CC BY
63
УДК 616.8 : 612.28 -08 В. И. Кириченко, М. Т. Луценко
НОВЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В НЕЙРОМОРФОЛОГИИ
РЕЗЮМЕ
В работе освещены механизмы, методические приемы и результаты новых, разработанных авторами, методов исследования структурной организации периферической нервной системы, основанных на использовании цистеинатных комплексов Со2+ и Мп2+, обладающих высоким сродством к медленным кальциевым каналам мембран осевых цилиндров нервных волокон. Методы позволяют получить дополнительную информацию о строении нервного аппарата дыхательной системы благодаря своей селективности по отношению к нервным структурам и могут быть рекомендованы для решения проблем нейроморфологии.
SUMMARY V.I. Kirichenko, M.T. Lutsenko
NEW INVESTIGATION METHODS IN NEUROMORPHOLOGY
In the study, mechanisms and developed by the authers methods of studying peripheral nerve system structure, based on the use of cisteinated complexes Co2+ and Mn2+ , having high affinity of slow calcium channles of axis cylinder membranes of nerve fibers are discussed. The above methods allow to obtain additional information about respiration nerve system structure, due to their selective effect on nerve strucures and they can be recommended for solving neuromorphology problems.
1. Введение
Нейроморфология к настоящему моменту времени добилась существенных результатов благодаря, прежде всего, пионерским исследованиям
К.Гольджи., С.Рамон-и-Кахала, П.Эрлиха,И. Биль-шовского, А.С. Догеля, Б.И.Лаврентьева и многих их учеников и последователей как у нас в стране, так и за рубежом. Предложенные ими методы серебряной импрегнации и окраски метиленовой синькой составили целую эпоху в изучении закономерно-
стей построения центральной и периферической нервной системы и внесли неоценимый вклад в прогресс нейробиологической науки. В этой связи нельзя не упомянуть о той значительной роли в развитии нейроморфологии, которую сыграли такие отечественные ученые, как А.С.Догель [7, 41, 42], Б.И.Лаврентьев [16, 17, 18], Е.К.Плечкова [31], Б.А.Долго-Сабуров [8], Н.Г.Колосов [11, 12],
A.Я.Хабарова [33] ,Т.А.Григорьева [6],
B.В.Куприянов [14, 15], К.А.Лавров [19],
А.А.Милохин [22, 23, 24], П.А.Мотавкин [25, 26, 27,
28, 29], Н.Н.Боголепов [3, 4], В.Н.Швалев [36, 37, 38,
39, 40]. С помощью указанных методов получены уникальные данные по структурно-функциональной организации всех звеньев рефлекторной дуги в любом органе и системе как в норме, так и при патологии.
Вместе с тем, каждый метод имеет свой информационный предел, достигнув которого, следует искать новых подходов. Не являются исключением и методы импрегнации солями серебра, а также способы окраски метиленовой синькой. Так , исследователь, посвятивший себя изучению структурной организации нервного аппарата того или иного органа годами отрабатывает методические приемы, которые позволяют ему получить удовлетворительную картину. Особенно это касается методов серебряной импрегнации. Большая трудоемкость, низкая селективность к нервным структурам (выявляются также ядра клеток, волокнистые структуры соединительной ткани), множество параметров методики, которые невозможно учесть, невысокая разрешающая способность, незначительная "функциональность" и дороговизна (применяют соли серебра, золота) - все это, несмотря на несомненные достоинства рассматриваемых методов, служит препятствием для их дальнейшего крупномасштабного использования.
Вот почему в настоящий момент основная масса исследователей для получения новой информации по структуре и функции нервной системы широко используют электронномикроскопические, гистохимические (выявление активности ацетилхолинэ-стеразы, холинацетилтрансферазы, аспартатами-нотрансферазы, биогенных аминов люминесцентным способом), иммуногистохимические (выявление нейропептидов) методы. Это без сомнения при-
носит свои положительные плоды. Однако, приходится лишь сожалеть о том, что значительная часть указанных методик не может быть в настоящее время применена многочисленными научными работниками в силу отсутствия дорогостоящих реактивов. В этом отношении зарубежные коллеги находятся в гораздо более привилегированном положении, нежели наши ученые.
В течение целого ряда лет мы занимались разработкой новых методических подходов для изучения структуры и функции периферической нервной системы легких. Однако это не исключает использования предложенных нами методов при соответствующей модификации для изучения нервного аппарата других органов. Методы основаны на применении солей кобальта (II) и марганца (II), апробированы и внедрены в нейрогистологическую практику на кафедре гистологии Благовещенского медицинского института и Института физиологии и патологии дыхания СО РАМН (директор - академик РАМН М.Т.Луценко), просты в исполнении, не требуют дорогостоящих реактивов (по крайней мере в больших количествах), высокоселективны по отношению к нервным структурам, "функциональны", обладают хорошей разрешающей способностью (позволяют выявлять тонкие нервные волокна толщиной 0,2-0,4 мкм и их окончания во всех тканевых компонентах органа) и могут быть рекомендованы нейроморфологам в их повседневной научноисследовательской работе.
