CC BY
49
model // Vaccine. - 2006. - Vol. 24, N 3739. - P 6264-6271.
50. StraightT.M., OttoliniM. G., PrinceG.A., Eichelberger M. C. Antibody contributes to heterosubtypic protection against influenza A-induced tachypnea in cotton rats // Virol. J. - 2008. - Vol. 5. - P. 44.
51. Sullivan J. S., Selleck P. W., Downton T. et al. Heterosubtypic antiavian H5N1 influenza antibodies in intravenous immunoglobulins from globally separate populations protect against H5N1 infection in cell culture // J. Mol. Genet. Med. - 2009. - Vol. 3, N 2. - P. 217-224.
52. TaylorP.M., AskonasB. A. Influenza nucleoprotein-specific cytotoxic T-cell clones are protective in vivo // Immunology. - 1986. - Vol. 58, N 3. - P. 417-420.
53. Teijaro J. R., Verhoeven D., Page C. A. et al. Memory CD4 T-cells direct protective responses to influenza virus in the lungs through helper-independent mechanisms // J. Virol. - 2010. - Vol. 84, N 18.
- P. 9217-9226.
54. Throsby M., van den BrinkE., Jongeneelen M. et al. Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells // PLoS One. - 2008. - Vol. 3, N 12. - P. e3942.
55. Thueng-in K., Maneewatch S., Srimanote P. et al. Heterosubtypic immunity to influenza mediated by liposome adjuvanted H5N1 recombinant protein vaccines // Vaccine. - 2010. - Vol. 28, N 41. - P. 6765-6777.
56. TompkinsS. M., ZhaoZ. S., Lo C. Y. et al. Matrix protein 2 vaccination and protectionagainst influenza viruses, including subtype H5N1 // Emerg. Infect. Dis. - 2007. - Vol. 13, N 3. - P. 426-435.
57. Topham D. J., Tripp R.A., Doherty P. C. CD8+ T cell clear influenza virus by perforin or Fas-dependent processes // J. Immunol. - 1997.
- Vol. 159, N 11. - P. 5197-5200.
58. Van Maurik A., Sabarth N., Dacho H. S. et al. Seasonal influenza vaccine elicits heterosubtypic immunity against H5N1 that can be
further boosted by H5N1 vaccination // Vaccine. - 2010. - Vol. 28, N 7. - P. 1778-1785.
59. WangB. Z., QuanF S., KangS. M. et al. Incorporation of membrane-anchored flagellin into influenza virus-like particles enhances the breadth of immune responses // J. Virol. - 2008. - Vol. 82, N 23. - P. 11813-11823.
60. WuF., YuanX. Y., Huang W. S., Chen Y. H. Heterosubtypic protection conferred by combined vaccination with M2e peptide and split influenza vaccine // Vaccine. - 2009. - Vol. 27, N 43. - P. 6095-6101.
61. Yap K. L., Ada G. L., McKenzie I. F Transfer of specific tycotoxic T lymphocytes protects mice inoculated with influenza virus // Nature. - 1978. - Vol. 273, N 5659. - P. 238-239.
62. Yetter R. A., Barber W. H., Small P. A. Jr. Heterotypic immunity to influenza in ferrets // Infect. Immun. - 1980. - Vol. 29, N 2. - P. 650-653.
63. Yetter R. A., Lehrer S., Ramphal R., Small P. A. Jr. Outcome of influenza infection: effect of site of initial infection and heterotypic immunity // Infect. Immun. - 1980. - Vol. 29, N 2. - P. 654-662.
64. YoshidaR., IgarashiM., OzakiH. et al. Cross-protective potential of a novel monoclonal antibody directed against antigenic site B of the hemagglutinin of influenza A viruses // PLoS Pathog. - 2009. - Vol. 5, N 2. - P. e1000350.
65. Zhao G., Sun S., DuL. et al. An H5N1 M2e-based multiple antigenic peptide vaccine confers heterosubtypic protection from lethal infection with pandemic 2009 H1N1 virus // Virol. J. - 2010. - Vol. 7, N 151. - P. 6305-6313.
