскими данными и данными, подтверждающими компетентность этих ме-

тодов, которые тоже теперь доступны, позволяет надеяться, что газовая хроматография в скором времени займет значительно более солидное место в фармацевтической промышленности, чем то, которое она имеет сегодня

Автор выражает благодарность фирме «Johnson and Johnson Pharmaceutical Reseaich and Development, LLC» за оказанную финансовую помощь и консультации при выполнении данной работы

ЛИТЕРАТУРА

1 James А Т, Martin AJP Biochem J , 1952, v 50, p 679

2 Sandra P, David F, Szucs R TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2002, v 21, № 9/10, p 662-671

3 United States Pharmacopeia, Organic Volatile Impurities 2002, p 467

4 European Pharmacopeia, Organic Volatile Impurities 2002

5 Japanese Pharmacopeia, Organic Volatile Impurities 2002

6 De Smet M, Roels К, Vanhoof L , Lanwers W Pharm Forum, 1995, v 21, № 2, p 501-514

7 Dalluge J, Ou-aissa R, Vreuls J J e a J High Resolut Chromatogr, 1999, v 22, № 8, p 459-464

8 Van Lteshout M, Derks R, Janssen H-G, Cramers С Ibid , 1998, v 21, № 11, p 583-586

9 Korytar P, Janssen H-G ea TRAC Trends in Analytical Chemistry, 2002, v 21, № 9/10, p 558-572

10 Arthur CL, Pawhszyn J Anal Chem , 1990, v 62, p 2145

11 Pawhszyn J Solid Phase Micro-extraction Theory and Practice New York John Wiley and Sons, 1997

12 Applications of Solid Phase Micro-extraction, Bellfonte, PA Supelco, 2002

13 Scypmski S, Smith A In Solid Phase Micro extraction A Practical Guide Ed S A S Wercmski New York Dekker, 1999, pill

14 Mol H GJ, Janssen H-G, Cramers CA, Bnnkman UA Th J Microcol Sep , 1995, v 7, № 3, p 247-57

15 Baltussen E, Sandra P, David F, Cramers С Ibid, 1999, v 11, p 737

16 Karaisz K, Snow N Ibid , 2001, v 13, p 1-7

17 Snow NH In Applications of Solid Phase Micro extraction Ed J Pawhszyn London Royal Society of Chemistry, 1999, p 486-496

18 Grob К Jr , Split and Splitless Injection in Capillary Gas Chromatography Third Edition New York John Wiley and Sons, 1995

19 Vogt W, Jacob K, Obwexer H W J Chromatogr , 1979 v 174, p 437-449

20 Janssen H-G Large Volume Injection Techniques At http //www gerstelus com

21 Van Lteshout MHPM, Janssen H-G, Cramers CA e a J High Resoult Chromatogr, 1996, v 19, p 193-199

22 Lancaster J S, Lynch TP, McDowell PG Ibid , 2000, v 23, № 7/8, p 479-484

23 Teske J, Engewald W TRAC Trends in Analytical Chemistry, 2002, v 21, № 9-10, p 584-593

24 Van Hout MW J, de Zeeuw RA , Franke J P, de Jong GJ J Chromatogr B, 1999, v 729, p 199-210

25 Reference 2, op cit

26 Klick S J Chromatogr A, 1995, v 689, p 69