2. Теоретические подходы к использованию солей кобальта (II) и марганца (II) в нейрогистологической практике.
Проведенный нами анализ литературы свидетельствует о том, что соли двухвалентного кобальта применялись для исследования траектории нервных волокон в центральной нервной системе [2,
48, 50]. При этом центральный конец перерезанного зрительного нерва помещали в 130 мМ раствор хлорида кобальта на срок до 24 часов, а извлеченный из полости черепа головной мозг опускали в физиологический раствор. Хлорид кобальта пассивно диффундировал по осевым цилиндрам нервных волокон, которые и маркировались черным осадком сульфида кобальта путем погружения мозга в раствор сернистого натрия. Диффузию хлористого кобальта значительно ускоряли применяя , электрофорез [2].
Само собой разумеется, что подобный методический подход невозможен для изучения нервного аппарата внутренних органов. Отсутствуют также данные по применению в нейроморфологии солей марганца (II).
Вместе с тем, электрофизиологические исследования, посвященные изучению роли ионов Со2+ и Мп2+ в характере возникновения и проведения потенциалов действия по нервному волокну, однозначно указывают на то, что данные катионы являются активными блокаторами медленных кальциевых каналов [9, 34, 44, 45, 46, 47, 49].
Учитывая результаты этих исследований следовало ожидать высокую степень сродства ионов Со2+ и Мп2+ к нервным структурам переживающих внутренних органов. Проведенные нами исследования полностью подтвердили указанное предположение и позволили разработать высокоселективные способы выявления периферической нервной системы легких [10].
Введение растворов солей кобальта (II) и марганца (II) можно осуществлять или в сосудистое русло органа, или же в трахеобронхиальное дерево. Во втором случае результаты лучше. В качестве осаждающего агента для ионов Со2+ применялся сульфид натрия, а для ионов Мп2+ -ферроцианид калия.
На замороженных срезах проводилось усиление контраста первично образованного осадка. Сульфид кобальта переводили в практически нерастворимый сульфид серебра и далее в металлическое серебро, а ферроцианид марганца трансформировали соответственно в ферроцианид и сульфид серебра, а также в Ag0 . Последние операции не обязательны.
Применение водных растворов солей Со2+ и Мп2+ неизменно давало мало удовлетворительные результаты. Поэтому в качестве главного комплексо-образователя был использован цистеин. Однако, возможно применять и другие химические соединения с той же целью, о чем будет сказано ниже.
2.1. Возможные механизмы кобальт-сульфидного метода.
Вероятные механизмы кобальтового метода отображены на рис.1. Наиболее важным моментом во всей методике является формирование сложного комплекса соли кобальта и цистеина. Известно, что ионы Со 2+ с цистеином координируются при pH 3-4 с 8И- и СОО- группами [32]. При этом раствор темнеет, что свидетельствует о переходе Со2+ в Со3+ . Установлено также, что соединения кобальта с аминокислотами и другими веществами являются переносчиками кислорода [13, 20]. Кислород, принимая электроны от двух атомов кобальта (II), последовательно переходит в супероксидный О2- и пероксид-ный О22- - ионы, а кобальт в конечном итоге становится трехвалентным [35]. Данное положение можно схематически отобразить следующим образом:
Со 2+ Со3+- О2-- Со2+ Со3+ - О22- - Со3+
\ / \ / \
2 Ьз+О2—► [ Ь [Ь Ьз]
I II
где Ь - лиганд , в данном случае цистеин, МО3- и Н2О.
Цист. - цистеин;
Кислородный комплекс кобальта и цистеина становится более прочным.
Комплексы I и II довольно быстро диффундируют через эндотелий сосудистого русла или же через эпителий бронхиального дерева в окружающую ткань. Подойдя к мембране нервного проводника, они вероятно разрушаются с помощью супероксид-дисмутазы (СОД) и каталазы по реакции [21, 35]:
С О Д
2О2 ------------► О2 + О2 2 .
В свою очередь пероксидный радикал О22- трансформируется в пероксид водорода, который в дальнейшем расщепляется каталазой до О2 и Н2О. Реакции проходят по схеме:
КАТАЛАЗА
2О2 2- + 4Н^ 2Н2О2 --------► О2 + 2Н2О.
Таким образом, как СОД, так и каталаза, встроенные в мембрану нервного волокна, выступают в роли ее протекторов от действия активных радикалов кислорода О2- и О2 2- , а кроме того дополнительно снабжают митохондрии нейроплазмы моле-
- кальциевый канал с сульфидом кобальта.
кулярным кислородом благодаря диспропорциони-рованию этих ионов.
Катионы Co3+ и (или) Co2+ внедряются в медленные кальциевые каналы, связываются в них с отрицательно заряженными группами белковых молекул (-COO-) и, таким образом, блокируют их. В дальнейшем ионы кобальта осаждаются сульфидом натрия с образованием черного сульфида кобальта по реакции:
Co2+ + S2-----► CoS , или 2Co3+ + 3S2-----► C02S3.
