Новости клеточных технологий Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

НОВОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Факторы крови подавляют нейрогенез и когнитивные функции в эксперименте in vivo

Непрерывный постнатальный нейрогенез у млекопитающих, включая человека, поддерживается в специфическом локальном микроокружении, так называемых нейрогенных нишах, в субвентрикулярной зоне латеральных желудочков и субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампа [1, 2]. Регулирующие сигналы внутри нейрогенной ниши стимулируют образование новых нейронов и их последующую интеграцию в нейронную сеть центральной нервной системы [3—4]. Только в зубчатой извилине гиппокампа молодых взрослых крыс образуется около 138 тысяч новых гранулярных нейронов в месяц, что составляет около 6% от их общего количества [5]. Многочисленные эксперименты и математические модели свидетельствуют, что вновь образованные нейроны принимают прямое участие в когнитивных процессах, включая обучение и память [6—9].

С возрастом интенсивность нейрогенеза значительно падает, что может быть обусловлено изменением баланса между внутренними (внутриклеточные или из ЦНС) и внешними (например, из крови] регулирующими факторами. В настоящее время определены некоторые внутренние факторы или механизмы, такие как возрастание внутриклеточной концентрации микро-РНК let-7, Wnt-сигнальный каскад и др. [10, 11], тогда как внешние стимулы, несмотря на тесную интеграцию нейрогенных ниш с сетью сосудов, до сих пор оставались гипотетическими.

1 сентября 2011 г. в Nature опубликована статья исследовательской группы T. Wyss-Coray из Стэн-фордского университета, в которой было показано, что некоторые факторы сыворотки крови играют ключевую роль в подавлении нейрогенеза и когнитивных процессов у стареющих мышей.

На первом этапе авторы исследовали особенности нейрогенеза у пар мышей с общей сосудистой системой — гетерохронных парабионтов (юная мышь — старая мышь). Были получены интересные результаты

— у молодых мышей отмечалось значительное снижение даблкортин-позитивных незрелых нейронов, BrdU-позитивных клеток и Sox-2-позитивных клеток-предшественниц в области нейрогенных ниш. В то же время у старых мышей наблюдалась обратная картина

— количество клеток с вышеперечисленными метками у них возрастало. У изохронных парабионтов (юная-юная и старая-старая мыши] какого-либо влияния на нейрогенез после образования общих сосудистых анастомозов обнаружено не было. Основываясь на этих результатах, авторы предположили, что в крови мышей находятся факторы, которые оказывают влияние на нейрогенез, и это влияние зависит от возраста.

Обусловлен ли описанный выше эффект растворимыми в плазме факторами или мигрирующими клетками-предшественницами? Для ответа на этот вопрос авторы вводили внутривенно плазму крови, полученную от молодых или старых мышей, молодым мышам. Лишь у мышей, которым вводили плазму от старых мышей, наблюдалось значительное снижение уровня даблкортин-позитивных клеток. Это говорит о том, что именно растворимые факторы, находящиеся в плазме крови, ингибируют пост-натальный нейрогенез.

В последующих экспериментах авторы также доказали, что у молодых мышей — гетерохронных парабионтов и у молодых мышей, которые получали инъекции плазмы старых мышей, подавляется не только нейрогенез, но и когнитивные функции, причем в манере, характерной для возрастных изменений. Было показано, что у вышеперечисленных мышей наблюдается снижение долговременной потенциации, являющейся общепризнанной мерой синаптической пластичности, гиппокамп-зависимой обучаемости и памяти (использовались модель ассоциированного с контекстом условно-рефлекторного замирания и тесты на память в водном радиальном лабиринте). Эти эксперименты показали, что растворенные в плазме факторы ингибируют не только нейрогенез, но и подавляют когнитивные процессы.

Для непосредственной идентификации факторов, ответственных за вышеперечисленные эффекты, авторы использовали протеомный подход, в котором они анализировали уровни 66 цитокинов, хемокинов и других сигнальных факторов в плазме крови старых мышей с помощью мультиплексного иммунофермент-ного анализа. С использованием мультивариантного анализа удалось идентифицировать 17 белков, чьи уровни возрастали и коррелировали с подавлением нейрогенеза при старении. С другой стороны, при сравнении молодых мышей в составе изохронных и гетерохронных парабионтов были идентифицированы 15 факторов, уровни которых увеличивались у молодых мышей — гетерохронных парабионтов. Только 6 факторов — СС1_2, ССИ1, ССИ2, ССИ9, гаптоглобин и р2-микроглобулин — совпали при сравнении этих 2 групп. Концентрация одного из них, СС1_11, известного также как эотоксин-1, увеличивается с возрастом в крови и цереброспинальной жидкости и у людей (исследовались здоровые индивиды от 20 до 80 лет).

Системное введение СС1_11 сопровождалось увеличением концентрации этого хемокина в крови и значительным снижением количества даблкортин-позитивных незрелых нейронов в зубчатой извилине

гиппокампа. Этот эффект предотвращался введением анти-CCLH антител.

Культивирование первичных нейральных стволо-вых/прогениторных клеток (НСК) с сывороткой от старых мышей приводило к формированию нейросфер, количество которых было приблизительно в

2 раза меньше, чем при культивировании с сывороткой молодых животных. Культивирование первичных НСК в среде с высокой концентрацией CCL11 приводило к подавлению образования нейросфер.

Наконец, авторы вводили С^11непосредственно в область зубчатой извилины гиппокампа молодых мышей и наблюдали значительное снижение коли-

ЛИТЕРАТУРА:

1. Gage F.H. Mammalian neural stem cells. Science 2000; 287(5457): 1433-8.

2. Alvarez-Buylla A., Lim D. A. For the long run: maintaining germinal niches in the adult brain. Neuron 2004; 41: 683-6.

3. Zhao C., Deng W., Gage F.H. Mechanisms and functional implications of adult neurogenesis. Cell 2008; 132: 645-60.

4. van Praag H., Schinder A.F.,Christie B.R. Functional neurogenesis in the adult hippocampus. Nature 2002; 415: 1030-4.

5. Cameron H.A., McKay R.D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J. Comp. Neurol. 2001; 435(4): 406-17.

6. Deng W., Aimone J.B., Gage F.H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory? Nature Rev.Neurosci. 2010; 11: 339-50.

7. Clelland C.D., Choi M., Romberg C. et al. A functional role for

чества даблкортин-позитивных незрелых нейронов, тогда как в контралатеральной зубчатой извилине, в область которой вводился физиологический раствор, ингибирование нейрогенеза не наблюдалось. В похожем эксперименте вводились анти-С^11 и изотипические антитела, а затем проводились системные инъекции CCL11. В областях, где ранее вводились анти-CCLH антитела, подавления нейрогенеза не наблюдалось. Аналогичные эксперименты были проведены для исследования когнитивных функций. Воздействие CCL11 всегда сопровождалось дефицитом синаптической пластичности, значительным снижением гиппокамп-зависимой обучаемости и памяти.

adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science 2009; 325(5937): 210-3.

8. Zhang C.L., Zou Y., He W., Gage F.H., Evans R.M. A role for adult TLX positive neural stem cells in learning and behaviour. Nature 2008; 451: 1004-7.

9. Saxe M. D., Battaglia F., Wang J.W. et al. Ablation of hippocampal neurogenesis impairs contextual fear conditioning and synaptic plasticity in the dentate gyrus. PNAS 2006; 103: 17501-6.

10. Nishino J., Kim I., Chada K., Morrison S.J. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a and p19Arf Expression. Cell 2008; 135(2): 227-39.

11. Lie D.C., Colamarino S.A., Song H.J. et al. Wnt signalling regulates adult hippocampal neurogenesis. Nature 2005; 437(7063): 1370-5.

12. Zielinska E. Blood's role in the aging brain. The Scientist August 31,2011.

По материалам:

Villeda SA., Luo J., MosherK. I. etal. The ageing systemic milieu negatively regulates neurogenesis and cognitive function. Nature 2011; 477:90-4

П о д г о т о в и л А.Г. Малюта Поступила 04.09.2011

Индукция эритропоэза с помощью контролируемой экспрессии эритропоэтина генетически модифицированными клетками эндотелия локальной сосудистой сети

В последние десятилетия в клинической практике стали широко использоваться препараты, основу которых составляют рекомбинантные белки. Эти препараты, как правило, обладают очень высокой эффективностью при лечении целого ряда заболеваний. Однако такая терапия также отличается высокой ценой. Так, например, стоимость рекомбинантного эритропоэтина, необходимого для лечения анемии у пациентов с поздними стадиями хронических заболеваний почек в течение года составляет десятки тысяч долларов [1, 2].

Альтернативой внутривенному введению рекомбинантных белков может являться генная терапия. Пригодность этого подхода была неоднократно обоснована в экспериментальных исследованиях, однако реальное клиническое применение до сих пор остается под вопросом. Возможность прямого введения генетических конструкций на основе вирусов ограничена их иммуногенностью, неспецифичностью

трансфицируемых клеток-мишеней и вопросами безопасности. Большинство этих проблем удается избежать при ex vivo генной терапии с использованием аутогенных клеток. Однако в этом случае не удаётся достичь приемлемого уровня приживления клеток [3].

Исследовательская группа J.M. Melero-Martin из Бостона ранее разработала метод создания новых сосудистых структур, состоящих из клеток человека, у иммунодефицитных мышей [4]. Подкожная инъекция костномозговых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) человека с эндотелиальными клетками, способных к формированию колоний (КФЕ-Э), приводит к формированию обширной сосудистой сети, состоящей из клеток человека, в которой также формируются анастомозы с сосудистой сетью животных-реципиентов. При этом КФЕ-Э выстилают внутреннюю поверхность вновь образованных сосудов. Это создает предпосылки

для использования данной методики в целях разработки новых подходов в генной терапии, ведь высвобождаемые из эндотелиальных клеток белки будут попадать в кровообращение и распределяться по всему организму.

В своей новой работе, опубликованной в Blood, группе J.M. Melero-Martin удалось доказать осуществимость и эффективность описанного подхода на примере коррекции анемии у мышей с помощью гена эритропоэтина (EPO).

КФЕ-Э in vitro подвергались трансфекции вектором на основе лентивируса, в состав которого был включен ген EPO человека. Успешная трансфекция подтверждалась путем выявления мРНК EPO с помощью ОТ-ПЦР. Синтез EPO подтверждался иммуно-блоттингом клеточных лизатов и иммуногистохими-ческим окрашиванием клеток анти-EPO антителами в монослойной культуре. Большие количества EPO также выявлялись в кондиционированной среде, что свидетельствовало о секреции этого белка. Функциональная активность EPO была подтверждена в экспериментах с формированием EPO-зависимых эритроцит-содержащих колоний при культивировании с гемопоэтическими клетками. У трансфицированных КФЕ-Э не наблюдалось каких-либо изменений в морфологии, экспрессии ключевых поверхностных маркеров и функциональных свойствах. Единственное изменение, которое смогли зафиксировать авторы, это приобретение КФЕ-Э устойчивости к инициирующим апоптоз сигналам, что, однако, было ожидаемо, так как антиапоптотический эффект EPO на клетки эндотелия был описан ранее [6].