66. Zweerink H. J., Courtneidge S. A., Skehel J. J. et al. Cytotoxic T cells kill influenza virus infected cells but do not distinguish between serologically distinct type A viruses // Nature. - 1977. - Vol. 267, N 5609. - P. 354-356.
Поступила 10.06.11
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012
УДК 616.98:578.828.6]-092:612.017.1.064]-036.1
В. Ф. Еремин, Е. Л. Гасич, С. В. Сосинович
Новая уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1, выявленная
в Беларуси
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии Минздрава Беларуси, Минск
Представлены данные о молекулярно-генетической характеристике новой рекомбинантной формы ВИЧ-1. Как показали проведенные исследования, вирус по гену gag был отнесен к субтипу В, а по генам pol и env - к субтипу А ВИЧ-1. При этом по гену gag новый изолят более близок к грузинскому изоляту ВИЧ-1 DQ207943, по гену pol - к изоляту AF413987.1 из Украины, а по гену env - к AY500393 из России. Таким образом, описанная новая рекомбинантная форма вИч-1 имеет следующую структуру: BgagApolAenv. Последовательности новой уникальной рекомбинантной формы ВИЧ-1 по генам gag, pol и env зарегистрированы в международной базе данных EMBL/Genbank/DDBJ под номерами FR775442.1, FN995656.1, FR775443.1.
Ключевые слова: ВИЧ, субтипы, рекомбинантные формы, секвенирование
A new unique HIV-1 recombinant form detected in Belarus
V. F. Eremin, E. L. Gasich, S. V. Sosinovich
Republican Research-and-Practical Center for Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of Belarus, Minsk
The paper presents data on the molecular genetic characteristics of a new HIV-1 recombinant form. The study has shown that the virus is referred to as HIV-1 subtype B in terms of the gag gene and HIV-1 subtype A in terms of the pol and env genes. At the same time the new isolate is closer, in terms of the gag gene, to the HIV-1 DQ207943 strain isolated in Georgia, in terms of the pol gene, to the HIV-1 AF413987.1 strain isolated in Ukraine and, in terms of the env gene to the HIV-1 AY500393 strain isolated in Russia. Thus, the described new HIV-1 recombinant form has the following structure: BgagApolAenv.
The gag, pol, and env gene sequences from the new unique HIV-1 recombinant form have been registered in the international database EMBL/Genbank/DDBJ under accession numbers FR775442.1, FN995656.1, and FR775443.1.
Key words: HIV, subtypes, recombinant forms, sequencing
9
В настоящее время в мире, по расчетным данным ЮНЭЙДС, проживают более 30 млн больных с ВИЧ/ СПИДом, а ежегодные потери от данного заболевания составляют около 3 млн человек [1]. В Республике Беларусь на 1.05.11 официально зарегистрировано 12 133 случая ВИЧ-инфекции (128 на 100 тыс. населения). В течение последних лет в стране наблюдается стабильно высокий прирост случаев ВИЧ/СПИДа - более 1000 новых случаев ежегодно [www.aids.by].
Филогенетический анализ штаммов ВИЧ-1, изолированных в разных географических регионах, показал, что все эти вирусы могут быть разделены на группы, субтипы и циркулирующие рекомбинантные формы (CRFs) [17, 19]. Выделяют 3 группы, или линии, ВИЧ-1: M (Major), N (non-M, non-O или New) и O (Outliers). Большинство изолятов ВИЧ-1, ответственных за пандемию ВИЧ-инфекции, относятся к группе М. Вирусы группы О эндемичны и выявляются в основном в Камеруне и соседних странах Западной и Центральной Африки [13, 15]. Группа N объединяет вирусы, изолированные в Камеруне [3, 20].