В постоянных гистологических препаратах сернистый кобальт постепенно выцветает и они бледнеют, а нервные структуры размываются. Для сохранения нейрогистологической картины срезы целесообразно подвергнуть обработке в растворе азотнокислого серебра. При этом образуется стойкий сульфид серебра. Или же срезы помещают в раствор азотнокислого серебра и восстановителя и обрабатывают по способу Тимма [5] или П.В. Беличенко [2]. Достоинством данных манипуляций является то, что при этом достигается повышение контраста нервных элементов за счет выпадения Ag2S и металлического серебра, а также слегка импрегни-руются ядра различных клеток, благодаря чему легче изучать нейро-тканевые взаимоотношения.
Рис. 1. Механизм кобальт-сульфидного метода.
■ супероксиддисмутаза; V V. - каталаза;
2.2. Возможные механизмы марганец-ферроцианидного метода.
Для целей выявления нервных структур в легком с помощью солей марганца (II) нами был использован его комплекс с цистеином. Комплексное соединение ионов Mn2+ с цистеином имеет совершенно другую организацию, нежели описанный выше кобальтовый комплекс. При этом марганец (II) координируется с карбоксильной группой (-COO-), поскольку относится к жестким катионам, или катионам класса "а" [1] и, по-видимому, не является переносчиком кислорода.
Диффузия комплекса и внедрение Mn2+ в медленные кальциевые каналы осуществляется таким же способом, как и кобальта.
Осаждение ионов Mn2+, локализованных и электростатически связанных в канале, производилось с помощью ферроцианида калия, вводимого в сосудистое русло легких. Реакция проходит по уравнению:
2Mn2+ + [Fe(CN)6] 4 -► МП2 [Fe(CN)6].
бело-розовый
осадок
Дальнейшую обработку после фиксации органа проводили на срезах, полученных на замораживающем микротоме. Осадок ферроцианида марганца переводили в менее растворимое соединение: ферроцианид серебра по реакции:
Mn2[Fe(CN)6]+4AgNOs —► Ag4 [Fe(CN)6]+2Mn(NO3b.
белый осадок
Поскольку осадок гексоцианоферроата серебра также не приметен в световом микроскопе, его визуализируют, трансформируя в сульфид серебра по уравнению:
Ag4 [Fe(CN)6] + 2Na2S-----► 2Ag2S + Na4 [Fe(CN)6.
черный
осадок
Далее, целесообразно заменить сульфид серебра на металлическое серебро, осуществив восстановление по прописи Тимма [5] или П.В.Беличенко [2]. Ядра эпителиальных и соединительнотканных клеток приобретают нежный желто-коричневый оттенок, в то время как нервные структуры выглядят интенсивно черными.
3. Практическое выполнение кобальт-сульфидного метода (КС - метод).
Способ запатентован А.с. № 1675726 от 8 мая 1991 г.
Прежде всего необходимо приготовить следующие исходные растворы:
а) 5%-ный раствор глюкозы: 5 г глюкозы растворить в 95 мл дистиллированной воды. Раствор охладить до 10-15° C ;
б) 10%-ный раствор нейтрального формалина: к
10 мл концентрированного нейтрального форма-
лина добавить 90 мл дистиллированной воды. Раствор должен иметь комнатную температуру;
в) 0,3-0,6%-ный раствор сульфида натрия: 1-2 г №2Б • 9Н2О растворяют в 99-98 мл дистиллированной воды и по каплям добавляют концентрированную НМО3 до рН 7,3-7,4. При этом раствор желтеет. Температура его комнатная;
г) 260 мМ раствор азотнокислого кобальта: используют навеску Со(Ы"О3)2 • 6Н2О. Для приготовления:
5 мл р-ра - 0,378 г растворяют в 5 мл дистиллированной воды,
10 мл р-ра - 0,756 г растворяют в 10 мл дистиллированной воды,
20 мл р-ра - 1,512 г растворяют в 20 мл дистиллированной воды;
д) 88 мМ раствор цистеина: используют навеску цистеина-основания. Следует учесть, что реакционная способность цистеина с течением времени падает. Поэтому необходимо использовать по возможности свежее вещество.
Для изготовления:
5 мл р-ра - 0,054 г растворяют в 5 мл дистиллированной воды,
10 мл р-ра - 0,108 г растворяют в 10 мл дистиллированной воды,
20 мл р-ра - 0,216 г растворяют в 20 мл дистиллированной воды.
С таким же успехом вместо цистеина можно использовать ацетилцистеин, а также восстановленный глутатион (88 мМ). Глутаминовая кислота дает результаты несколько хуже.
Растворы кобальта и цистеина фильтруют и охлаждают до 10-15° С.
е) Комплекс кобальт-цистеин сливают одинаковые количества растворов "г" и "д". Таким образом конечные концентрации веществ составляют:
Со(Ш3)2 • 6Н2О - 130 мМ. цистеин - 44 мМ.
Раствор темнеет и приобретает коньячный цвет. рН его находится в пределах 3,4-3,6. Можно использовать этот раствор или же в него следует добавить диметилсульфоксид (ДМСО) в количестве 1-2% для ускорения диффузии комплекса в орган [5]. Комплекс также должен иметь температуру 10-15° С.