Далее авторы исследовали приживление трансфицированных КФЕ-Э человека у иммунодефицит-ных мышей и системное высвобождение EPO in vivo. Проводилось подкожное введение Epo-КФЕ-Э вместе с ММСК. При гистологическом исследовании биоптатов на 10 сут после инъекции была выявлена широкая перфузируемая сосудистая сеть, в которой клетки эндотелия экспрессировали характерную для человека изоформу CD31. В крови мышей экспериментальной группы выявлялся EPO, тогда как у нативных животных он не выявлялся. При анализе гематологических показателей на 10 сут. после введения было выявлено повышение всех связанных с интенсификацией эритропоэза параметров: гематокрита, количества эритроцитов, концентрации гемоглобина. Так показатель гематокрита увеличивался в среднем от 39,5±1,4% до 63,9±2,1%. На эти же сроки у мышей отмечалось развитие спленомегалии, причем в селезенке выявлялось необычно большое количество Ю67-позитивных пролиферирующих клеток, что свидетельствовало об активном экстра-медуллярном эритропоэзе. Хирургическое удаление сформированных после введения клеток сосудистых структур через 2 нед. приводило к нормализации гематологических параметров. Сосудистые структуры, содержащие EpoКФЕ-Э и ММСК человека, поддерживали высокий уровень эритропоэза в течение 4-5 нед., после чего происходила нормализация показателей крови, по-видимому, за счет замещения клеток человека клетками мышей-реципиентов [4].

Для контроля над экспрессией EPO авторы использовали вектор, в котором перед геном EPO был встроен тетрациклиновый операторный элемент (TetO 2), и второй вектор с геном тетрацикли-нового репрессорного белка. В этой системе EPO

экспрессировался в трансфицированных КФЕ-Э (tetR-epo-КФЕ-Э) только в присутствии доксици-клина, что и было подтверждено в экспериментах in vitro. У мышей, которым ранее проводилось введение tetR-epo-КФЕ-Э и ММСК, при приёме докси-циклина в фармакологических дозах наблюдались все признаки интенсификации эритропоэза. Отмена приема доксициклина, в свою очередь, приводила к нормализации показателей крови. Наконец, при использовании прерывистой схемы введения док-сициклина, согласно которой доксициклин вводился только по нечетным неделям, наблюдались соответствующие колебания гематологических параметров. Таким образом, авторы показали, что с помощью использованной системы можно модулировать высвобождение EPO в зависимости от потребностей.

На последнем этапе исследования авторы использовали разработанный ими метод генной терапии для коррекции анемии у мышей с экспериментально вызванным поражением почек. Была выбрана ранее разработанная методика двухступенчатой нефрэк-томии 5/6 части почек [5]. В течение 2 нед. после 2-го хирургического вмешательства у использованных мышей линии nude развивалась выраженная анемия (показатель гематокрита 28,0±4,3% против 46,0±1,0% у контрольных мышей). Животным проводилась подкожное введение tetR-epoКФЕ-Э и ММСК человека. В течение 1 нед. после введения и начала приема доксициклина показатели гематокрита у опытной группы мышей достигли в среднем 60,0±7,8% и такие значения оставались на постоянном уровне в течение 3 нед. Аналогичные изменения были характерны для количества эритроцитов и концентрации гемоглобина, тогда как масса тела и общее количество лейкоцитов не подвергались существенным изменениям. Таким образом, с помощью разработанного метода генной терапии удалось достичь полной коррекции анемии в данной экспериментальной системе в течение одной недели после введения клеток и поддержания высокого уровня эритропоэза еще в течение 3 нед. без каких-либо дополнительных вмешательств, за исключением приема доксициклина.

В результате проведенного исследования авторы постулируют, что EpoКФЕ-Э являются эффективным средством для введения EPO: клетки циркулируют в крови и могут быть легко изолированы; после транс-дукции они эффективно продуцируют и секретируют EPO; присущая им способность к участию в формировании сосудов может быть выгодно использована для достижения приемлемого локального приживления in vivo. Разработанный авторами подход может стать реальной альтернативой для терапии анемии у пациентов, принимающих рекомбинантный эритро-поэтин и ожидающих трансплантации почки, так как избавит их от частых инъекций и, вполне вероятно, значительно снизит общую стоимость лечения. Тем не менее, до этапа клинических испытаний необходимо проведение дополнительных исследований, направленных на оценку безопасности, эффективности и возможной длительности терапевтического эффекта при использовании аутогенных клеток у иммуноком-петентных животных. При получении оптимистичных результатов не исключено, что разработанная технология может стать уникальной платформой для доставки широкого спектра «терапевтических» белков в клинических и исследовательских целях.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Tonelli M., Winkelmayer W.C., Jindal K.K. et al. The cost-effectiveness of maintaining higher hemoglobin targets with erythropoietin in hemodialysis patients. Kidney Int. 2003; 64(1): 295-304.

2. Coladonato J.A., Frankenfield D.L., Reddan D.N. et al. Trends in anemia management among US hemodialysis patients. J. Am. Soc. Nephrol. 2002; 13(5): 1288-95.

3. Sanchez-Martin D., Sanz L., Alvarez-Vallina L. Engineering human

cells for in vivo secretion of antibody and non-antibody therapeutic proteins. Curr. Opin. Biotechnol. 2011; 22(6): 924—30.

4. Melero-Martin J.M., Kang S.-Y., Khan Z.A. et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circ Res. 2008;103t2): 194-202.

5. Hamamori Y., Samal B., Tian J. et al. Myoblast transfer of human erythropoietin gene in a mouse model of renal failure. J. Clin. Invest. 1995; 95(4): 1808-13.

По материалам:

Lin R.-Z., Dreyzin A., Aamodt K. et al. Induction of erythropoiesis using human vascular networks genetically-engineered

for controlled erythropoietin release. Blood 2011; 118(20): 5420-8

П о д г о т о в и л А.В. Суворов Поступила 28.10.2011

Ингибирование транскрипции Д!и-повторов в мультипотентных мезенхимных стромальных клетках жировой ткани человека, находящихся в фазе клеточного старения, приводит к восстановлению репликативной активности

Клеточное старение также называемое репликативным старением, подразумевает ограниченную способность клеток к делению в культуре in vitro, впервые описанное Хейфликом и коллегами в 1965 г. (лимит Хейфлика) [1]. В этих классических экспериментах было показано, что сначала первичные фибробласты кожи человека активно делятся в культуре. Затем после многих удвоений интенсивность пролиферации клеток постепенно, но неуклонно снижается. В конце концов, все клетки в культуре необратимо теряют способность к делению и приобретают характерные морфологические изменения. На этом этапе фибробласты можно поддерживать в жизнеспособном состоянии в течение нескольких недель, но такая культура неспособна к росту, несмотря на наличие всех необходимых условий. Предполагается, что подобное ограничение в количестве делений клеток может лежать в основе процессов старения организма. Несмотря на то, что ранее клеточное старение считалось необратимым, в настоящее время было показано, что определенные фармакологические препараты могут, по крайней мере частично, подавлять связанные со старением изменения [2].

Согласно одной из наиболее распространённых теорий причиной репликативного старения является постепенная аккумуляции повреждений ДНК [3]. У эукариот повреждения ДНК ассоциируются с фос-форилированием гистона H2AX, в результате которого образуется специфическая модификация гистона

- yH2AX. Таким образом, yH2AX является маркером повреждения ДНК. В недавно опубликованном исследовании при оценке распределения yH2AX в ядрах делящихся мироскопических грибков Saccharomyces cerevisiae было показано наличие в геноме «хрупких» мест, в которых наблюдалась высокая вероят-

ность возникновения повреждений ДНК [4]. Эти данные стали предпосылками для изучения механизмов репликативного старения стволовых/прогениторных клеток человека, проведенного научной группой V.V. Lunyak. Результаты исследования были опубликованы в сентябрьском номере Cell Cycle.

В качестве модели для изучения клеточного старения стволовых/прогениторных клеток человека были выбраны мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани взрослых людей (жММСК). Свежеизолированные жММСК претерпевали в культуре в среднем 17 удвоений, после чего постепенно начинали приобретать характерные для репликативного старения признаки. После 37 удвоений наблюдалось подавление экспрессии генов, продукты которых участвуют в клеточном делении, а в культуре появлялись гигантские неде-лящиеся клетки, экспрессирующие ассоциированную с репликативным старением р-галактозидазу (SA-p-Gal). Уровни включения 3[И]-тимидина свидетельствовали об очень низком уровне пролиферации на этом этапе.

Анализ распределения yH2AX и 53BP1 (p53

binding protein-1; белок, локализующийся возле разрывов обеих цепей ДНК [5]) показал, что в культивируемых жММСК повреждения ДНК распределяются не равномерно, а аккумулируются в определённых местах (фокусах). При этом количество клеток, у которых выявляются фокусы повреждений ДНК, значительно возрастает на этапе репликативного старения: у самообновляющихся жММСК (SR-MM^, 19 удвоений) выявляется небольшое количество клеток с наличием фокуса(-ов) повреждений ДНК, тогда как до 90% жММСК имели фокусы повреждений ДНК на этапе репликативного старения (SEN-MMCK, 37-удвоений).

В соответствии с ранее полученными данными

об ассоциации стресс-индуцированного ответа на повреждение ДНК и активации ретротранспозонов

[6] в SEN-жММСК была обнаружена активация транскрипции Alu-ретротранспозонов. При этом активация транскрипции Alu являлась специфическим для репликативного старения событием, так как активация транскрипции других генов, зависимых от ДНК-полимеразы III, не наблюдалась.

При использовании 5-Fluorouridine в качестве метки удалось установить, что у SEN-жММСК в фокусах повреждений ДНК, в которых аккумулировались 53BP-1/yH2AX, происходит активная транскрипция генов. Эта транскрипция осуществлялась ДНК-полимеразой III, так как ее ингибирование предотвращало включение 5-Fluoгouгidine-метки. Сопоставив полученные данные, авторы предположили, что в фокусах повреждений ДНК происходит активная транскрипция Alu-ретротранспозонов.

Для точной идентификации геномных локусов, непосредственно вовлеченных в процесс репарации ДНК, выполнялся полногеномный анализ хроматина жММСК методом иммунопреципитации хроматина с антителами к YH2AX-гистонам с последующим секвенированием всего пула выделенных фрагментов на приборе массового параллельного секвенирования ДНК ABI SO Li D (ChIP-seq метод). Анализ показал, что 65% YH2AX-гистонов были ассоциированы с мобильными элементами, большинство из которых были Alu (SINE), L1 (LINE) или LTR ретротранспозонами.

Сравнительный анализ жММСК на этапах активной репликации и репликативного старения показал, что старение не сопровождается накоплением YH2AX-гистонов в области теломерных областей хромосом. В то же время, в предыдущих работах было продемонстрировано, что в основе старения фибро-бластов человека лежит аккумуляция повреждения ДНК, инициируемое укорочением теломер [7]. Авторы предположили, что в отличие от фибробластов, ведущую роль в старении жММСК и, вероятно, других стволовых/прогениторных клеток человека, играют другие механизмы.

Исследование перицентромерных участков хромосом показало, что между реплицирующимися и стареющими жММСК существуют значительные различия в распределении YH2AX-гистонов. Наиболее значимые различия были обнаружены в перицентромерных участках 2, 6, 10 и 19 хромосом. Эти же участки, как было показано ранее, высоко обогащены Alu-повторами. [8]. Исследование активности транскрипции Alu в этих регионах показало, что у SEN-жММСк аккумуляция YH2AX-гистонов в указанных «хрупких» местах сопровождается увеличением транскрипции Alu-повторов и, таким об-

ЛИТЕРАТУРА:

1. Hayflick L. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. Exp. Cell Res. 1965; 37: 614-36.

2. Demidenko Z.N., Blagosklonny M.V. Quantifying pharmacologic suppression of cellular senescence: prevention of cellular hypertrophy versus preservation of proliferative potential. Aging 2009; 1: 100816.

3. Sahin E., Depinho R.A. Linking functional decline of telomeres, mitochondria and stem cells during ageing. Nature 2010; 464: 520-8.