Внутри группы M все вирусы филогенетически делят на субтипы. В настоящее время выделяют 9 субтипов, обозначенных латинскими буквами: A-D, F-H, J и K. Вирусы группы O не делятся на субтипы, поскольку при филогенетическом анализе не выявляется такое же разнообразие геномов ВИЧ, как в группе M. Как оказалось, все субтипы ВИЧ-1 ассоциированы с различными территориями и континентами. Субтип В типичен для Северной и Южной Америки, Западной Европы, Африки, ЮгоВосточной Азии, Австралии, Японии; A, C и D -для Африки (С описан также в Индии, Бразилии, России); E (CRF01_AE) - для Таиланда; F описан в Румынии и Бразилии; G - в Центральной Африке, на Тайване, в Заире и Элисте (Россия); H - в Центральной Африке, Заире и Восточной Европе; I - на Кипре, Ближнем Востоке; J - в Центральной Африке [6, 7, 9, 10].
При инфицировании человека несколькими субтипами ВИЧ-1 в процессе репликации в организме такого инфицированного в геноме вируса могут происходить рекомбинантные события, приводящие к появлению рекомбинантных форм вируса, имеющих мозаичную структуру генома. Такие вирусы в настоящее время выделены в отдельную группу и называются «циркулирующие рекомбинантные формы» (circulating recombinant forms - CRFs) [10]. В настоящее время описаны 14 рекомбинантных форм ВИЧ-1, которые встречаются на разных континентах и в разных странах. Например, CRF01_AE была впервые описана в Таиланде и Центральной Африке, CRF02_AG - в Африке, но встречается в Западной Европе, России, а также описана нами в Беларуси [2, 5]. CRF03_AB впервые была выявлена у инъекционных наркопотребителей в Калининграде в конце 90-х годов прошлого века, а позднее была описана в Беларуси [4, 8, 12].
В настоящей статье представлены данные по выявлению и характеристике новой рекомбинантной формы ВИЧ-1, выявленной и описанной впервые в мире.
Материалы и методы
Плазма крови в объеме 3-5 мл была собрана из цельной крови с ЭДТА после низкоскоростного центрифугирования при 1000 об/мин в течение 20 мин.
Вирус был выделен из 500 мкл плазмы высокоскоростным центрифугированием при 23 000 g и +4°С в течение 60 мин на центрифуге Avanti J 30 I, “Beckman Coulter”, США.
РНК ВИЧ-1 изолировали с использованием модуля для выделения РНК тест-системы ViroSeq “HIV-1 Genotyping System v.2.0”, Celera Diagnostics, “Abbot”, США.
Полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) проводили с использованием модуля коммерческой тест-системы ViroSeq “HIV-1 Genotyping System v.2.0” Celera Diagnostics, “Abbot”, США.
Фрагменты вирусной ДНК после ПЦР очищали на колонках, прилагающихся к тест-системе Viro-Seq “HIV-1 Genotyping System v.2.0” Celera Diagnostics, “Abbot”, США, и производства фирмы “Sigma”, США.
Секвенирующую ПЦР проводили с использованием модуля коммерческой тест-системы ViroSeq “HIV-1 Genotyping System v.2.0” Celera Diagnostics, “Abbot”, США.
Очистку фрагментов ДНК ВИЧ после секвениру-ющей ПЦР выполняли этанол-ацетатной преципитацией.
Электрофорез фрагментов гена pol ВИЧ-1 размером 1800 н. о. (протеаза и 2/3 обратной транскриптазы) после секвенирующей ПЦР проводили на генетическом анализаторе ABI Prism 3100-Avant “Applied Biosystems”, США. Для анализа последовательностей фрагмента гена pol и определения мутаций резистентности использовали базу данных, прилагаемую к тест-системе ViroSeq “HIV-1 Genotyping System” software v.2.6, Celera Diagnostics, “Abbot”, США, а также программы “Sequencing Analysis” v.5.1.1, BioEdit, SeqScape, “HIV Drug Resistance Database” Stanford University.