Сразу же после забоя животного (крыса, кролик) вскрывают грудную клетку, в области правого желудочка сердца делают надрез и в легочную артерию вводят канюлю, надетую на шприц. Канюлю закрепляют с помощью лигатуры. Одновременно пересекают легочные вены с целью создания свободного оттока. Затем легкие осторожно перфузируют в течение 2-3 мин. 5%-ным охлажденным раствором глюкозы до освобождения органа от крови. После окончания перфузии легкие вместе с сердцем извлекают из грудной клетки и в трахеобронхиальное дерево инъецируют 5-10 мл охлажденного кобальт-цистеинатного комплекса. Трахею перевязывают и весь органокомплекс помещают на 10-15-20 минут в стаканчик с этой же жидкостью.
Далее воздухоносные пути освобождают от раствора соли кобальта промыванием 5%-ной глюкозой.
В систему легочной артерии вводят 30-70 мл раствора сульфида натрия и помещают весь органокомплекс в эту же жидкость на 10-15 минут. При этом легкое темнеет и приобретает мраморный вид. Все перфузионные мероприятия следует проводить с большой осторожностью во избежание разрыва сосудов или бронхов, что неизменно дает отрицательные результаты.
Затем сосудистую систему легких через легочную артерию отмывают от сульфида натрия 5%-ным раствором глюкозы и перфузируют с целью фиксации 10%-ным нейтральным формалином, в который и помещают орган на 2-24 часа.
Срезы толщиной 20-40 мкм изготавливают на замораживающем микротоме, натягивают на предметные стекла, высушивают, обезвоживают, заключают в бальзам или полистирол и изучают сразу под световым микроскопом. Возможна также предварительная докраска препаратов общегистологическими красителями, например, гематоксилином-
эозином, пикрофуксином, азур-эозином по Романовскому.
Со временем препараты бледнеют и выцветают. Для длительного сохранения гистологической картины и усиления контраста нервных структур срезы перед заключением после тщательной, но не долгой (вымывается сульфид кобальта) промывки в дистиллированной воде помещали на 3-5 минут в 0,10,2%-ный раствор азотнокислого серебра, промывали в дистиллированной воде и обрабатывали в течение 15-20 минут по П.В.Беличенко [2] в проявляющей жидкости следующего состава:
8 ч А + 3 ч В + 0,1ч С.
Раствор А: 25%-ный гуммиарабик (25 г гуммиарабика растворяют в 75 мл дистиллированной воды при 37° С, затем фильтруют).
Раствор В: лимонная кислота С6 Н8 О7 • Н2 О - 5,5 г, дистиллированная вода - 92 мл, гидрохинон - 2,0 г. Раствор необходимо перед использованием фильтровать.
Раствор С: 10%-ное азотнокислое серебро (AgNO3 -10,0 г, дист.вода - 90 мл).
Количество проявляющей жидкости приготавливается в зависимости от числа срезов. Проявление можно проводить при 37° С в том случае, если комнатная температура ниже 20° С. С успехом можно пользоваться рекомендациями Тимма [5].
После проявления срезы промывают в нескольких сменах дистиллированной воды и заключают обычным способом.
4. Практическое выполнение марганец-ферроцианидного метода (МФ - метод).
Способ запатентован Пат. РФ № 2103671 от 27 января 1998 г.
Приготовление исходных растворов:
а) 5%-ный раствор глюкозы: 5 г глюкозы растворить в 95 мл дистиллированной воды. Раствор охладить до 10-15° С;
б) 10%-ный раствор нейтрального формалина: к 10 мл концентрированного нейтрального формали-
на добавить 90 мл дистиллированной воды. Раствор должен иметь комнатную температуру;
в) 1%-ный раствор ферроцианида калия:
1г К4 [Бе(СМ)6] растворяют в 99 мл дистиллированной воды. Температура комнатная;
г) 260 мМ раствор сернокислого марганца: берется навеска Ми804 • 5Н20.
Для изготовления:
5 мл р-ра - 0,314 г растворяют в 5 мл дистиллированной воды,
10 мл р-ра - 0,628 г растворяют в 10 мл дистиллированной воды,
20 мл р-ра - 1,256 г растворяют в 20 мл дистиллированной воды.
д) 88 мМ раствор цистеина - основания: См. раздел 3, п."д";
е) Комплекс марганец-цистеин: растворы "г" и "д" берут в одинаковых количествах, сливают и охлаждают до 10-15° С. Конечные концентрации веществ составляют:
Ми804 • 5Н20 - 130 мМ. цистеин - 44 мМ.
Комплекс стабилен в течение длительного времени.
После забоя животного, вскрытия грудной клетки и промывки сосудистого русла легких 5%-ным раствором охлажденной глюкозы в трахеобронхиальное дерево вводят 5-10 мл марганец- цистеинат-ного комплекса на 15-20 минут. Трахею при этом перевязывают, а легкие и сердце помещают в склянку с этой же жидкостью.