4. Szilard R.K., Jacques P.E., Laramee L. et al. Systematic identification of fragile sites via genome-wide location analysis of gamma-H2AX. Nat. Struct. Mol. Biol. 2010; 17: 299-305.

разом, активность транскрипции Alu-повторов тесно связана с персистирующими повреждениями ДНК. Авторы предположили, что активация транскрипции Alu-ретротранспозонов в SEN-жММСК токсична для хроматина и служит причиной репликативного старения.

В ранее проведенных работах было продемонстрировано, что в клетках человека Alu-повторы перицентромерных областей тесно ассоциированы с когезином [9]. Когезин представляет собой белковый комплекс, который играет ключевую роль в репарации ДНК путем гомологичной рекомбинации, а также в когезии и сегрегации хромосом во время клеточного деления. Дефицит когезина приводит к остановке клеточного цикла в G1 и G2-M контрольных точках [10].

Авторы изучали перемещение компонентов коге-зинового белкового комплекса к Alu-повторам в перицентромерные области 10 хромосомы, в которых выявлялись кластеры YH2AX-гистонов. Анализ показал, что в SEN-жММСК, в отличие от SR-жММСК, наблюдалось нарушение образования когезиновых комплексов в исследуемых геномных локализациях. Таким образом, увеличение РНК Alu может нарушать миграцию компонентов когезинового комплекса к Alu-повторам, что приводит к нарушению репарации ДНК и, как следствие, аккумуляции повреждений ДНК в SEN-жММСК.

На последнем этапе экспериментов авторы использовали лентивирусный вектор с геном малой РНК, образующей шпильку и интерферирующей с РНК Alu (sh-132Alu РНК). sh-132Alu РНК специфически подавляет РНК Alu. Трансдукция SEN-жММСК приводила к существенным изменениям морфологии клеток и значительному увеличению включения 3[И]-тимидина, что свидетельствовало об интенсификации пролиферации клеток. В клетках также подавлялась экспрессия р-галактозидазы и перестали выявляться фокусы повреждений ДНК. Трансфицированные SEN-жММСК активно пролиферировали в культуре в течение всего периода наблюдения (40 дней). За этот срок количество удвоений клеток в среднем достигало 46.

Таким образом, в исследовании авторам продемонстрировали ключевую роль Alu-транскриптов в процессах ex vivo репликативного старения жММСК человека. Им удалось подтвердить, что клеточное старение является обратимым процессом. Тем не менее, пока сложно определить практическое значение сделанных открытий, так как роль репликативного старения клеток в связанных со старением организма процессах до сих пор не определена. Кроме того, остается неясным причина ассоциированного с клеточным старением увеличения активности транскрипции Alu-повторов.

5. Ward I.M., Minn K., Jan van Deursen, Chen J. p53 Binding Protein 53BP1 Is Required for DNA Damage Responses and Tumor Suppression in Mice. Molecular and Cellular Biology 2003; 23(7): 2556-63.

6. Rudin C.M., Thompson C.B. Transcriptional activation of short interspersed elements by DNA-damaging agents. Genes Chromosomes Cancer 2001; 30: 64-71.

7. d'Adda di Fagagna F., Reaper P.M., Clay-Farrace L. et al. A DNA damage checkpoint response in telomere-initiated senescence. Nature 2003; 426: 194-8.

8. Schueler M.G., Sullivan B.A. Structural and functional dynamics of human centromeric chromatin. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2006; 7: 301-13.

9. Hakimi M.A., Bochar D.A., Schmiesing J.A. et a|. A chromatin ю. Jessberger R. Cohesin's dual role in the DNA damage

remode||ing comp|ex that |oads cohesin onto human chromosomes. response: repair and checkpoint activation. EMBO J. ЗШ9; гВ: Nature ЗШЗ; 41В: 994-В. 2491-З

По материалам:

Wang J., Geesman G., Hostikka S.L. Inhibition of activated pericentromeric SINE/Alu repeat transcription in senescent

human adult stem cells reinstates self-renewal. Cell Cycle 2011; 10(17]: 3016-30

П о д г о т о в и л Г.К. Жуков Поступила 30.10.2011

Ингибирование БСЬБ подавляет возникновение резистентности у РЬ+ лейкозных клеток к ингибиторам тирозин-киназ

Филадельфиская хромосома (Ph) является цитогенетической аномалией, возникающей в результате специфической транслокации между 9 и 22 хромосомой, при которой происходит объединение гена ти-розинкиназы ABL1 с геном BCR. При последующей транскрипции образуется химерный Bcr-Abl белок, который обладает выраженной тирозин-киназной активностью. Тирозин-киназная активность находится на постоянно высоком уровне и не поддается какой-либо регуляции. Сигнальные каскады, активируемые Bcr-Abl, приводят к активации клеточного цикла и неконтролируемой пролиферации клеток, а также к подавлению некоторых механизмов репарации ДНК, что делает клетки восприимчивыми к новым генетическим аномалиям. Именно поэтому Bcr-Abl химерный белок является одним из ключевых звеньев патогенеза целого ряда гемобластозов. Филадель-фиская хромосома ассоциируется с хроническим миелоидным лейкозом (ХМЛ, 95%), острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ, 25-35% случаев у взрослых и 2-10% у детей) и острым миелоидным лейкозом (ОМЛ, 1-3%).

Перечисленные виды гемобластозов (ОЛЛ, ОМЛ и ХМЛ в фазе бластного криза) характеризуются агрессивным течением и вплоть до недавнего времени трудно поддавались лечению. Ситуация коренным образом изменилась в 2001 г., когда в терапии данных видов заболеваний стали широко применяться препараты нового класса - ингибиторы тирозин-киназ (ИТК) [1]. ИТК ингибируют киназную активность химерного Bcr-Abl белка, что приводит к подавлению пролиферации и индукции апоптоза лей-козных клеток. Применение ИТК в настоящее время позволяет добиться полной ремиссии впервые выявленных Ph-позитивных лейкозов в 90-95% случаев [2, 3]. Однако использование этих препаратов не позволяет полностью вылечить больных и рано или поздно наступают рецидивы основного заболевания.

В исследованиях, проведенных в два последних десятилетия, было неоднократно показано, что лей-козные стволовые клетки (ЛСК), также называемые опухоль-инициирующими клетками, обладают резистентностью к стандартным видам терапии и играют ключевую роль в патогенезе гемобластозов. Суще-

ствование ЛСК было доказано и для Ph-позитивных лейкозов [4]. Более того, BCR-ABL+ ЛСК, несмотря на экспрессию химерного белка, обладают резистентностью к ИТК, что, по-видимому, и приводит к рецедивированию данной группы заболеваний [5, 6].

Международная группа ученых, под руководством профессора M. Muschen, опубликовала в Nature результаты своего исследования, в котором им удалось раскрыть механизм возникновения резистентности BCR-ABL+ ЛСК к ИТК, а также предложить возможный путь его подавления.

Для исследования механизмов резистентности авторы исследовали изменения в экспрессии генов у лейкозных клеток при терапии ИТК, анализируя как свои, так и опубликованные ранее данные. Было показано, что одним из наиболее значимых изменений в лейкозных клетках при Ph-позитивном ОЛЛ в ответ на терапию ИТК является 90-кратное увеличение экспрессии протоонкогена BCL6. Такая же степень экспрессии BCL6 также характерна для диффузной В-крупноклеточной лимфомы (ДВККЛ) [7].

Для изучения регуляции экспрессии BCL6 при Ph-позитивном ОЛЛ авторы исследовали JAK2/STAT5 и PI3K/AKT сигнальные каскады, которые активируются химерным белком BCR-ABL1. Ранее было показано, что фактор транскрипции STAT5 подавляет экспрессию BCL6 в B-лимфоцитах [8]. Увеличение экспрессии BCL6 при применении ИТК выражено не в полной степени из-за наличия конститутивного уровня активного STAT5 в лейкозных клетках. Деле-ция STAT5 приводит к увеличению экспрессии BCL6 даже в отсутствии ИТК.

Индукция экспрессии BCL6 также инициируется фактором транскрипции FoxO [15 из статьи]. В лейкозных клетках Ph+ ОЛЛ активность FoxO ингибируется PI3K/AKT сигнальным каскадом, который в свою очередь подавляется фосфатазой PTEN. Делеция PTEN аннулирует способность лейкозных клеток к увеличению экспрессии BCL6 при применении ИТК.

В предыдущих исследованиях было показано, что ИТК предотвращают увеличение экспрессии p53 в ответ на повреждения ДНК в лейкозных клетках Ph+ ОЛЛ и ХМЛ [9,10]. Сравнительный анализ

экспрессии генов в BCL6-/- и BCL6+/+ лейкоз-ных клетках показал, что потенциальными генами-мишенями BCL6 являются Cdkn2a (Arf), Cdkn1a (p2D, p53 и pS3bp1. Культивирование BCLВ+/+ лейкозных клеток с ИТК приводило к значительному увеличению экспрессии BCL6 и подавлению p53, тогда как в BCL6-/- клетки характеризовались высокими уровнями экспрессии p53, которая не зависела от ИТК.

Arf и p53 подавляют самообновление клеток [її]. В сравнении с BCL6+/+ клетками способность к образованию колоний была снижена у BCL6-/- лейкозных клеток приблизительно в 2^ раз. Для исследования потенциала к самообновлению BCL6-/- и BCL6+/+ клетки ОЛЛ трансплантировались мышам-реципиентам. Лейкозные клетки приживлялись в обоих случаях. BCL6+/+ клетки быстро пролиферировали, и в результате у реципиентов развивался фатальный лейкоз. В свою очередь, BCL6-/- клетки выявлялись только в местах их введения, а лейкоз не развивался. В принципе, этот факт может быть обусловлен нарушением миграции BCL6-/- лейкозных клеток в костномозговую нишу. Все BCL6-/- клетки характеризовались низкой экспрессией CD44, экспрессия которого необходима для хоуминга BCR—ABL1 ЛСК в костномозговое микроокружение [ї2]. Восстановление экспрессии CD44 с помощью ретровирусных векторов, действительно, значительно увеличивало миграцию BCL6-/-в костный мозг, однако развития лейкоза опять же не наблюдалось.

При внутрикостном введении, которое позволяет обойти дефекты миграции, с использованием метода лимитирующих разведений было показано, что для развития фатального лейкоза необходимо введение не менее 5 млн BCL6-/- лейкозных клеток в сравнении с Ю тысячами BCL6+/+ клеток. Это означает, что количество ЛСК при BCL6-/- ОЛЛ (менее, чем ї на їВД тыс. клеток) приблизительно в їВД раз меньше, чем при BCL6+/+ ОЛЛ (не менее ї на ЮВД клеток).

Для изучения возможности фармакологического подавления BCL6, авторы использовали ингибитор BCL6 — retro-inverso пептидный ингибитор BCL6 (RI-BPI), который блокирует репрессорную активность BCL6 [їЗ].

Первичные Ph+ лейкозные клетки, полученные от 4 пациентов (ОЛЛ), культивировались в присутствии иматиниба, RI-BPI или их комбинации. Во всех 4 случаях иматиниб подавлял пролиферацию и индуцировал апоптоз, однако при дальнейшем культивировании наблюдался рост количества

ЛИТЕРАТУРА:

ї. Druker B.J. Imatinib as a paradigm of targeted therapies. Adv. Cancer Res. 2ВД4; 9ї: ї—З.

2. Ottmann O.G., Pfeifer H. First-line treatment of Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukaemia in adults. Curr. Opin. Oncol. 2ВД9; 2ї Suppl ї: S43—6.