Синтез праймеров генов gag и env. Пары праймеров синтезировали на автоматическом синтезаторе “Expedite™ 8900 Nucleic Acid Synthesis System”, “PerSeptive Biosystems”, США. Были синтезированы 3 праймера гена gag, 4 гена env, а в качестве внутреннего контроля качества - пара праймеров у-актина.
gag: A0493-1 (5'gag-1); A0492 (gag-21-Sp6); A0491 (gagAE3 T7);
env: A0909-1 (3'V3Not); A0908-1 (5'V3Not); A0910 (Sp6 5'Ksi); A0911 (T75'Ksi);
y-Actin: A0652 (3'HcyActin); A0651 (5'HcyActin).
ОТ-ПЦР для последующего секвенирования. Обратную транскрипцию проводили в амплификаторе Gene Amp PCR System 2700 (“Applied Biosystems”) с использованием праймеров генов gag (3'A0309 - SK39), env (0909 - 3' V3 Not), а также гексамеров в объеме 20 мкл (14 мкл РНК; 8 мкл 5 х ОТ-буфера; 3,2 мкл дНТП; 3,6 мкл РНАазин; 2 мкл MuLV - RT). Реакционную смесь инкубировали при 42°С 45 мин, 95°С 5 мин и охлаждали при 4°С.
Первый раунд ПЦР выполняли в конечном объе-
Контактная информация:
Еремин Владимир Федорович, д-р мед. наук, зав. отд.; e-mail:[email protected]
10
а
б
0,01
в
0,05
ме 50 мкл по следующей прописи: 4 мкл 10* ПЦР-буфера; 0,5 мкл MgCl2, 0,4 мкл Taq-полимеразы; 0,5 мкл 5' праймера (для гена gag - A0493 (5' gag-1); для env-гена - A0908-1 (5'V3 Not)); к реакционной смеси добавляли 10 мкл кДНК. Реакцию проводили по сле-
Рис. 1. Филогенетический анализ последовательностей ДНК изолята Mos по гену pol (а); филогенетический анализ последовательностей ДНК изолята Mos по участку p17/p24 гена gag (б); филогенетический анализ последовательностей ДНК изолята Mos по V3 петле gp120 ВИЧ-1 (в).
Референс-последовательности ВИЧ-1 и вирусы, специфичные для эпидемии ВИЧ/СПИДа на территории Беларуси, были взяты из международной базы данных GenBank со своими номерами. Древа были построены по методу Neighbor-Joining и двум параметровым дистанциям по методу Kimura.
дующей прописи: 95°С - 5 мин; (95°С - 1 мин, 55°С - 1 мин, 72°С - 2 мин) - 40 циклов; 72°С - 10 мин и хранили при 4°С.
Второй раунд - гнездовую ПЦР выполняли в конечном объеме 50 мкл по следующей прописи: 5 мкл 10*
11
ПЦР-буфера; 1,2 мкл MgCl2 (100 мМ); 0,4 мкл дНТП; 0,2 мкл Taq-полимеразы; по 0,5 мкл 5' праймеров (100 нг/мкл) - gag A0328 - gag21-Sp6, env A0627 - (5'Ksi) и 3' праймеров (100 нг/мкл) - A0373 (gagAE3), A0624 (3'Ksi). Продукт первой ПЦР добавляли к реакционной смеси в количестве 5 мкл. Реакцию проводили в следующем режиме: 95°С - 5 мин; (95°С - 1 мин, 55°С - 1 мин, 72°С - 2 мин) - 25 циклов; 72°С - 10 мин; хранение при 4°С.
Электрофорез в агарозном геле. Анализ продуктов амплификации проводили в 1% агарозном геле на трис-боратном буфере, содержащем бромид этидия 1,5 мкл (10 мг/мл) на 150 мл буфера.
Секвенирование. Секвенирование ВИЧ по генам gag (850 п. н.) и env (380 п. н.) проводили на генетическом анализаторе модели ABI Prism 3100-Avant, “Applied Biosystems”.
