CC BY
24
4. Pina S. Injectability of brushite-forming Mg-substituted and Sr-substituted a-TCP bone cements / Pina S., Torres P. M. C., Ferreira J. M. F. // J. Mater. Sci.: Mater. Med. 2010. - V. 21. - P. 431 - 438.
5. Klammert U. Phase composition, mechanical performance and in vitro biocompatibility of hydraulic setting calcium magnesium phosphate cement / Klammert U., Reuther T., Blank M. and others // Acta Biomaterialia. - 2010. - V. 6. -P. 1529 - 1535.
DOI: https://doi.org/10.23670/IRJ.2017.58.084 Насирзадех М.1, Ваулина Д.Д.2 , Гомзина Н.А.3
1ORCID: 0000-0003-3486-2787, аспирант, Санкт-Петербургский государственный университет, Институт химии,
2ORCID: 0000-0003-1088-2396, младший научный сотрудник,
3ORCID: 0000-0002-4554-6125, кандидат химических наук, старший научный сотрудник, 2'3Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт мозга человека им. Н.П. Бехтеревой
Российской академии наук (ИМЧ РАН) НОВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ [18^]ФЛЮМАЗЕНИЛА, РАДИОФАРМПРЕПАРАТА ДЛЯ РЕЦЕПТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ МОЗГА МЕТОДОМ ПЭТ
Аннотация
Впервые показана принципиальная возможность использования метода твердофазной экстракции (ТФЭ) для получения [18Е]флюмазенила ([18Е]ФМЗ), радиолиганда для визуализации ГАМКа рецепторов методом позитронной эмиссионной томографии (ПЭТ). Проведено сравнение эффективности использования для выделения [18¥]ФМЗ экспресс-метода ТФЭ на одноразовых картриджах и традиционной полупрепаративной ВЭЖХ. Разработана новая радиохимическая автоматизированная технология, которая позволяет получить в одном синтезе (53 мин) 2-5 клинических дозы [18¥]ФМЗ с удельной активностью > 185 ГБк/мкмоль, с радиохимической чистотой >98 % и химическими примесями (нитромазенил)<4 мкг/мл. Полученный препарат отвечает всем требованиям, предъявляемым Фармакопеей, и может быть рекомендован для использования в клинических ПЭТ исследованиях.
Ключевые слова: позитронная эмиссионная томография, радиофармпрепараты, радиолиганды, ГАМКа рецепторы, фтор-18, автоматизированный модуль синтеза, [:^]флюмазенил ([^]ФМЗ), твердофазная экстракция.
Nasirzadeh М.1, Vaulina D.D.2 , Gomzina NA.3
1ORCID: 0000-0003-3486-2787, PhD student, Saint-Petersburg State University, Institute of Chemistry,
2ORCID: 0000-0003-1088-2396, junior researcher, 3ORCID: 0000-0002-4554-6125, PhD, senior researcher, 2,3N. P. Bechtereva Institute of Human Brain, Russian Academy of Sciences (IHB RAS) A NOVEL TECHNOLOGY FOR PRODUCING OF [18F]FLUMAZENIL, RADIOPHARMACEUTICAL
FOR BRAIN RECEPTORS STUDIES BY PET
Abstract
For the first time an express method of solid phase extraction (SPE) was proposed for producing of [18F]flumazenil ([18F]FMZ), a radioligand for visualization GABAa receptors by positron emission tomography (PET). Efficiencies of [18F]FMZ extraction by SPE on commercially available cartridges and by traditional semi-preparative HPLC were compared. Application of novel radiochemical automated technology allowed to obtain 2-5 clinical doses of radioligand in one production run (53 minutes). [18F]FMZ was produced with specific activity >185 GBq/^M, radiochemical purity >98 % and <
4 ng/ml of nitromazenil residual amounts. The obtained preparation meets all Pharmacopoeia requirements and can be recommended for PET clinical applications.
Keywords: positron emission tomography, radiopharmaceuticals, radioligands, GABA receptors, fluorine-18, automated synthesis module, [18F]flumazenil ([18F]FMZ), solid-phase extraction.