3. Steinberg M. Dasatinib: a tyrosine kinase inhibitor for the treatment of chronic myelogenous leukemia and philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia. Clin. Ther. 2ВД7; 29(її): ЗЗВВ—З^В.

4. Sloma I., Jiang X., Eaves A.C. Insights into the stem cells of chronic myeloid leukemia. Leukemia 2^Ю; 24Иї): їВ2З—ЗЗ.

5. Chu S., McDonald T., Lin A. et al. Persistence of leukemia stem cells in chronic myelogenous leukemia patients in prolonged remission with imatinib treatment. Blood 2^H; їїВ[2Ш: 55В5—72.

В. Mustjoki S., Rohon P., Rapakko K. et al. Low or undetectable numbers of Philadelphia chromosome-positive leukemic stem cells

лейкозных клеток, которые характеризовались резистентностью к иматинибу. RI-BPI практически не оказывал какого-либо влияния на лейкозные клетки, тогда как комбинация иматиниб/RI-BPI приводила к быстрому апоптозу клеток и предотвращала восстановление их численности при дальнейшем культивировании. Таким образом, комбинация иматиниб/ RI-BPI предотвращает приобретение резистентности к ИТК. Для подтверждения этого факта, анализировался эффект комбинации иматиниб/RI-BPI на Ph + клетки, полученные от пациентов, у которых наблюдалась выраженная резистентность к иматинибу (но не обусловленная мутациями BCR—ABLD. Несмотря на то, что иматиниб не оказывал какого-либо заметного влияния на лейкозные клетки, комбинация иматиниб/RI-BPI восстанавливала чувствительность к иматинибу.

На заключительном этапе исследования авторы исследовали эффективность комбинации ингибиторов тирозин-киназ и BCL6 in vivo. Ph+ лейкозные клетки ОЛЛ метились люцефиразой и трансплантировались иммунодефицитным мышам. Реципиентам также вводились физиологический раствор, нилоти-ниб (более мощный ИТК) или комбинация нилотиниб/ RI-BPI. Все мыши, которые получали только нилоти-ниб, погибли по причине прогрессирования лейкоза к 99 дню после трансплантации. В то же время 7 из В мышей, получавшие комбинацию нилотиниб/RI-BPI оставались живыми к ї4^ дню наблюдения.

Проведенные токсилогические исследования показали, что в использованных концентрациях комбинация нилотиниб/RI-BPI не обладает существенной токсичностью для мышей.

Таким образом, в данном исследовании авторам удалось идентифицировать механизм возникновения резистентности к ИТК в Ph+ лейкозных клетках человека (ОЛЛ). Терапия ИТК, подавляя активность BCR—ABL1 -транскрипта, приводит к многократному возрастанию экспрессии фактора транскрипции BCL6, который также является известным протоонкогеном. BCL6 подавляет экспрессию важнейших регуляторов клеточного цикла Cdkn2a (Arf), Cdkn^ (p2D и p53, что снимает ограничения на пролиферацию ЛСК. Введение ингибитора BCL6 в дополнение к ИТК, подавляет экспрессию BCL6 и предотвращает приобретение лейкозными клетками резистентности к ИТК. Таким образом, при клиническом применении ингибиторов BCL6, вероятно, можно будет добиться значительных успехов в лечении Ph+ лейкозов, при которых в настоящее время практически в Ю^% наблюдается приобретение резистентности к ИТК и рецидивирование с течением времени.

[Ph[ + )CD34[ + )CD38[neg)) in chronic myeloid leukemia patients in complete cytogenetic remission after tyrosine kinase inhibitor therapy. Leukemia 2^Ю; 24(ї): 2ї9-22.

7. Saito M., Gao J., Basso K. et al. A signaling pathway mediating downregulation of BCL6 in germinal center B cells is blocked by BCL6 gene alterations in B cell lymphoma. Cancer Cell 2ВД7; ї2: ЗВ^—ВЗ.

В. Walker S.R., Nelson E.A., Frank D.A. STAT5 represses BCL6 expression by binding to a regulatory region frequently mutated in lymphomas. Oncogene 2ВД7; 2В: 224—ЗЗ.

9. Goldberg Z., Levav Y., Krichevsky S. et al. Treatment of chronic myeloid leukemia cells with imatinib [STI57U impairs p53 accumulation in response to DNA damage. Cell Cycle 2ВД4; З: їїВВ—95.

Ю. Skorta I., Oren M., Markwardt C. et al. Imatinib mesylate induces cisplatin hypersensitivity in Bcr-Abh cells by differential modulation of p53 transcriptional and proapoptotic activity. Cancer Res. 2Ш9; 69: 9ЗЗ7-45.

11. Williams R.T., Roussel M.F., Sherr C.J. Arf gene loss enhances oncogenicity and limits imatinib response in mouse models of Bcr-Abl-induced acute lymphoblastic leukemia. PNAS USA 2006; 103: 6688-93.

12. Krause D.S., Lazarides K., von Andrian U.H. et al. Requirement

for CD44 in homing and engraftment of BCR-ABL-expressing leukemic stem cells. Nature Med. 2006; 12: 1175-80.

13. Cerchietti L.C., Yang S.N., Shaknovich R. et al. A peptomimetic inhibitor of BCL6 with potent antilymphoma effects in vitro and in vivo. Blood 2009; 113: 3397-405.

По материалам:

Duy C., Hurtz C., Shojaee S. et al. BCL6 enables Ph+ acute lymphoblastic leukaemia cells to survive BCR-ABL1 kinase inhibition. Nature 2011; 473(7347): 384-8

П о д г о т о в и л Д.С. Иванов Поступила 25.10.2011

Редактирование генома 1РБ-клеток с помощью цинк-пальцевых эндонуклеаз - новые возможности в генной терапии

Одним из ключевых вопросов генной терапии является создание методов «тонкого» редактирования генома, которые позволяли бы проводить специфические манипуляции с генами прямо в их эндогенных локусах без существенного риска изменений ДНК других локализаций. Подобные методы могли бы стать мощным инструментом, позволяющим проводить коррекцию рецессивных или доминантных мутаций, как в клинических, так и в исследовательских целях. В полной мере предъявляемым требованиям соответствует разрабатываемая в настоящее время технология цинк-пальцевых эндонуклеаз [1].

Эндонуклеазы с цинковыми пальцами представляют собой искусственно созданные белки, состоящие из двух доменов: ДНК-связывающего домена и ДНК-расщепляющего домена. Основой ДНК-связывающего домена являются несколько одинаковых по строению структур, содержащих связанные с ионами цинка остатки аминокислот ци-стеина и гистидина. Эта полипептидная цепь имеет характерную вторичную структуру в виде а-спирали и антипараллельного р-слоя, которые выступают над поверхностью белковой глобулы (транскрипционного фактора) в виде «пальца». Вершины пальцев непосредственно контактируют с большой бороздкой ДНК, где они связываются с нуклеотидными триплетами. Один «цинковый палец» со строго определённой последовательностью аминокислот специфичен к определённому триплету нуклеотидных оснований. Изменения в последовательности аминокислот неконсервативной части цепи приводит и к изменению специфичности «цинкового пальца». В состав одного ДНК-связывающего домена цинк-пальцевой эндонуклеазы обычно включают 3 «цинковых пальца», благодаря чему эндонуклеаза связывается со специфической последовательностью ДНК, состоящей из 9 нуклеотидов. Более того, так как эндонуклеаза проявляет свою активность только при димеризации, необходимо, чтобы с ДНК-мишенью взаимодействовали сразу 2 цинк-пальцевые эндонуклеазы, которые связываются со специфической последовательностью, состоящей уже из 18 нуклеотидов. Такого количества оснований достаточно для обеспечения высокой специфичности связывания эндонуклеазы с необходимой ДНК-мишенью. Комбинирование «цин-

ковых пальцев» позволяет создавать цинк-пальцевые эндонуклеазы, которые специфично взаимодействует с любой необходимой последовательностью определенного числа нуклеотидов (18 и более).

ДНК-расщепляющая часть представляет собой нуклеазный домен рестриктазы FokI. FokI неспецифически «разрезает» ДНК с образованием двуните-вых разрывов, но эта активность проявляется только при димеризации нуклеазы. Следовательно, для проявления нуклеазной активности с ДНК-мишенью должны связаться сразу две цинк-пальцевых эндонуклеазы, причем с необходимыми для димеризации ориентацией и расстоянием друг от друга.

Таким образом, благодаря ДНК-связывающему домену цинк-пальцевые эндонуклеазы с высокой специфичностью связываются с интересующей ДНК-мишенью, тогда как благодаря нуклеазному домену, в интересующей точке возникает двунитевой разрыв ДНК. В ответ на повреждение ДНК закономерно активируются системы репарации. В эукариотических клетках репарация двунитевых разрывов ДНК осуществляется двумя высококонсервативными механизмами: с помощью соединения негомологичных концов (non-homologous end joining, NHEJ) и с помощью гомологичной рекомбинации (homology-directed repair, HDR) [2-3]. В результате NHEJ-репарации происходит быстрое лигирование двух разорванных концов ДНК. При этом ДНК может восстанавливать первоначальную структуру или может происходить выпадение (делеция) или вставка (инсерция) нуклеотидов. Этот процесс может быть использован для «нокаутирования» необходимого гена-мишени, так как инсерции и делеции, как правило, приводят к нарушению транскрипции генов. HDR-репарация происходит в присутствии гомологичной ДНК, которая может иметь как эндогенное, так и экзогенное происхождение (например, эписома). При введении цинк-пальцевых эндонуклеаз вместе с экзогенной ДНК (ДНК-донор), имеющей необходимую последовательность нуклеотидов, у части клеток можно ожидать HDR-репарации с участием экзогенной ДНК в виде матрицы. В зависимости от дизайна ДНК-донора можно добиться, например, устранения генетической мутации или наоборот внесения определенной мутации, трансгена и т.д. Таким образом,

технология цинк-пальцевых эндонуклеаз позволяет осуществлять «тонкое» редактирование генома.

Впервые возможность коррекции точечной мутации в нативных локусах клеток человека с помощью цинк-пальцевых эндонуклеаз была продемонстрирована в 2005 г. в работе Федора Урнова и соавт., являющихся сотрудниками биотехнологической компании Sangamo BioSciences [4]. В этом исследовании авторы использовали цинк-пальцевые эндонуклеазы, специфически связывающиеся с геном рецептора интерлейкина-2 (IL2R-y) в области мутации, которая является причиной связанного с X-хромосомой тяжелого комбинированного иммунодефицита. В результате гомологичной рекомбинации между соответствующим локусом и ДНК-донором в 18% клеток линии K562 произошла коррекция одного аллеля гена IL2R-Y, а в 8% клеток сразу двух аллелей. В этих клетках инициировался синтез IL2R-Y.

Развитие технологии позволило инициировать клинические испытания технологии цинк-пальцевых эндонуклеаз для создания высокоспецифичных цито-токсических Т-лимфоцитов для иммунотерапии глио-бластомы и для получения гемопоэтических клеток с устойчивым к ВИЧ генотипом [5, 6]. Разработанная технология поразила своими возможностями научную общественность - в 2008 г. редакция The Scientist признала CompoZr (коммерческое название технологии) одним из наиболее выдающихся продуктов года.

Одним из наиболее востребуемых аспектов технологии цинк-пальцевых эндонуклеаз является коррекция генетических дефектов в аутогенных плюри-потентных клетках, например, в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (иПС-клетки). иПС-клетки с отредактированным геномом можно размножить в культуре, подвергнуть дифференци-ровке и использовать в дальнейшем для исследовательских и клинических целей. Сразу несколько научных групп опубликовали свои работы в Nature, Blood и Stem Cells, в которых доказали принципиальную возможность коррекции мутаций в иПС-клетках с помощью цинк-пальцевых эндонуклеаз.