Анализ результатов секвенирования выполняли с помощью программ ClustalX (1.8) и BioEdit. Нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов были выровнены, в них были найдены рамки считывания и получены соответствующие аминокислотные последовательности. Для филогенетического анализа полученные нуклеотидные последовательности были выровнены с нуклеотидными последовательностями референсных изоля-тов ВИЧ-1 из базы данных полных нуклеотидных последовательностей геномов различных штаммов ВИЧ-1 с помощью программы Clustal W. Для филогенетического анализа полученных результатов использовали программу MEGA 4.1 по методу Neighbour-Joining и Kimura 2-параметру. Рекомбинантную природу вируса оценивали с использованием программ Comet HIV-1 и SimPlot (Similarity Plotting).
Последовательности нового варианта ВИЧ-1/Mos по генам gag, pol и env были зарегистрированы в Международной базе данных EMBL/Genbank/DDBJ под номерами FR775442.1; FN995656.1, FR775443.1.
Результаты и обсуждение
Эпидемия ВИЧ/СПИДа в бывшем СССР началась со вспышек в Одесской (субтип А) и Николаевской
а
BootScan-Query: Mos-pol В ABA
---А1 ------В ------СОП-А1
(субтип В) областях Украины. В обоих случаях вспышки были связаны с заражением через инфицированный наркотик инъекционных наркопотребителей [8]. Рекомбинация ВИЧ-1 субтипов А и В привела к образованию новой рекомбинантной формы вируса CRF03_AB (gagA/envB), которая вызывала вспышку ВИЧ-инфекции среди инъекционных наркоманов в Калининграде, а позднее была выявлена в других регионах Российской Федерации и Беларуси [5-7, 9].
В апреле 2010 г. для исследования на резистентность в нашу лабораторию поступил образец плазмы крови от ВИЧ-инфицированного ребенка Mos, 6 лет, рожденного ВИЧ-инфицированной матерью. У больной не были выявлены резистентные штаммы ВИЧ-1. При проведении филогенетического анализа фрагмента ДНК по гену pol ВИЧ-1, изолированного от пациентки Mos, нами было обнаружено, что вирус относился к субтипу А ВИЧ-1, но кластрировался отдельно от других образцов субтипа А и референс-последовательностей субтипа A (AF004885) (рис. 1, а). Исследования последовательностей гена pol изолята Mos с использованием программы Comet HIV-1 показали, что вирус относится к рекомбинантной форме ВИЧ-1 А1В. Средние р-дистанции между последовательностями ВИЧ-1 субтипа А из Украины, России, консенсусной последовательностью IDU-A и последовательностями ДНК пациентки составили 0,068, а с референс-последовательностями субтипа В - 0,094. Последовательности ДНК изолята Mos были более близки к референс-последовательностям ВИЧ-1 AF413987.1 из Украины (субтип А), р-дистанции составили 0,066. Эти данные подтвердили, что изо-лят Mos по гену pol относится к субтипу А ВИЧ-1. Сравнительный анализ последовательностей изоля-та Mos с референс-последовательностями рекомбинантной формы CRF03_AB (AF414006.1 Belarus и AF193276.1 CRF03_AB KAL153) показал, что средние р-дистанции между вирусами составили 0,090. В то же время р-дистанции между референс-после-довательностями рекомбинантной формы CRF03_AB, описанными в Калининградской области и Белару-
б
BootScan-Query: Mos-gag
Position
---А1 ...... В-Georgia -----B-Belarus
Window: 200 bp, Step: 20 bp, GapStnp: On, Reps: 100, Kimura (2-parameter), T/t: 2,0, Neighbor-Joining
Рис. 2. BootScan-анализ последовательностей генов pol (а) и gag (б) изолята Mos.
12
си AF193276.1 и AF414006.1, соответственно составили всего 0,009. Таким образом, по гену pol новый изолят был отнесен к субтипу А ВИЧ-1.