Позитронная эмиссионная томография (ПЭТ) - метод ядерной медицины, позволяющий при использовании с оответствующих радиофармпрепаратов (РФП) и фармакокинетических моделей их поведения в организме, количественно измерить параметры многих физиологических и биохимических процессов in vivo (перфузия, метаболизм, рецепторные и нейротрансмиттерные взаимодействия), обеспечивая тем самым точную диагностику онкологических, кардиологических, неврологических и психических заболеваний на ранних этапах. В качестве РФП используют биологически активные соединения, меченные короткоживущими радионуклидами с позитронным типом распада: 18F (Т ^ =109.7 мин),1^ (Т ^ =20.4 мин) и др. При изучении нейрохимических процессов в центральной нервной системе (ЦНС) методом ПЭТ используют меченые соединения, специфично связывающиеся с отдельными типами рецепторов ЦНС (рецепторные радиолиганды). С помощью этих соединений получают ценную информацию о механизмах рецепторных взаимодействий и о плотности и распределении самих рецепторов в различных отделах мозга [1-4]. Большой интерес вызывают ПЭТ исследования ГАМК-эргической системы, реализующей биохимическое действие ГАМК (гамма-аминомасляной кислоты), основного тормозного нейромедиатора ЦНС [2,4]. Бензодиазепиновыми рецепторами (БЗР) называют участки (сайты) ГАМКа-рецепторов для связывания c бензодиазепинами. БЗР локализованы на мембранах нервных клеток и входят в состав ГАМКА-бензодиазепин-ионофорного комплекса, действие которого направлено на изменение устойчивости нервных клеток к возбуждающим сигналам. В частности, бензодиазепины, связываясь с БЗР, усиливают процессы торможения в ЦНС. Седативное действие бензодиазепинов нашло широкое применение в виде транквилизаторов, релаксантов, антиконвульсантов и
снотворных препаратов. Центральные БЗР (цБЗР) играют ключевую роль в таких заболеваниях, как: эпилепсия, тревожные состояния, деменции, алкоголизм и др.
В ПЭТ в качестве РФП для определения плотности цБЗР используют меченые аналоги лекарственного средства флюмазенил (8-фтор-имидазо[1,5-a][1,4]бензодиазепин-3-карбоксил этиловый эфир), (схема 1а). Флюмазенил обладает высокой аффинностью к цБЗР (М<5пМ), является их полным антагонистом и применяется для снятия наркоза, вызываемого действием препаратов на основе бензодиазепинов [4]. В ИМЧ РАН в 2005 г был разработан метод получения [18Б]флюмазенила ([18Б]ФМЗ) (2, схема 1б), меченного фтором-18 в нативную позицию молекулы флюмазенила, путем замещения на [18Р]фторид нитрогруппы в молекуле нитромазенила (этил-5,6-дигидро-5-метил-8-нитро-6-оксо-4Н-имидазо[1,5а][1,4]бензодиазепин-3-карбоксилат) (1) в условиях межфазного катализа криптандом К 2.2.2 (4,7,13,16,21,24-гексаоксо-1,10-диазабицикло [8.8.8]гексакозан) [5].
\
[K2.2.2]K*/[1SF]" ДМФА, 150°С, 15 мин
isp
1 2
Рис. 1 - Получение [18F]<E>M3 по методу [5]
Радионуклид фтор-18 получают в циклотроне по ядерной реакции 18O(p,n)18F при облучении протонами мишени, заполненной водой, обогащенной по изотопу кислород-18 ([18O]H2O). Полученный фтор-18 стабилизируется в химической форме 18Р-фторид-иона, который выделяют из мишенного материала сорбцией на анион-обменной смоле с последующим элюированием раствором, содержащим комплекс К 2.2.2 со щелочным металлом ([К 2.2.2]К+), для перевода в апротонный растворитель ДМФА, где и происходит реакция нуклеофильного замещения.