L. Vallier с соавт. из Кембриджского университета в качестве изучаемой модели выбрали ген антитрипсина (A1AT), мутация которого является причиной наследственного дефицита а-1-антитрипсина, проявляющегося тяжелым поражением легких (эмфизема) и печени (цирроз). Точечная мутация (Z-мутация)

ЛИТЕРАТУРА:

1. Urnov F.D., Rebar E.J., Holmes M.C. et al. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 2010; 11(9): 636-46.

2. Moynahan M.E., Jasin M. Mitotic homologous recombination maintains genomic stability and suppresses tumorigenesis. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2010; 11: 196-207.

3. Lieber, M.R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annu. Rev. Biochem. 2010; 79: 181-211.

приводит к замене аминокислот в 342 позиции, в результате чего синтезируемый белок полимеризу-ется в цитоплазматическом ретикулуме гепатоцитов. Авторы сконструировали пары цинк-зависимых эндонуклеаз, разрезающих ДНК в области Z-мутации. В качестве ДНК-донора использовалась не имеющая мутации изогенная гомологичная ДНК, встроенная в piggyBac-траснпозон. иПС-клетки, у которых происходила коррекция двух аллелей A1AT, подвергали дифференцировке в гепатоцито-подобные клетки. С использованием флюоресценции и ELISA авторы показали отсутствие в этих клетках полимеров мутантного антитрипсина. Более того, гепатоцито-подобные клетки синтезировали и секретировали нормальную мономерную форму этого белка, которая обладала ингибирующей трипсин активностью.

Научные группы L. Cheng из медицинской школы университета Джона Хопкинса и M. Wernig из медицинской школы Стэнфордского университета, в качестве модели выбрали серповидноклеточную анемию. В геноме больных серповидноклеточной анемией оба аллеля бета-глобина представлены ps-формами (ps-мутация). Точечная мутация в 6 кодоне приводит к замене аминокислоты Glu на Val. Это служит причиной образования дефектной формы гемоглобина. Обе научные группы независимо сконструировали пары цинк-зависимых эндонуклеаз, специфично связывающихся с первым экзоном гена бета-глобина и разрезающие ДНК в месте точечной мутации. В качестве ДНК-донора использовались плазмидные векторы с гомологичной ДНК, несущей pA-аллельный вариант гена. иПС-клетки, в которых происходила коррекция гена бета-глобина, подвергали дифференцировке в эритроидном направлении. Полученные клетки экспрессировали pA-варианты р-глобина.

Таким образом, цинк-пальцевые эндонуклеазы значительно расширяют наши возможности в коррекции генетических заболеваний. Необходимо отметить, что использование этой технологии сопровождается минимальным риском двунитевых разрывов ДНК в других локализациях. Повышение специфичности связывания эндонуклеаз и вовсе сводит эту проблему к нулю. Тем не менее, в техническом плане создание цинк-пальцевых нуклеаз в настоящий момент пока еще представляет собой сложную процедуру, что и ограничивает широкое применение этой уникальной технологии.

4. Urnov F.D., Miller J.C., Lee Y.-L. et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature 2005; 435: 646-51.

5. Reik A. Zinc finger nucleases targeting the glucocorticoid receptor allow IL-13 zetakine transgenic CTLs to kill glioblastoma cells in vivo in the presence of immunosuppressing glucocorticoids. Mol. Ther. 2008; 16: S13-S1.

6. Holt N., Wang J., Kim K. et al. Human hematopoietic stem/ progenitor cells modified by zinc-finger nuclease targeted to CCR5 control HIV-1 in vivo. Nature Biotech. Nat. Biotechnol. 2010; 28(8): 839-47.

По материалам:

Urnov F.D., Rebar E.J., Holmes M.C. et al. Genome editing with engineered zinc finger nucleases.

Nat. Rev. Genet. 2010; 11(9): 636-46. Yusa K., Rashid S.T., Strick-Marchand H. et al. Targeted gene correction of а-1-antitrypsin deficiency in induced

pluripotent stem cells. Nature 2011; 478(7369): 391-4. Zou J., Mali P., Huang X. et al. Site-specific gene correction of a point mutation in human iPS cells derived from an adult

patient with sickle cell disease. Blood 2011; 118(17): 4599-608. Sebastiano V., Maeder M.L., Angstman J.F. et al. In situ genetic correction of the sickle cell anemia mutation in human induced pluripotent stem cells using engineered zinc finger nucleases. Stem Cells 2011; 29(11): 1717-26

П о д г о т о в и л А.Г. Малюта Поступила 31.10.2011

Удаление р161пк4а-позитивных клеток приводит к замедлению развития возрастных дегенеративных процессов у ЬиЬг1 мышей

Пожилой возраст является одним из основных факторов риска многих хронических заболеваний и функциональной недостаточности тканей и органов. Однако фундаментальные механизмы, лежащие в основе процесса старения людей, до сих пор остаются неизученными. Это препятствует разработке каких-либо методов профилактики или лечения, направленных на предотвращение или замедление прогрессирования ассоциированных с пожилым возрастом заболеваний, а также на увеличение продолжительности жизни и повышения ее качества.

Согласно одной из гипотез старение целого организма тесно связано с клеточным (репликативным) старением клеток. Под репликативным старением подразумевают ограниченную способность клеток к делению, впервые описанную L. Hayflick в 1965 г. [1]. Репликативное старение играет важную роль в сдерживании злокачественной прогрессии трансформированных клеток [2]. Клетки в фазе репликативного старения (SEN-клетки) накапливаются в разных тканях и органах с возрастом [3] и, как предполагается, нарушают структуру тканей и их функции благодаря секреции обширного спектра молекул, ассоциированных с воспалением и злокачественной трансформацией [4, 5]. Тем не менее, являются ли SEN-клетки непосредственной причиной ассоциированных с возрастом патологических изменений и можно ли добиться каких-либо положительных изменений при полном их удалении, остается неизвестным.

Чтобы получить ответы на эти вопросы, группа ученых из медицинского колледжа клиники Мейо, возглавляемая профессором Jan van Deursen, сконструировала новый трансген, предназначенный для селективной элиминации SEN-клеток. Результаты проведенного исследования опубликованы в Nature.

Несмотря на то, что в настоящее время не выявлен универсальный маркер, который экспрессируется исключительно в SEN-клетках, большинство стареющих клеток характеризуются высокой степенью экспрессии p16Ink4a, являющегося циклин-зависимым ингибитором киназы и опухолевым супрессором, который обеспечивает остановку пролиферации путем активации гена ретинобластомы (Rb) [5]. Экспрессия p16Ink4a увеличивается с возрастом во многих тканях млекопитающих [6].

Авторы сконструировали вектор INK-ATTAC. Экспрессия вектора контролируется промотором гена p16Ink4a. Основным продуктом трансгена является FKBP-Casp8 химерный белок, который вскоре после синтеза связывается с внутренней поверхностью клеточной мембраны. Введение синтетического препарата AP20187 индуцирует димеризацию химерного белка и активацию каспазы-8, что, в свою очередь, приводит к апоптозу. Таким образом, результатом внесения созданной генетической конструкции и воздействия является апоптоз SEN-клеток, в которых наблюдается высокий уровень экспресии p16Ink4a.

Кроме того, для визуализации БЕ^кпеток в состав вектора был включен ген GFP. Введение ^К-АТТАС в оплодотворенные бластоцисты позволило получить несущие трансген линии клеток.

Для дальнейших экспериментов были получены мыши линии В1^1Н/Н, несущие ^К-АТТАС трансген. В1^1Н/Н мыши имеют короткую продолжительность жизни, у них рано выявляются разнообразные изменения, которые ассоциируются с процессом старения, включая бесплодие, лордокифоз, саркопению, катаракту, значительное снижение массы жировой ткани, аритмии, кальцификацию стенок артерий, медленное заживление ран и истончение кожных покровов. У мышей этой линии накапливаются р161пк4а-позитивные клетки в тканях, в которых наблюдаются дегенеративные процессы, включая подкожножировую клетчатку, скелетные мышцы и глаза.

Может ли удаление р161пк4а-позитивных БЕ^ клеток предотвращать или замедлять прогрессию возрастных изменений у выбранной линии мышей? Для ответа на этот вопрос использовали два экспериментальных протокола. Согласно первому протоколу В1^1Н/Н/^К-АТТАС мыши получали АР20187 каждый третий день, начиная с 3-недельного возраста. Контрольная группа В1^1Н/Н/^К-АТТАС мышей препарат не получала. Производился мониторинг динамики развития связанных со старением дегенеративных процессов, которые тесно ассоциируются с появлением в тканях р161пк4а-позитивных БЕ^ клеток, включая саркопению, катаракту и уменьшение объема жировой ткани. У мышей, которые получали препарат, лордокифоз (в этой модели характеризует саркопению) и катаракта развивались в значительно более отдаленные сроки. Эти же животные, в сравнении с контрольной группой, могли переносить гораздо более выраженные физические нагрузки, что говорило о сохранении мышечных функций. Введение препарата также предотвращало снижение объема подкожно-жировой клетчатки. Такие изменения, как сердечные аритмии, кальцификация стенок артерий развивались в обеих группах мышей примерно в одно время и в одинаковой степени. Это соответствовало прогнозам, так как эти изменения не ассоциируются с накоплением р161пк4а-позитивных БЕ^клеток

[7]. По этой же причине средняя продолжительность жизни обеих групп мышей существенно не различалась, так как основной причиной смерти мышей этой линии является сердечная недостаточность. У мышей, которым длительное время вводился препарат, не выявлялось каких-либо побочных эффектов.

Во втором экспериментальном протоколе В1^1Н/Н/^К-АТТАС мыши получали АР20187 каждый третий день с 5- до 10-месячного возраста, т.е. когда уже наблюдаются возрастные дегенеративные процессы. Осмотр 10-месячных мышей показал, что введение препарата не оказывало какого-либо влияния на уже созревшие к 5-месячному возрасту катаракты. Однако, у мышей экспериментальной группы,

в сравнении с контрольной группой, наблюдалось увеличение диаметра мышечных волокон, сопровождающееся повышением производительности в тестах с мышечной нагрузкой. Более того, возрастал объем подкожно-жировой клетчатки, а адипоциты увеличивались в диаметре.

Таким образом, в данном исследовании было показано, что в выбранной экспериментальной модели удаление p16Ink4a-позитивных SEN-клеток

ЛИТЕРАТУРА:

1. Hayflick L. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. Exp. Cell Res. 1965; 37: 614-36.

2. Campisi J. Cellular senescence: putting the paradoxes in perspective. Curr. Opin. Genet. Dev. 2011; 1: 107-12.

3. Campisi J. Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors. Cell 2005; 120: 513-22

4. Coppe J.P., Patil C.K., Rodier F. et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of

замедляет развитие возрастных дегенеративных процессов в тканях, для которых характерно накопление этих клеток. Эти данные свидетельствуют

о существенном вкладе репликативного старения в процессы старения всего организма. Проведенные proof-of-principle эксперименты указывают на перспективность разработки терапевтических подходов, направленных на удаление SEN-клеток или блокирование их эффектов.

oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biol. 2008; 6(12): 2853-68.

5. Rodier F., Campisi J. Four faces of cellular senescence. J. Cell Biol. 2011; 192(4): 547-56.

6. Krishnamurthy J., Torrice C., Ramsey M.R. et al. Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging. J. Clin. Invest. 2004; 114(9): 1299-307.