Анализ последовательностей по гену gag p17/p24 изолята Mos в референс-последовательностями ВИЧ-1 субтипа А показал, что средние р-дистанции составили 0,129, а с референс-последовательностями субтипа В - 0,075. Для установления возможной связи изолята Mos с рекомбинантной формой CRF03_ AB (AF414006.1, Belarus и AF193276.1 CRF03_AB KAL153) мы определяли средние р-дистанции между указанными вирусами, которые составили 0,121, в то время как между изолятами - рекомбинантными формами из Калининграда и Беларуси р-дистанции составили всего 0,013. Таким образом, по участку р17/ p24 гена gag новый изолят Mos был отнесен нами к субтипу В ВИЧ-1. Результаты филогенетического анализа последовательностей ДНК по гену gag представлены на рис. 1, б.
Анализ последовательностей изолята Mos по участку V3 петли gp120 гена env показал, что средние р-дистанции с референс-последовательностями изо-лятов субтипа В составили 0,323, а с субтипом А -0,155. Средние р-дистанции изолята Mos с референс-изолятами AF414006.1 и AF193276.1 (CRF-03_AB) составили 0,308. Проведенные исследования позволили нам отнести изолят Mos по участку V3 петли gp120 гена env ВИЧ-1 к субтипу А. Филогенетический анализ последовательностей ДНК по гену env представлен на рис. 1, в.
Для подтверждения рекомбинантной природы нового изолята ВИЧ-1 мы использовали программу Sim-Plot (см. рис. 2, а и б). Как видно на рис. 2, а, первые 450 п. н. соответствуют последовательностям ВИЧ-1 субтипа В (референс DQ207943), последующие 500 пар оснований соответствуют субтипу А (консенсусные последовательности субтипа A-IDU), далее 250 пар оснований снова соответствуют субтипу В и, наконец, последние 200 пар оснований опять повторяют последовательности субтипа А. На рис. 2, б первые 100 п. н. соответствуют субтипу А1 (референс AY500393), а последующие 550 п. н. - субтипу В (ре-ференс DQ207943).
Таким образом, проведенные исследования позволили нам сделать заключение о рекомбинантной природе выделенного нами нового изолята Mos, который отличается от описанной ранее рекомбинантной формы ВИЧ-1 CRF03_AB (AgagBpolBenv). Новая рекомбинантная форма имеет строение по основным структурным генам BgagApolAenv. Последовательности новой уникальной рекомбинантной формы ВИЧ-1 по генам gag, pol и env зарегистрированы в международной базе данных EMBL/Gen-bank/DDBJ под номерами FR775442.1, FN995656.1, FR775443.1.
ЛИТЕРАТУРА
1. Доклад о глобальной эпидемии ВИЧ/СПИДа. - 2010. - С. 1-236.
2. Еремин В. Ф., Гасич Е. Л., Сосинович С. В. и др. Мутации резистентности ВИЧ у детей, получавших высокоактивную антиретровирусную терапию // Здравоохранение. - 2010. - Т. 10. - С. 56-62.
3. Ayouba A., Souquieres S., Njinku B. et al. HIV-1 group N among HIV-1-seropositive individuals in Cameroon // AIDS. - 2000. - Vol. 14. - P. 2623-2625.
4. Bobkov A., Kazennova E., Selimova L. et al. A sudden epidemic of HIV type 1 among injecting drug users in the former Soviet Union: identification of subtype A, subtype B, and novel gagA/envB recombinants // AIDS Res. Hum. Retrovirus. - 1998. - Vol. 14. - P. 669-676.
5. Cornelissen M., Van Den Burg R., ZorgdragerF., Goudsmit J. Spread of distinct human immunodeficiency virus type 1 AG recombinant lineages in Africa // J. Gen. Virol. - 2000. - Vol. 81. - P. 515-523.
6. Gao F., Vidal N., Li Y. et al. Evidence for two distinct sub-subtypes within the HIV-1 subtype A radiation // AIDS Res. Hum. Retrovirus.
- 2001. - Vol. 17. - P. 675-688.
7. Kostrikis L., Bagdades E., Cao Y. et al. Genetic analysis of human immunodeficiency virus type 1 strains from patients in Cyprus: identification of a new subtype designated subtype I // J. Virol. - 1995.