Далее в сосудистую систему легких с помощью шприца вводят 30-70 мл 1%-го раствора ферроцианида калия на 10-15 мин и погружают орган в этот же раствор, после чего инъецируют 10%-ный нейтральный формалин. Фиксация длится 2-24 часа. Срезы толщиной 20-40 мкм, изготовленные на замораживающем микротоме, после тщательной промывки в дистиллированной воде помещают в 0,1-
0,2%-ный раствор азотнокислого серебра на 3-5 минут.
Далее следует многократная промывка в дистиллированной воде и обработка в 0,3-0,6%-ном растворе сульфида натрия в течение 1-3 минут. Срезы при этом темнеют.
Вновь тщательная промывка в дистиллированной воде до исчезновения запаха сероводорода, наклеивание срезов на предметные стекла, высушивание и заключение обычным способом.
Хорошие результаты можно получить после обработки срезов в проявляющем растворе П.В. Беличенко [2] или Тимма (см. раздел 3). При этом резко возрастает контраст нервных структур легких. Возможна также докраска препаратов общегистологическими методами.
5. Результаты.
Предлагаемые КС- и МФ-методы дают практически идентичную микроскопическую картину структурной организации нервного аппарата легких.
Однако, контраст нервных элементов несколько выше при использовании кобальт-сульфидного способа.
Анализ гистологических препаратов свидетельствует о выраженной селективности кобальт- и мар-ганец-цистеинатных комплексов к нервным структурам. Никакие другие клеточные элементы не прокрашиваются (эпителиальные, соединительнотканные , клетки крови). Фон остается совершенно светлым. Лишь иногда, очень бледно в стенках сосудов окрашиваются коллагеновые волокна. Однако, этот феномен имеет место только в случае использования старого цистеина или же при разрыве кровеносных сосудов во время перфузии. Правильно и аккуратно проведенные манипуляции приводят к селективному выявлению нервных структур, гораздо большей их плотности на единицу площади, нежели при использовании традиционных методов, а также к лучшей выявляемости тонких нервных волокон диаметром 0,2-0,4 мкм. На некоторых препаратах нервные проводники выявляются в виде штрих-пунктира , что связано, на наш взгляд, во-первых, с их незначительным диаметром (около 0,2 мкм), а, во-вторых, с их функциональным состоянием, при котором медленные кальциевые каналы закрыты и ионы ^2+ и Mn2+ не могут в них внедриться.
Об этом же свидетельствуют наши эксперименты с внутрибрюшинным введением подопытным ^ысам изоптина (веpапамила), являющегося блока-тоpом Ca2+ -каналов. В этих опытах резко снижается образование конечного продукта реакции и соответственно уменьшается прокрашивание нервных структур легких.
5.1. Результаты КС-метода.
Конечный продукт реакции черного цвета (CoS, Ag2S или Ag°) при проведении данного способа локализуется по ходу нервных проводников, имеющих место во всех тканевых компонентах легких. Отчетливо выявляются пучки нервных волокон по ходу бронхов и внутрилегочных кровеносных сосудов.
В интерстициальной ткани легкого способ позволяет четко выявить отдельные нервные проводники, характеризующиеся многократным дихотомическим ветвлением, что резко увеличивает площадь или объем иннервации (рис. 2, а). Здесь же можно отметить наличие густого сплетения нервных волокон, в составе которого встречаются кольцевидные нервные структуры и варикозы различного диаметра (рис. 2, б).
С помощью КС-метода возможно идентифицировать в интерстиции различной сложности чувствительные нервные окончания (рис. 3).
а б
Рис. 2. Сплетение неpвных волокон в интеpстициальной ткани легкого интактной кpысы. С-метод. Об.90 имм., ок.7 Микpофото.
а - множественное дихотомическое ветвление неpвного волокна;
б - кольцевидные стpуктуpы и натеки по ходу неpвных волокон
Основная масса рецепторных приборов имеет диффузный характер, иннервируя большие площади
(или объем) органа. В качестве примера на рис. 3, а демонстрируется фрагмент диффузного рецептора,
имеющего кольцевидно-клубочковидную конструк- (рис. 3, б). Важное место занимают древовидные
цию в основном без варикозов. Вместе с тем встре- сенсорные нервные аппараты с многочисленными
чаются рецепторные приборы диффузного типа с варикозами на ветвях (рис. 3, в).
многочисленными натеками, бляшками и фасетками
а б в
Рис. 3. Чувствительные нервные окончания в интерстициальной ткани легкого интактной крысы. КС-метод. Об.90 имм., ок.7 Микрофото.
а - фрагмент кольцевидно-клубочковидного рецептора; б - часть диффузного рецептора с натеками, бляшками и фасетками; в - компактный древовидный рецептор с множеством пуговок.
г д
Рис. 4. Рецепторные приборы в стенках альвеол интактной крысы.
а - клубочковидный рецептор без натеков (часть диффузного рецептора); б - компактные рецепторы с натеками на тангенциальном срезе альвеолы; в - кольцевидно-клубочковидный рецептор в стенке альвеолы (тангенциальный срез); г - компактный рецептор в виде натека в межальвеолярной перегородке; д - кальцевидно-клубочковый рецептор с варикозами внутри.