7. Matsumoto T., Baker D.J., d'Uscio L.V. et al. Aging-associated vascular phenotype in mutant mice with low levels of BubR1. Stroke 2007; 38(3): 1050-6.

По материалам:

Baker D.J., Tobias Wijshake T, Tamar Tchkonia T. et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays

ageing-associated disorders. Nature 2011; 479:232-6

П о дг о т о в и л Г.К. Жуков Поступила 29.11.2011

Эффективность лечения повреждений костей аутогенными мультипотентными мезенхимными стромальными клетками зависит от секретируемых Т-лимфоцитами цитокинов

Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки костного мозга (ММСК КМ) представляют собой неоднородную популяцию клеток, способных к дифференцировке в клетки мезенхимального ряда, таких как остеоциты, хондроциты и адипоци-ты (ортодоксальные направления дифференциров-ки). В связи с этим представляется перспективным использовать эту популяцию клеток для клеточной терапии патологии костей. В многочисленных доклинических и клинических исследованиях было показано, что локальное введение только ММСК КМ или в комбинации с носителем способствует регенерации костной ткани [1, 2]. Именно поэтому представляется целесообразным использовать ММСК КМ для лечения сложных переломов и повреждений большого объема костной ткани, то есть в тех случаях, когда имеется дефицит собственных ресурсов для осуществления полноценной репарации.

В многочисленных исследованиях также было показано, что ММСК КМ обладают уникальными иммуномодулирующими свойствами [3]. Они способны ингибировать пролиферацию активированных лимфоцитов, снижать продукцию провоспалительных цитокинов, подавляя, таким образом, воспалительный процесс. Именно поэтому, в настоящий момент изучается возможность применения ММСК КМ для лечения «реакции трансплантат против хозяина» и некоторых аутоиммунных заболеваний.

С другой стороны, еще в конце 60-х годов XX в. в работах А.Г. Бабаевой было показано, что клетки иммунной системы могут регулировать лежащую в основе процессов регенерации пролиферативную активность клеток-предшественниц [7], к которым можно отнести и ММСК. Так, например, в более поздних работах было показано, что активированные NK-и Т-клетки могут активировать апоптоз аутогенных ММСК КМ, например за счет классического Fas-FasL сигнального каскада [4, 5]. Таким образом, взаимодействие ММСК КМ с клетками иммунной системы имеет более сложный характер и не исключено, что от характера этого взаимодействия зависит эффективность клеточной терапии с использованием ММСК КМ.

Исследовательская группа Songtao Shi из университета Южной Калифорнии опубликовала в Nature Medicine результаты своего исследования, в котором показано, что Т-лимфоциты оказывают ключевое влияние на эффективность введения аутогенных ММСК КМ в целях лечения патологии костной ткани.

На первом этапе исследования 4х106 адсорбированных на частицах гидроксиапатита ММСК КМ вводились подкожно сингенным мышам линии C57BL/6 или иммунодефицитным мышам линии nude. Был получен неожиданный результат - у nude-мышей в месте введения формировались очаги остеогенеза и кроветворения, тогда как формирования подобных

очагов у сингенных мышей не наблюдалось. Если за два дня до трансплантации ММСК КМ nude-мышам вводились 1х106 Т-лимфоцитов, формирование костной ткани полностью блокировалось. Полученные данные означали, что Т-лимфоциты подавляют остеогенез, опосредованный вводимыми ММСК.

Авторы предположили, что ингибирование образования костной ткани опосредовано секретируемыми Т-клетками цитокинами. Анализ динамики концентраций различных цитокинов, включая IFN-y, TNF-а, IL-4, IL-6 и IL-17A, показал, что подавление остеогенеза ассоциируется с повышенными концентрациями IFN-y и TNF-а. Введение 200 нг IFN-y и TNF-а nude-мышам одновременно с трансплантацией ММСК КМ полностью подавляло формирование костной ткани, тогда как введение других цитокинов слабо влияло на этот процесс. Дополнительное введение анти-IFN-Y и анти-TNF^ антител аннулировало описанный эффект. Введение сингенным мышам линии C57BL/6 за 2 дня до трансплантации ММСК КМ регуляторных Т-лимфоцитов приводило к появлению очагов остеогенеза. Анализ уровней цитокинов показал, что введение регуляторных Т-клеток сопровождалось значительным снижением концентраций IFN-y и TNF-а.

В дальнейших экспериментах было показано, что IFN-y в доза-зависимой манере ингибирует диффе-ренцировку ММСК КМ в остеогенном направлении in vitro. Инкубация с IFN-y приводила к увеличению экспрессии фактора транскрипции Smad6, являющегося негативным регулятором остеогенной диффе-ренцировки, и значительному снижению экспрессии генов Runx2, остеокальцина, и щелочной фосфата-зы. Культивирование ММСК КМ с TNF-а приводило к индукции апоптоза клеток в доза-зависимой манере. Дополнительное введение IFN-y усиливало этот эффект. Индукция апоптоза ММСК КМ при воздействии относительно высоких концентраций IFN-y и TNF -а была подтверждена и в опытах in vivo. Детальное изучение механизмов действия IFN-y и TNF-а на ММСК КМ показало ключевую роль Fas-сигнального каскада.

Авторы предположили, что негативные эффекты IFN-y и TNF-а на приживление и дифференцировку

ЛИТЕРАТУРА:

ї. Деев Р.В., Цупкина Н.В., Николаенко Н.С. и др. Использование стромальных клеток костного мозга, мобилизованных на гранулах биоситалла, для пластики костей мозгового черепа. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2ВД7; IK2): 62—7.

2. Деев Р.В., Исаев А.А., Кочиш А.Ю. и др. Клеточные технологии в травматологии и ортопедии: пути развития. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2ВД7; IK4): їВ—З^.

3. Сергеев В.С. Иммунологические свойства мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2ВД5; IC2): З9—42.

4. Spaggiari G.M., Capobianco A., Becchetti S. et al. Mesenchymal

трансплантируемых ММСК КМ можно подавлять фармакологически. Для проверки этой гипотезы у мышей дикого типа формировались крупные по размеру дефекты костей свода черепа. У таких мышей через 12 нед. после операции наблюдалось формирование лишь небольшого количества новой костной ткани по краям дефекта. Введение ММСК КМ в геле в область дефекта приводило к интенсификации остеогенеза, однако полное закрытие дефекта новой костной тканью все равно не наблюдалось. В качестве фармакологического агента использовался аспирин, введение которого, как было описано ранее, приводит значительному снижению концентраций ^1\1-у и Т^-а, а также подавлению их функций [6]. Введение ММСК-КМ в геле вместе с аспирином (25—200 мг) приводило к значительно более выраженной репарации костной ткани в области дефекта костей свода черепа в сравнении с контрольной группой без добавления аспирина. Сформированные костные структуры по морфологическому строению соответствовали нормальным костям свода черепа. Введение доз аспирина от 100 мг приводило к полному восстановлению черепных швов.

Таким образом, в данном исследовании было показано, что Т-лимфоциты могут подавлять остеогенную дифференцировку и даже стимулировать апоптоз вводимых сингенных ММСК КМ у мышей. Этот эффект опосредуется цитокинами, и в частности, ^1\1-у и Т^-а. Фармакологически подавляя продукцию ^1\1-у и Т^-а, можно значительно улучшить репарацию костной ткани, инициируемую введением ММСК КМ.

Результаты этого исследования могут иметь и более глобальные последствия, так как на сегодня очень мало известно о влиянии клеток иммунной системы на другие перспективные в плане регенеративной медицины типы клеток. Несомненно, эта работа заставит обратить внимание на эту проблему, так как, как показано в приведённом примере, дополнительные фармакологические воздействия могут значительно улучшить результаты клеточной терапии.

stem cell-natural killer cell interactions: evidence that activated NK-cells are capable of killing MSCs, whereas MSCs can inhibit IL-2— induced NK-cell proliferation. Blood 2006; 107: 1484-90.

5. Yamaza T., Miura Y., Bi Y. et al. Pharmacologic stem cell based intervention as a new approach to osteoporosis treatment in rodents. PLoS One 2008; 3(7): e2615.

6. Kwon M.S., Shim E.J., Seo Y.J. et al. Effect of aspirin and acetaminophen on proinflammatory cytokine-induced pain behavior in mice. Pharmacology 2005; 74(3): 152-6.

7. Бабаева А.Г., Краскина Н.А., Лиознер Л.Д. Усиление митотической активности клеток печени неоперированных мышей под влиянием лимфоидных клеток частично гепатэктомированных доноров. Цитология 1969; 12: 1511-20.

По материалам:

Liu Y, Wang L, Kikuiri T. et al. Mesenchymal stem cell-based tissue regeneration is governed by recipient T lymphocytes via IFN-y and TNF-а. Nat Med. 2011; 17(12): 1594-601

П о д г о т о в и л А.В. Суворов Поступила 30.11.2011

КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Г-КСФ и хромосомные аномалии у доноров мобилизованных гемопоэтических стволовых клеток -результаты проспективного исследования

Рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) в настоящее время широко используется в клинике для мобилизации гемопо-этических стволовых и прогениторных клеток (ГСК) из костного мозга в кровь. Обогащенная незрелыми гемопоэтическими клетками кровь является одним из наиболее оптимальных ресурсов ГСК для проведения аутологичных и аллогенных трансплантаций. По данным специалистов Национальной программы доноров костного мозга (National Marrow Donor Program (NMDP)) с 1999 года доля трансплантаций мобилизированных ГСК крови по сравнению с трансплантациями ГСК из других источников существенно увеличивается [1]. И прежде всего это связано с более быстрым восстановлением критических уровней клеток крови и меньшим количеством инфекционных осложнений в раннем периоде [2].

Однако с 2004 по 2008 гг. в научных журналах было опубликовано сразу несколько сообщений, в которых говорилось о развитии у доноров мобилизованных ГСК крови через 1-5 лет после процедуры тяжелого заболевания - острого миелойдного лейкоза (ОМЛ) [3-5]. Было сделано предположение, что развитие ОМЛ было спровоцировано генотоксическим эффектом кратковременного воздействия Г-КСФ, который проявлялся в отдаленном периоде. Возникла реальная угроза полного запрета применения данного препарата в клинике. Тем не менее, при анализе данных регистров доноров костного мозга были получены более объективные данные о риске развития ОМЛ. Так M. Pulsipher проанализировал 2408 доноров, зарегистрированных в NMDP с 1999 по 2004 г. и получавших Г-КСФ с медианой времени после приема препарата в 49 мес., и не выявил ни одного случая развития ОМЛ [6]. Эти данные успокоили общественность, однако вопрос о генотоксическом эффекте кратковременного приема Г-КСФ все еще остается открытым.

В достаточно большом количестве исследований изучался генотоксический эффект Г-КСФ на клетки крови и костного мозга in vitro и in vivo. Были получены разные, часто противоречащие результаты: отсутствие какого-либо эффекта, репликационная асинхрония синтеза ДНК, тетраплоидия, характерные для ОМЛ хромосомные нарушения в виде моно-сомии хромосомы 7 [7-10]. Тем не менее, для всех этих исследований были характерны существенные недостатки: недостаточно тщательное планирование; многие из них проводились только in vitro, где нельзя было исключать роли других факторов; практически во всех не изучался генотоксический эффект Г-КСФ в отдаленном периоде.

Исследовательская группа J. McCullough провела детальное проспективное исследование, в котором

изучалась связь между введением Г-КСФ и возникновением аномалий в хромосомных регионах, ассоциированных с ОМЛ и миелодиспластическим синдромом (МДС). Результаты этого исследования недавно были опубликованы в Blood.