- Vol. 69. - P. 6122-6130.
8. Litsola K., Tashkinova I., Laukkanen T. et al. HIV-1 genetic subtype A/B recombinant strain causing an explosive epidemic in infective drug users in Kaliningrad // AIDS. - 1998. - Vol. 12. - P. 1907-1919.
9. Louwagie J., McCutchanF E., PeetersM. et al. Phylogenetic analysis of gag genes from 70 international HIV-1 isolates provides vid-ence for multiple genotypes // AIDS. - 1993. - Vol. 7. - P. 769-780.
10. Louwagie J., Janssens W., Mascola J. et al. Genetic diversity of the envelope glycoprotein from human immunodeficiency virus type 1 isolates of African origin // J. Virol. - 1995. - Vol. 69. - P. 263-271.
11. Lukashov V V., Huismans R., Rakhmanova A. G. et al. Circulation of subtype A and gagA/envB recombinant HIV type 1 strains among injecting drug users in St. Petersburg, Russia, correlates with geographical origin of infections // AIDS Res. Hum. Retrovirus. -1999. - Vol. 15. - P. 1577-1583.
12. Masharsky A. E., Eremin V. F., Kozlov A. P. Cloning and analysis of full-length genomes of HIV-1 strains of subtype A and CRF03-AB prevalent among intravenous drug users in countries of the former Soviet Union // XIV International AIDS Conference. - Barcelona, 2002. - P. 365.
13. Mauclere P., Loussert-Ajaka I., Damond F. et al. Serological and virological characterization of HIV-1 group O infection in Cameroon // AIDS. - 1997. - Vol. 11. - P. 445-453.
14. NabatovA. A., Kravchenko O. N., Lyulchuk M. G. et al. Simultaneous introduction of HIV type 1 subtype A and B viruses into injecting drug users in southern Ukraine at the beginning of the epidemic of the former Soviet Union // AIDS Res. Hum. Retrovirus. - 2002. -Vol. 18. - P. 891-895.
15. Peeters M., Gueye A., Mboup S. et al. Geographic distribution of HIV-1 group O viruses in Africa // AIDS. - 1997. - Vol. 11. - P. 493-498.
16. Peters M. Theoretical biology and biophysics group. - Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, 2000. - P. 1-15.
17. Robertson D. L., Hahn B. H. Sharp P. M. Recombination in AIDS viruses // J. Mol. Evol. - 1995. - Vol. 40. - P. 249-259.
18. Robertson D. L., Anderson J. P., Bradac J. A. et al. // Theoretical biology and biophysics group. - Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, 1999. - P. 492-505.
19. Robertson D. L., Anderson J. P., Bradac J. A. et al. HIV-1 nomenclature proposal // Science. - 2000. - Vol. 288. - P. 55-56.
20. SimonF., MauclereP., RoquesP. et al. Identification of a new human immunodeficiency virus type 1 distinct from group M and group O // Nat. Med. - 1998. - Vol. 4. - P. 1032-1037.
Поступила 16.06.11
13
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.281.8:578.825.11].076
Н. Д. Львов1, А. С. Бавыкин2, А. В. Мельниченко2, А. В. Карпухин2
Блокирование функций гена RS1 вируса простого герпеса 2-го типа малыми интерферирующими РНк - новые перспективы для направленного противовирусного воздействия
'ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России, Москва; ^Учреждение Российской академии медицинских
наук Медико-генетический научный центр РАМН, Москва
Выявлена новая мишень для таргетной терапии вируса простого герпеса 2-го типа (ВПГ2). Мишень представляет собой мРнК гена RS1, активация которого является ключевым этапом в регуляции экспрессии ранних генов ВПг-2. Обнаружено, что направленное выключение функции этого гена при помощи малых интерферирующих РнК (siRNA/миРНК) приводит к полному подавлению инфекции ВПг-2. Созданные интерферирующие РНК способны взаимодействовать с обоими типами - ВПГ-1 и ВПГ-2. Получены результаты, свидетельствующие о защитных свойствах миРНК в отношении цитопатического действия ВПГ-2 и отсутствии токсичности для инфицированных клеток Vero.