Метод позволяет без труда визуализировать чувствительные нервные окончания в стенках альвеол, что весьма трудно осуществить с помощью традиционных импрегнационных способов. Рецепторные приборы носят поливалентный характер, иннервируя интерстициальную ткань и альвеолы. Наиболее простыми являются примитивные клубочковидные рецепторы без натеков нейроплазмы (рис. 4,
а), а также с варикозами, имеющими различный диаметр (рис. 4, б). Более сложно построены кольцевидно-клубочковидные сенсорные аппараты, хорошо выявляемые на тангенциальных срезах альвеол (рис. 4, в). В межальвеолярной перегородке нередко встречаются чувствительные нервные окончания в форме крупного натека нейроплазмы (рис. 4,
г).
Под альвеолярным эпителием нами обнаружены кольцевидно-клубочковидные афферентные приборы с внутренним содержимым в виде пуговок, натеков и расширений (рис. 4, д). Таким образом, краткий обзор гистологических препаратов легких, обработанных с помощью КС-метода, свидетельствует о том, что предложенный способ является селективным по отношению к нервным структурам органа и позволяет получить более полную картину структурной организации периферической нервной системы.
5.2. Результаты МФ-метода
Конечным продуктом реакции предложенного метода является Ag2S или Ag0 . Осадок достаточно контрастный и локализуется только в нервных структурах легкого. Нейрогистологическая картина весьма напоминает таковую при использовании КС-метода. Вместе с тем, марганцевый способ позволяет выявить более тонкие, порядка 0,2-0,3 мкм, нервные волокна, а также чувствительные нервные окончания во всех тканевых компонентах легких.
В адвентициальной оболочке внутрилегочных сосудов на продольных срезах отчетливо прослеживается нервное сплетение, состоящее из тонких нервных волокон (рис. 5, а). На поперечных срезах внутрилегочных артерий можно наблюдать идущие в поперечном направлении нервные проводники, прободающие среднюю оболочку (1теШа) и во внутренней (1шйта) доходящие до эндотелия и возвращающиеся назад (рис. 5, б).
В интерстициальной ткани легкого способ выявляет обширные рецепторы, с ограниченным числом наплывов и варикозов (рис. 6, а), а также компактные сенсорные нервные приборы, характеризующиеся мощными натеками нейроплазмы (рис. 6,
б). Нами обнаружены афферентные аппараты и в стенках альвеол под эпителием в виде мощных расширений (рис. 6, б).
Рис. 5. Сплетение нервных волокон в стенках внутрилегочных кровеносных сосудов интактной крысы. МФ-метод. Об.90 имм., ок.7. Микрофото. а - продольно идущие нервные волокна; б - поперечно идущие нервные волокна.
Рис. 6. Чувствительные нервные окончания в нтерстициальной ткани и в стенках альвеол легких интактной крысы. МФ-метод. Об.90 имм., ок.7. Микрофото. а - обширный рецептор в интерстиции; б - рецептор с натеками в интерстиции и в стенке альвеолы.
Рис. 7. Рецепторные приборы висцеральной плевры интактной крысы. МФ-метод. Об.90 имм., ок.7. Микрофото.
а - компактный рецептор кольцевидного типа с варикозами внутри;
б - диффузный рецептор, образованный неравномерными различного калибра нервными волокнами и кольцевидными структурами.
Демонстративны рецепторы, локализующиеся в висцеральной плевре и в легочной ткани под ней. Помимо компактных кольцевидных рецепторных окончаний с пуговками и варикозами внутри (рис.
7, а), встречаются сложные сенсорные приборы диффузного типа, образованные неравномерными нервными волокнами различного диаметра и кольцевидными структурами (рис. 7, б).
Следовательно, МФ-метод позволяет более детально изучить конструкцию периферической нервной системы легких и получить полную и существенную информацию о структуре и функции афферентных нервных приборов
6. Заключение.
Вниманию исследователей, занимающихся вопросами нейроморфологии внутренних органов и, в частности, легких, предложены методические подходы, позволяющие с новых позиций оценить
структурно-функциональную организацию периферической нервной системы.
Кобальт-сульфидный (КС) и марганец-
ферроцианидный (МФ) методы разработаны применительно к легким. Однако, при соответствующей модификации они могут быть использованы для исследования нервного аппарата других органов, а также ЦНС на светооптическом и элек-
тронномикроскопче-ском уровнях.
В данном исследовании последовательно освещены механизмы, практическое исполнение и результаты предлагаемых способов, которые с успехом применялись нами на протяжении целого ряда лет. Опыт показал, что методы весьма селективны по отношению к нервным структурам легких и позволяют выявлять нервные сплетения, одиночные нервные волокна и их окончания (афферентного и эфферентного типа) в стенках бронхов различного калибра, во всех оболочках кровеносных сосудов, в интерстициальной ткани, в респираторных отделах (в стенках альвеолярных бронхиол, альвеолярных ходов и альвеол) и в висцеральной плевре. Плотность нервных проводников на срезе органа гораздо выше, нежели при использовании импрегнационных методов, а разнообразие рецепторных приборов поражает воображение. Нами четко выявлены кольцевидные чувствительные нервные окончания, которые с большим трудом выявляются другими способами, что свидетельствует об информативности методов. Это позволило предложить кольцевидно-плексиформную концепцию
структурной организации афферентного нервного аппарата легких, согласно которой кольцевидные нервные структуры являются элементарными логическими ячейками, осуществляющими анализ поступающих сигналов. Словом, эта формация работает по типу сетевой ЭВМ.