В работе использовался метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) для оценки хромосомных аномалий у лимфоцитов периферической крови 22 доноров мобилизованных ГСК и 22 здоровых людей (контроль) в течение года. Исследования проводились перед введением Г-КСФ, через 5-7 дней после, а также через 2, 6 и 12 мес. после донорства крови. Также исследовались образцы от еще 8 доноров, полученные через 12 мес. после донорства.

Для выявления анеуплоидий использовались 8 зондов, специфичных к определенным локусам на 6 разных хромосомах (7, 8, 9, 17, 21 и 22). Поскольку ранее сообщалось об ассоциации применения Г-КСФ и экспансии клеток с моносомией

7 хромосомы [11], для ее маркирования применяли сразу три специфичных зонда: CEN7(p10q10), elastin (ELN)(7q11.23) и D7S486(7q32). Локусы RUNX1T1 (8q22), TP53(17p13) и RUNX1 (21 q22) были включены на основании высокой частоты их аномалий при МДС и ОМЛ. CEN 17 (17p10q10) использовался по причине его использования в предыдущих работах [9]. Наконец, локусы ABL1 (9q34) и BCR(22q11.2) были включены для увеличения общего количества исследуемых хромосом.

Одним из методов выявления хромосомных аномалий является идентификация асинхронной репликации гомологичных аллелей. Для проведения этого исследования в работе использовались зонды к им-принтируемому локусу SNRPN (15q11.2), а также к субтеломерному локусу (15q26) и TP53 (17p13), которые никогда не были описаны как импринти-руемые. Перед исследованием клетки подвергались культивированию, так как репликация может быть оценена только при делении клеток.

Для всех исследуемых групп в течение всего времени наблюдения наименьшее среднее количество клеток с анеуплоидией составило около 1% при использовании зонда к RUNX1T1 (8q22) локусу. Наибольшее количество анеуплоидных клеток составило 4% при использовании зонда к CEN 17 (17p10q10) локусу. Ни в одном случае, как в экспериментальной группе, так и в контроле, авторам не удалось обнаружить пороговых количеств патологических клеток с моносомией/трисомией/тетраплоидией, для того чтобы сделать вывод о развитии патологического состояния. Не было выявлено статистически значимых различий в количестве клеток с анеуплоидией между экспериментальными и контрольными группами на протяжении всех этапов исследования. Таким

образом, кратковременная терапия Г-КСФ не индуцирует появление аномального количества клеток с анеуплоидией по хромосомам 7, 8, 9, 17, 21 и 22, что, по мнению авторов, с высокой степенью вероятности можно предположить и для других хромосом.

Сравнение экспериментальной и контрольной групп для каждого из трех зондов, используемых для исследования репликации, также показало отсутствие статистически значимого увеличения количества асинхронно реплицирующихся клеток у людей, которым вводился Г-КСФ, на всех этапах исследования. Таким образом, кратковременная

ЛИТЕРАТУРА:

1. Ballen K.K., King R.J., Chitphakdithai P. et al. The National Marrow Donor Program 20 years of unrelated donor hematopoietic cell transplantation. Biol. Bld. Marrow Transplant 2008; 14:2-7.

2. Pusic I., DiPersio J.F. The use of clinical factors in hematopoietic stem cell transplantation. Current Pharmaceutical Design 2008; 14(20): 1950-61.

3. Bennett C.L., Evens A.M., Andritsos L.A. et al. Haematological malignancies developing in previously healthy individuals who received haematopoietic growth factors: report from the Research on Adverse Drug Events and Reports (RADAR) project. Br. J. Haematol. 2006; 135(5): 642-50.

4. Hsia C.C., Linenberger M., Howson-Jan K. et al. Acute myeloid leukemia in a healthy hematopoietic stem cell donor following past exposure to a short course of G-CSF. Bone Marrow Transplant. 2008; 42(6): 431-2.

5. Makita K., Ohta K., Mugitani A. et al. Acute myelogenous leukemia in a donor after granulocyte colony-stimulating factor-primed peripheral blood stem cell harvest. Bone Marrow Transplant. 2004; 33(6): 661-5.

6. Pulsipher M.A., Chitphakdithai P., Miller J.P. et al. Adverse

терапия Г-КСФ не вызывает значительных изменений в синхронности репликации каждого из исследованных локусов.

Таким образом, в данном исследовании не было выявлено увеличения анеуплоидных клеток и изменения кинетики репликации клеток периферической крови у доноров мобилизованных ГСК в течение года после введения Г-КСФ. Вместе с полученными ранее данными эпидемиологических исследований это работа создает прочный фундамент для безопасного применения Г-КСФ в целях мобилизации ГСК.

events among 2,4^В unrelated donors of peripheral blood stem cells: results of a prospective trial from the National Marrow Donor Program. Blood 2Ш9; їїЗИ5): 3604-11.

7. Kaplinsky C., Trakhtenbrot L., Hardan I. et al. Tetraploid myeloid cells in donors of peripheral blood stem cells treated with rhG-CSF. Bone Marrow Transplant. 2ВДЗ; З2(ї): Зї—4.

В. Shapira M.Y., Kaspler P., Samuel S. et al. Granulocyte colony stimulating factor does not incduce long-term DNA instability in healthy peripheral blood stem cell donors. Am. J. Hematol. 2ВДЗ; 7З(ї): ЗЗ-6.

9. Nagler A., Korenstein-Ilan A., Amiel A. Et al. Granulocyte colony-stimulating factor generates epigenetic and genetic alterations in lymphocytes of normal volunteer donors of stem cells. Experimental Hematology 2Ш4; З2И): ї22-За

Ю. Nagasawa M., Tomizawa D., Tsuji Y. al. Pancytopenia presenting with monosomy 7 which disappeared after immunosuppressive therapy. Leukemia Research 2ВД4; 2В(З): Зї5—9.

її. Sloand E.M., Yong A.S.M., Ramkissoon S. et al. Granulocyte colony-stimulating factor preferentially stimulates proliferation of monosomy 7 cells bearing the isoform IV receptor. PNAS 2ВДВ; ЮЗ(З9): ї44ВЗ—В.

По материалам:

Hirsch B, Oseth L, Cain M. et al. Effects of granulocyte-colony stimulating factor on chromosome aneuploidy and replication asynchrony in healthy peripheral blood stem cell donors. Blood 2011; 118(9): 2602-8

П о д г о т о в и л А.Г. Малюта Поступила 09.09.2011

Первый в мире случай трансфузии человеку эритроцитов, полученных in vitro

Трансфузия эритроцитарной массы является одним из немногих эффективных методов лечения патологических состояний, при которых наблюдается недостаточная оксигенация тканей. Несмотря на то, что ежегодно в мире заготавливается более 75 млн образцов крови [1], часто возникают ситуации острого дефицита этих препаратов. Поэтому усилия многих исследовательских групп вплоть до настоящего времени направлены на разработку кровезамещающих растворов - переносчиков кислорода (модифицированный гемоглобин, перфторуглеродные соединения и др.). С другой стороны, в связи с появлением эффективных протоколов дифференцировки плюрипотентных и гемопоэтических стволовых клеток, реальной альтернативой классическим продуктам для трансфузий могут стать получаемые in vitro эритроциты. Соблюдение условий GMP и стандартизация производства будут служить залогом их вы-

сокого качества и значительно более низкого риска переноса инфекционных агентов.

В настоящее время можно добиться полного созревания клеток эритроидного ряда in vitro вплоть до стадии энуклеации при культивировании гемопоэ-тических стволовых клеток (ГСК) периферической крови, костного мозга, пуповинной крови, печени плода, а также при культивировании ЭСК и иПСК [2]. Тем не менее, еще не было описано реальных случаев введения получаемых в культурах эритроцитов человеку, а значит, возможность применения такого продукта в клинике оставалась гипотетической.

1 сентября 2011 г. в on-line версии Blood опубликована работа большой группы французских ученых и клиницистов, возглавляемых профессором Luc Douay, в которой сообщается о проведении первой в мире инфузии выращенных in vitro эритроцитов человеку.

Для получения эритроцитов в исследовании использовалась одна из модификаций разработанного ранее протокола культивирования и дифферен-цировки ГСК [3]. На первом этапе авторы изучали основные характеристики получаемых эритроцитов и пытались получить ответы на ряд ключевых вопросов: насколько зрелыми являются получаемые в использованных условиях энуклеированные клетки?; способны ли они осуществлять свойственные эритроцитам функции?; можно ли их подвергнуть консервации для последующего использования?; какова судьба этих клеток при их введении иммунодефицитным мышам? Получение таких данных было необходимо для обоснования проведенной в дальнейшем инфу-зии человеку выращенных в культуре эритроцитов, меченных радиоактивной меткой (51Cr).

После кратковременного курса Г-КСФ у доноров забиралась обогащенная гемопоэтическими клетками кровь, которая подвергалась лейкаферезу. CD34+клетки выделялись с помощью иммуномаг-нитной сепарации и культивировались в среде, поддерживающей дифференцировку в эритроидном направлении. Амплификация клеток достигала плато к 18 сут. культивирования. К этому времени их количество увеличивалось в среднем в 61,5 тыс. раз. Процент энуклеированных клеток составлял около 80%. На этом этапе абсолютное большинство клеток имело фенотип ретикулоцитов, что было выявлено визуально при окрашивании метиленовым синим и с помощью проточной цитометрии при окрашивании thiazole-orange. Средние показатели индексов эритроцитов MCV (mean cell volume), MCH (mean cell hemoglobin) иMCHC (mean corpuscular hemoglobin concentration) составили соответственно 138±4,2 фл, 35±1,6 пг и 25±0,5%, соответственно. Показатель MCV в сравнении с нативными ретикулоцитами был несколько увеличен. Соответствие ретикулоцитам было подтверждено и при анализе иммунофенотипа -исследуемые клетки экспрессировали гликофорин A, трансферриновый (CD71) и тромбоспондиновый (CD36) рецепторы.

Полученные в культуре эритроциты содержали в среднем 88-90% гемоглобина А (нормальный гемо-

глобин эритроцитов взрослого человека) и 10-12% фетального гемоглобина, что в 10 раз превышает его содержание у взрослых людей. Изучение кривых равновесия показало, что суспензия культивированных эритроцитов обратимо связывала кислород аналогично нативным эритроцитам.

Меченные культивированные эритроциты вводились иммунодефицитным мышам (NOD/SCID). Отслеживая их судьбу, авторы показали, что в течение трех дней эти клетки претерпевали ряд изменений, которые свидетельствовали об их окончательном созревании in vivo: уменьшались в размерах; приобретали характерную дисковидную морфологию; подавлялась характерная для ретикулоцитов экспрессия CD71; терялись остатки нуклеиновых кислот.

Изучение экспрессии антигенов на поверхности культивированных и нативных эритроцитов, полученных от одного донора, не выявило различий по каким-либо групповым антигенным системам, за исключением антигена H. Тем не менее, более низкий уровень H-антигена на культивированных клетках не оказывал существенного влияния на экспрессию антигенов системы AB0.

Аналогично нативным эритроцитам, очищенные культивированные клетки сохраняли все свои свойства после 4-недельного хранения при +4°C в консервирующей жидкости.