Ключевые слова: вирус простого герпеса 2-го типа, РНК-интерференция, малые интерферирующие РНК (миРНК/small interfering RNA), блокирование репродукции ВПГ-2
The blocking effects of small interfering RNAs on RS-1 gene functions of herpes simplex virus type 2: new perspectives for targeted antiviral exposure
N. D. Lvov1, A. S. Bavykin2, A. V. Melnichenko1, A. V. Karpukhin2
1D. I. Ivanovsky Research Institute of Virology, Ministry of Health and Social Development of Russia, Moscow; 2Medical Genetics Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
A new target has been revealed for therapy for herpes simplex type 2. The target is RS1 mRNA whose activation is a key stage in regulating the expression of the early genes of herpes simplex virus type 2 (HSV-2). The targeted knockdown of the function of this gene by small interfering RNAs (siRNAs) has been found to result in the complete suppression of HSV-2 infection. The designed interfering RNAs are able to interact with both HSV-1 and HSV-2. The findings suggest that siRNAs have protective properties against the cytopathic effect of HSV-2 and cause no toxicity to infected Vero cells.
Key words: influenza virus, reassortant, hemagglutinin, neuraminidase, pandemic
Вирусы простого герпеса человека ВПГ-1 и ВПГ-2 убиквитарны с преобладанием бессимптомных форм носительства. Будучи иммунодефицитными патогенами вирусы герпеса обусловливают прогрессирующее снижение иммунного тонуса организма, что предрасполагает к системной диссеминации и поражению тканей и органов макроорганизма. Пан-тропные возможности герпесвирусов, их способность легко преодолевать гематоэнцефалический барьер предопределяют развитие системных заболеваний ЦНС, суставов, системы кровообращения, респираторного тракта, желудочно-кишечной и мочеполовой систем. Поражаются зрительный, слуховоспринимающий аппарат, нейрогуморальная, гормональная и цитокиновая сферы организма [1, 2].
В России обязательная регистрация герпеса половых органов (ГПО) введена лишь в 1993 г. Заболеваемость в стране превышает 16,3, а в Москве - 74,8 на 100 тыс. населения; количество больных с клиническими проявлениями ГПО составляет приблизительно 0,5-1%, а в США и Европе - до 6-10% взрослого населения, причем в США ежегодно регистрируют до 6-10 млн случаев генитального герпеса.
Вышесказанное определяет как острую социальную значимость проблемы, так и необходимость продолжения поиска средств для более эффективного блоки-
рования герпетической инфекции (ГИ) человека.
При блистательных возможностях современной противовирусной химиотерапии (системное воздействие, селективное блокирование вирусспецифических процессов, способность преодолевать гематоэнцефалический барьер, относительно слабый токсический эффект) есть и серьезные минусы: постепенное и неуклонное формирование лекарственной устойчивости, подчас носящее перекрестный характер, некоторые побочные эффекты при долговременной терапии вносят ряд ограничений в прогнозирование результата.
Настоящее исследование посвящено изучению блокирующих герпесвирусную репродукцию возможностей малых интерферирующих РНК (миРНК/small interfering RNA) в качестве основы для нового тар-гетного противовирусного соединения. Уникальность данного метода - возможность подбора и синтеза миРНК, способных на основе достаточно высокой гомологии [7] геномов ВПГ-1 и ВПГ-2 комплементарно взаимодействовать с мРНК обоих вирусов.
Целью работы было исследование эффективности использования РНК-интерференции для подавления ГИ на модели ВПГ-2 in vitro. В плане перспективности применения миРНК в качестве нового противовирусного средства решались такие задачи, как подавление вирусной репликации в ранних стадиях инфекции
Контактная информация:
Мельниченко Анна Валерьевна, канд. мед. наук, вед. науч. сотр.; e-mail:[email protected]
14