Нейробиология для своего прогрессивного развития требует новых методических и методологических подходов. Надеемся, что те методы, которые разработаны нами, внедрены в практику нейробиологии в Институте физиологии и патоло-
гии дыхания СО РАМН и изложены в настоящей работе, окажутся полезными для дальнейшей разработки проблем нейроморфологии .
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
1. Ангеличи Р.Дж. Устойчивость координационных соединений // Неорганическая биохимия. - М.: Мир, 1987. - Т.1. - С. 89-132.
2. Беличенко П.В. Разработка метода аксонального ионофореза солей кобальта для мозга // млекопитающих. // Архив анат.,гистол.,эмбриол. - 1981.-Т.81, № 10. - С. 99-104.
3. Боголепов Н.Н. Ультраструктура синапсов в норме и патологии.- М.:Медицина, 1975.- 96 с.
4. Боголепов Н.Н. Методы электронномикроскопического исследования мозга. - М.:Медицина,
1986.- 75 с.
5. Гайер Г. Электронная гистохимия. - М.:Мир,
1974. - 488 с.
6. Григорьева Т.А. Иннервация кровеносных сосудов. - М.:Медгиз, 1954.-374 с.
7. Догель А.С. Окончание чувствительных нервов в сердце и кровеносных сосудах млекопитающих // Обозрение психиатр., неврол. и экспе-рим.психол. - 1897. - Т. 64, № 4. - С. 466-473.
8. Долго-Сабуров Б.А. Иннервация вен (экспериментально-морфологическое исследование). - Л.: Медгиз, 1958. - 307 с.
9 Ильинский О. Б. Физиология сенсорных систем. Ч.3 Физиология механорецепторов. - Л.:Наука,
1975.- 559 с.
10. Кириченко В.И., Луценко М.Т., Ерофеев В.Я. Способ окраски нервных волокон на гистологическом препарате. - Авторск.свид. № 1675726. - 1991.
11. Колосов Н.Г. Иннервация внутренних органов и сердечно-сосудистой системы. - М.-Л.:Изд. АН СССР, 1954.-257 с.
12. Колосов Н.Г. Современное состояние и будущее отечественной неврогистологии. // Морфологические основания кортиковисцеральных связей. -Л., 1970. - С. 7-16.
13. Коттон Ф., Уилкинсон Дж. Современная неорганическая химия в 3-х частях. - М.:Мир, 1969. -680 с.
14. Куприянов В.В. О природе перицеллюляр-ных аппаратов на клетках спинальных узлов. // Морфол.закономерности периферич.иннервации: Сб. работ кафедры норм.анат. - Кишинев, 1958 - Т.1.
- С. 4-11.
15. Куприянов В.В. Нервный аппарат сосудов малого круга кровообращения. - Л.:Медгиз, 1959. -191 с.
16. Лаврентьев Б.И. Морфология антагонистической иннервации в автономной нервной системе и методы ее исследования. // Морфол.авт.нервн.сист. -М.:Медгиз, 1939. - С. 5-77.
17. Лаврентьев Б.И. Иннервация сердца и кровеносных сосудов. // Успехи совр.биол. - 1944. - Т.18, № 3. - С. 277-280.
18. Лаврентьев Б.И. Методика окраски нервных элементов по Бильшовскому в модификации Грос (с
видоизменениями, принятыми в лаборатории проф. Б.И.Лаврентьева). - М, 1946. - 96 с.
19. Лавров К.А. Концевые отделы периферической нервной системы. - Ростов Н/Д, 1941. - 130 с.
20. Мартел А.Э., Такуи Хан М.М. Катализ ионами металлов реакций молекулярного кислорода // Неорганическая биохимия. - М.:Мир, 1978. - Т.2. -
С. 53-93.
21. Метелица Д. И. Активация кислорода ферментативными системами. - М.:Наука, 1982. - 256 с.
22. Милохин А.А. О новой особой форме инте-рорецепторов пищеварительного тракта // ДАН СССР. - 1961. - Т.137, № 2. - С. 422-425.
23. Милохин А.А. Интерорецепторы пищеварительного тракта некоторых низших позвоночных (сравнительно-гистологическое исследование). - М.-Л.:Изд-во АН СССР, 1963. - 120 с.
24. Милохин А. А. Дальнейшее исследование по чувствительной иннервации нейронов в ганглиях ауэрбахова сплетения млекопитающих // Морфологические основания кортиковисцеральных связей. Морфология афферентных систем. - Л.:Наука, 1970.
- С. 16-23.
25. Мотавкин П. А., Черток В.М. Гистофизиология сосудистых механизмов мозгового кровообращения. - М.:Медицина, 1980. - 198 с.