Получив удовлетворительные ответы на поставленные ранее вопросы, авторы выполнили инфузию культивированных эритроцитов человеку. В условиях, соответствующих стандартам GMP, 106 CD34+ ГСК были подвергнуты экспансии до общего количества 3,7х1010 клеток, у 68% из которых не было ядра. Клетки были пропущены через задерживающий лейкоциты фильтр. После мечения 51Cr полученные эритроциты вводились человеку. Выживаемость эритроцитов отслеживалась от 1 ч до 26 сут. от введения. Результаты, представленные как доля выживших клеток в период времени, представлены в таблице. В зависимости от использованных для расчетов средних скоростей высвобождения хрома (от 0,6 до 2,2% в сут.) к 26 дню в крови реципиента циркулировало от 41 до 63% введенных эритроцитов (табл.).

Доля выживших клеток в разные сроки наблюдения

Время сбора (дни после инфузии)

к = 0,6

к = 1,2

к = 2,2

100%

100%

100%

94%

96%

100%

14

68%

74%

86%

26

41%

48%

63%

к - коэффициент высвобождения хрома (по данным литературы)

0

5

Таким образом, авторы опубликованного сообщения впервые в мире провели инфузию выращенных in vitro эритроцитов человеку. Приблизительная оценка выживаемости показала, что около половины введенных клеток циркулировали в крови реципиента на 2В сут. после введения. Аналогичные показатели выживаемости эритроцитов характерны и при ин-

фузии нативных клеток. Кроме того, в проведенных экспериментах было показано, что культивированные эритроциты обладают всеми необходимыми морфологическими и функциональными характеристиками. Вместе эти данные создают основу для использования полученных in vitro эритроцитов в дальнейших клинических испытаниях.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Klein H.G, Spahn D.R, Carson J.L. Red blood cell transfusion in clinical practice. Lancet 2007; 370(9585): 415-26.

2. Migliaccio A.R., Whitsett C., Migliaccio G. Erythroid cells in

vitro: from developmental biology to blood transfusion products. Curr. Opin. Hematol. 2009; 16(4): 259-68.

3. Giarratana M.C., Kobari L., Lapillonne H. et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat. Biotechnol. 2005; 23(1): 69-74.

По материалам:

Giarratana M.C., Rouard H., Dumont A. et al. Proof of principle for transfusion of in vitro generated red blood cells. Blood 2011; 118(19): 5071-9

П о д г о т о в и л Д.С. Иванов Поступила 23.09.2011

Генная терапия гемофилии В с помощью векторов на основе адено-ассоциированных вирусов

Гемофилия В (болезнь Кристмаса) является коа-гулопатией, обусловленной наследственным дефицитом фактора IX. У пациентов с тяжелой гемофилией В активность фактора IX в плазме крови не превышает 1% от нормальных значений. Основными клиническими проявлениями заболевания являются обильные кровотечения различных локализаций, особенно в суставах и мышцах. Повторные гемартрозы сопровождаются воспалительными изменениями, которые приводят к формированию контрактур и анкилозов (гемофилическая артропатия), являющихся частыми осложнениями заболевания.

В настоящий момент основным направлением в лечении гемофилии В является профилактика кровотечений, которая заключается в дорогостоящей пожизненной заместительной терапии концентратом факторов коагуляции плазмы крови или рекомбинантным фактором IX. В США и других развитых странах стоимость факторов свертывания крови для лечения одного пациента с гемофилией В составляет до 450 тыс. долларов ежегодно, а пожизненная стоимость лечения достигает 20 и более миллионов долларов [1]. В развивающихся странах пациенты, как правило, не получают должное лечение в полном объеме, вследствие чего имеют высокий риск смерти из-за кровотечений и низкий уровень качества жизни из-за формирующихся контрактур и анкилозов.

Одним из наиболее перспективных методов лечения гемофилии В является генная терапия, при которой однократным введением вектора можно добиться постоянной эндогенной продукции фактора IX. Повышение активности фактора IX до уровней, превышающих 1% от нормальных значений, приводит к значительному снижению вероятности кровотечений.

В настоящее время в экспериментах на животных была показана успешная длительная коррекция гемофилии В с использованием адено-ассоциированных

вирусных векторов (ААВ-векторы) [2—4]. Тем не менее, в первом клиническом исследовании 1—2 фазы, в котором применялся вектор на основе 2 серотипа АAВ (AAB2), наблюдалась только кратковременная экспрессия фактора IX, что было обусловлено формированием капсид-специфического цитотоксическо-го Т-клеточного ответа в отношении трансдуцирован-ных гепатоцитов [5—6].

Большая международная группа ученых и клиницистов провела новое клиническое исследование генной терапии гемофилии B с помощью ААВ-векторов на базе лондонского Royal Free Hospital, результаты которого опубликованы в The New England Journal of Medicine. В данной работе авторы выделили три ключевые особенности, позволяющие надеяться на получение более благоприятных результатов, чем в первом клиническом исследованием [5]. Во-первых, был использован оптимизированный вектор, обеспечивающий более высокие уровни синтеза фактора IX. Во-вторых, ААВ2-вектор псевдотипировался менее иммуно-генным капсидом В серотипа (AAB8). В-третьих, благодаря выраженной тропности AAB8 к гепатоци-там, вектор вводился в периферическую вену, что позволило избежать более инвазивных процедур, неизбежно сопровождающихся высоким риском кровотечений у данной категории пациентов.

Всего в исследовании участвовало В человек от 27 до В4 лет с тяжелым течением гемофилии B (активность фактора IX менее 1% от нормальных значений) и отсутствием антител к AAB8. Пациенты были разделены на три группы в зависимости от вводимой дозы вектора (1, группа, низкая доза —

2ХЮ11 на кг; 2 группа, средняя доза — ВхЮ11 на кг;

3 группа, высокая доза — 2хЮ12 на кг).

У всех пациентов не было зафиксировано каких-либо осложнений во время и в раннем периоде по-

сле внутривенного введения препарата, несмотря на персистенцию вектора в плазме крови вплоть до 15 нед. после генного трансфера. Мониторинг основных биохимических показателей крови (мочевина, электролиты, креатинин, лактатдегидрогеназа, С-реактивный белок), включая маркеры некроза ге-патоцитов и функциональной достаточности печени (аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфе-раза, общий билирубин, щелочная фосфатаза, альбумин, протромбиновое время), в течение В нед. не выявил каких-либо существенных нарушений. Было описано 3 побочных эффекта: у 2 пациентов на 5 и 7 неделях после введения препарата развилась умеренная анемия, а у одного пациента на їВ нед. возникла кратковременная брадикардия.

Время наблюдения за пациентами на момент написания статьи составило от В до їВ мес. Максимальный уровень активности фактора IX зависел от вводимой дозы вектора и составил приблизительно 2% для первой группы, 3—4% для второй группы и 8—12% для третьей группы. Длительность эндогенной экспрессии IX фактора составляла более 11, В и 5 мес. для каждой из групп, соответственно. В зависимости от уровней повышения активности фактора IX введение трансгена у разных пациентов позволило: увеличить временные интервалы между профилактическими введениями концентрата фактора IX; вводить концентрат только для профилактики кровотечений во время запланированных интенсивных физических нагрузок, медицинских вмешательств и т.д.; полностью отказаться от профилактических введений экзогенного фактора IX (у 1 пациента из 3 группы).

У одного из пациентов 3 группы на 49 день после введения препарата наблюдалось значительное повышение уровней аспартат- и аланинаминотранс-фераз (АЛТ и АСТ, максимум до 143 и 212 IU/л соответственно), что, однако, не сопровождалось какими-либо клиническими симптомами с сохранением нормальных уровней общего билирубина и его фракций, протромбинового времени. Однако активность фактора IX снизилась с 5—7% до 3% от нормальных значений. После исключения других причин авторы сделали вывод, что эти патологические изменения были вызваны выраженным Т-клеточным иммунным ответом к компонентам вирусного вектора. Через В нед. глюкокортикоидной терапии показатели активности АЛТ и АСТ пришли в норму, а активность фактора IX стабильно оставалась на уровне З% от нормальных значений. У второго пациента из

3 группы на 62 день после введения трансгена также наблюдалось небольшое увеличение активности

ЛИТЕРАТУРА:

1. Manco-Johnson M.J., Abshire T.C., Shapiro A.D. et al. Prophylaxis versus episodic treatment to prevent joint disease in boys with severe hemophilia. N. Engl. J. Med. 2m7; 357: 535—44.

2. Herzog R.W., Yang E.Y., Couto L.B. et al. Long-term correction of canine hemophilia B by gene transfer of blood coagulation factor IX mediated by adeno-associated viral vector. Nat. Med. 1999; 5: 56—63.

3. Snyder R.O., Miao C., Meuse L. et al. Correction of hemophilia B in canine and murine models using recombinant adeno-associated viral vectors. Nat. Med. 1999; 5: 64—7^.

АЛТ и АСТ по сравнению с начальными величинами. После кратковременной профилактической глюкокортикоидной терапии активность АЛТ и АСТ вернулась к первоначальным значениям.

Динамика гуморального иммунного ответа к антигенам капсида ААВ8 были одинаковы у всех пациентов и соответствовали параметрам, характерным для первичного иммунного ответа. У пациентов 1 группы на протяжении всего периода наблюдения не было выявлено значительного ААВ8-специфического Т-клеточного ответа. У пациентов второй и третьей групп выявлялся выраженный ААВ8-специфический Т-клеточный иммунный ответ (определялся с помощью ELISPOT). Причем у пациентов 3 группы появление специфических Т-клеток по времени совпадало с описанным увеличением активности АСТ и АЛТ.

Таким образом, в данном клиническом исследовании было показано, что однократное введение разработанного авторами ААВ-вектора приводило к длительной экспрессии фактора IX в количествах, достаточных для длительного стабильного увеличения его активности в плазме выше 1% от нормальных значений. Это позволило значительно снизить вероятность возникновения кровотечений и уменьшить потребность пациентов в профилактическом введении экзогенного фактора IX вплоть до полной отмены у одного из испытуемых третьей группы на протяжении периода наблюдения. Введение трансгена не сопровождалось какими-либо острыми или отсроченными токсическими проявлениями. У некоторых пациентов наблюдалось увеличение активности аминотрансфераз, опосредованное цитотоксическим эффектом ААВ8-специфических Т-лимфоцитов. Однако, как было показано, эти патологические изменения легко купировались короткими курсами глюкокортикоидной терапии без потери эндогенной экспрессии трансгена.

Данное исследование, по сути, является первым клиническим наблюдением, в котором с помощью генной терапии была достигнута стабильная длительная экспрессия одного из белков крови в терапевтически значимых количествах. Если в дальнейших исследованиях будет подтверждена эффективность и безопасность метода, данный подход, вероятно, позволит заменить трудоемкую и дорогостоящую заместительную терапию экзогенным фактором IX у пациентов с гемофилией B. Эта же технология может найти применение и для лечения целого ряда других тяжелых наследственных заболеваний, таких как лизосомальные болезни накопления, дефицит альфа-1-антитрипсина и гиперлипидемий.

4. Nathwani A.C., Gray J.T., Ng C.Y. et al. Self-complementary adeno-associated virus vectors containing a novel liver-specific human factor IX expression cassette enable highly efficient transduction of murine and nonhuman primate liver. Blood 2006; 107: 2653-61.

5. Manno C.S., Arruda V.R., Pierce G.F. et al. Successful transduction of liver in hemophilia by AAV-Factor IX and limitations imposed by the host immune response. Nat. Med. 2006; 12: 342-7.

6. Mingozzi F., Maus M.V., Hui D.J. et al. CD8t + ) T-cell responses to adeno-associated virus capsid in humans. Nat. Med. 2007; 13: 419-22.

По материалам:

Nathwani A.C., Tuddenham E.G., Rangarajan S. et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. N. Engl. J. Med. 2011; 365(25): 2357-65

П о д г о т о в и л Г.К. Жуков Поступила 25.12.2011