26. Мотавкин П.А., Маркина-Палащенко Л.Д., Божко Г.Г. Сравнительная морфология сосудистых механизмов мозгового кровообращения у позвоночных. - М.:Наука, 1983. - 208 с.
27. Мотавкин П. А., Вараксин А.А. Гистофизиология нервной системы и регуляция размножения у двухстворчатых моллюсков. - М.:Наука, 1983. -208 с.
28. Мотавкин П. А., Ломакин А.В. и Пигол-кин Ю.И. Иммуннохимическая идентификация ва-зопрессина в нейронах и гранулосодержащих клетках кровеносных сосудов головного мозга человека. // Арх.анат., гистол., эмбриол. - 1989. - Т.96, №5.
- С.18-23.
29. Охотин В.Е., Калиниченко С.Г., Пиголк-ин Ю.И., Мотавкин П.А. Локализация аспартата-минотрансферазы в структурах чувсвительного нейрона человека // Морфология, 1992. - Т. 102, Вып.4. - С. 34-44.
30. Палихова Т.А., Хлудова Л.К., Соколов Е.Н. Двойные потенциалы действия в командных нейронах виноградной улитки в условиях действия ионов кобальта // Нейрофизиология. -1987.-Т.19, № 2.
- С. 264-267.
31. Плечкова Е.К. Сравнительная характеристика периферических сплетений парасимпатических и симпатических нервных волокон по признаку распределения и активности холинэстразы (гистохимическое исследование) // Соврем. проблемы физиол. и патол.нервной системы. - М., 1965. - С. 183-198.
32. Фриман Г.К. Комплексы металлов с аминокислотами и пептидами // Неорганическая биохимия. - М.:Мир, 1978. - Т.1. - С. 151-204.
33. Хабарова А.Я. Афферентная иннервация сердца. - М.-Л.:Изд-во АН СССР, 1961. - 191 с.
34. Ходоров Б.И. Общая физиология возбудимых мембран. - "Руководство по физиологии". -М.:Наука, 1975. - 560 с.
35. Хьюз М.Н. Неорганическая химия биологических процессов. - М.:Мир, 1983. - 416 с.
36. Швалев В.Н. Иннервация почек. - М.:Наука, 1965. - 179 с.
37. Швалев В. Н. О закономерностях строения нервного аппарата почек позвоночных и некоторых особенностях его исследования // Морфологические основания кортиковисцеральных связей. Морфология афферентных систем. - Л.: Наука, 1970.-С. 52-59.
38. Швалев В.Н. ^^TOphE моpфологические основания учения о трофической функции неpвной системы // Аpх.анат., гистол., эмбpиол. - 1971. -Т.61, вып. 8 - С. 8-29.
39. Швалев В.Н. Некоторые сравнительно-гистохимические и клинико-морфологические исследования в области изучения проблемы нервной трофики // Общие закономерности морфогенеза и регенерации. - Каунас, 1976. - С.87.
40. Швалев В.Н., Сосунов А. А., Гуски Г. Морфологические основы иннервации сердца. - М.Наука, 1992. - 386 с.
41. Dogiel A.S. Zwei Arten sympatischer Nervenzellen // Anat. Anz. - 1896. - Bd. 11, № 22. - S. 679-687.
42. Dogiel A.S. Die sensiblen Nervenendigungen im Herzen und in den Blutgefassen der Saugetiere // Arch.mikr.Anat. - 1898. - Bd. 52. - S. 44-70.
43. Ferencsik M., Garay K., Mihaly A., Csillic
B. Cobalt-complex ATP enhanced regeneration in the cloral horn of the rat spinal cord // Exp.Brain Res. -1989. - V.76, № 2. - P.409-416.
44. Hofmann F., Biel M., Flockerzi V. Molecular basis for Ca2+ channel diversity // Ann.Rev.Neurosci. -1994. - 17. - Palo-Alto (Calif.) - P. 399-418.
45. Koch L., Reinhardt K., Drabke P. Distribution of manganese and its modification by magnesium and cobalt in the guinea pig // Z.Gesamte Hyg. - 1989. -V.35, №5. - P.261-262.
46. Miller R.J. The control of neuronal Ca2+ ho-miostasis // Progr.Neurobiol. - 1991. - V. 37, № 3. - P. 255-285.
47. Morris J.L., Gibbins I.L. Co-localization and plasticity of transmitters in peripheral autonomic and sensory neurons // Int.J.Dev.Neurosci. - 1989. - V.7, №5. - P.521-531.
48. Pitman R.M., et al. Branching of central neurons: Intracellular cobalt injection for light and electron microscopy // Science. - 1972. - № 176. - P. 412-414.
49. Taglialatela M., Canzoniera L.M., Amoroso S. Cobalt-sensitive and dihydropyridine-insensitive stimulation of dopamine release from tuberoinfun- dibular neurons by high extracellular concentrations of barium ions // Brain Res. - 1989. - V.488, № 1-2. - P. 114120.
50. Tyrer N.M., Bell E.M. The intensification of cobalt-filled neurone profiles using a modification of Timm's sulphide-silver method // Brain Res. - 1974.
- № 73. - P.151-153.