По методу [5] [18^]ФМЗ получают без добавления носителя, т.е. с очень высокой удельной активностью (> 37 ГБк/мкМоль), которая является одним из обязательных параметров радиолиганда для рецепторных исследований мозга. Поскольку при связывании с активными центрами рецептора носитель конкурирует с радиолигандом, это сказывается на качестве ПЭТ томограмм, а насыщение рецепторов может привести к нежелательным фармакологическим и даже нейротоксическим эффектам. Например, для полного насыщения цБЗР достаточно 15 мкг флюмазенила на 1 кг массы тела [6]. В случае «безносительного» [18Р]ФМЗ необходимо контролировать оставшееся количество нитромазенила (1), поскольку и радиолиганд и предшественник имеют близкие физико-химические свойства и сродство к цБЗР.
До настоящего времени для выделения из реакционной смеси и последующей очистки [18Р]ФМЗ для клинических исследований использовали метод полупрепаративной радио-ВЭЖХ. Длительная (30—40 мин) и трудоемкая ВЭЖХ процедура сопряжена с большими потерями радиоактивного продукта, радиохимический выход (РХВ) [18^]ФМЗ, выделенного из реакционной смеси с помощью ВЭЖХ, варьировал от 10 [7] до 0.4—1.1% [8] (с поправкой на распад). Столкнувшись с этой проблемой при разработке новой технологии получения [18Р]ФМЗ, мы предложили использовать для ее решения альтернативный метод твердофазной экстракции (ТФЭ). В основу нового подхода была положена сорбция [18^]ФМЗ и 1 на микроколонке Oasis HLB 6cc («Waters»), заполненной сополимером N-винилпирролидона и дивинилбензола, с последующим разделением радиолиганда и более липофильного 1 путем фракционного элюирования водно -этанольными растворами возрастающей концентрации. Результаты показали, что неоптимизированный РХВ радиолиганда составил 8% (с поправкой на распад) при сокращении времени процедуры (по сравнению с ВЭЖХ) в 1.5 раза. [^]ФМЗ был получен с удельной активностью > 37 ГБк/мкмоль, радиохимической чистотой > 97% и содержанием 1 ~ 1мкг/мл [9]. Эти исследования были выполнены на полуавтоматической экспериментальной системе синтеза (модуле), сконструированном в ИМЧ РАН, с начальной активностью [18Р]фторида < 3.7 ГБк (100 мКи), поэтому активности препарата было недостаточно даже для одного рецепторного исследования мозга (0.2 ГБк). Для того чтобы добиться воспроизводимого выхода продукта, стандартизировать все этапы синтеза и полностью автоматизировать всю процедуру, а также избежать облучения персонала при работе с высокими уровнями активности фтора-18, необходимо было выбранный метод интегрировать
в современные модули для получения РФП для ПЭТ. Одним из них является Tracerlab FX N Pro (GE Healthcare) -модуль для получения РФП путем нуклеофильного радиофторирования.
Для того, чтобы сравнить эффективность методов ВЭЖХ и ТФЭ в технологии получения [^]ФМЗ, мы проводили на Tracerlab FX N Pro синтезы препарата с двумя разными схемами очистки (схема 2), начиная при этом с одинаковой активности [^]фторида (~ 30 ГБк). Значения параметров радиолиганда, полученного с использованием этих схем, представлены в таблице 1, значения, регламентированные Фармакопеей [10], приведены в скобках.
Таблица 1 - Сравнение методов выделения ['^]ФМЗ
Параметры* ТФЭ (n=7) ВЭЖХ (n=3)
Радиохимический выход c поправкой на распад, % 8.6±1 3-3.3
Радиохимическая чистота (>95), % 98.6±1.1 99.5±0.5
Общее время синтеза, мин 53 80
Удельная активность (>30), ГБк/мкМ 185-555 370-740
Примесь нитромазенила, мкг/мл 3.1±0.9 <0.5
система с детекторами по радиоактивности (гамма-счетчик) и УФ (1=254 nm), колонка ACE С-18 HL (250*4.6 мм) (Aberdeen). Элюент: 0.01 MHsPO/MeCN (v/v=3/1), скорость подачи: 1.5 мл/мин.
Как видно из схемы 2, перед введением реакционной смеси в петлю ВЭЖХ-колонки проводили предварительную очистку на картридже с кремнийорганическим сорбентом (С18) для удаления гидрофильных радиоактивных примесей. После ВЭЖХ процедуры для удаления органического растворителя (ацетонитрила) из фракции, содержащей продукт, использовали сорбцию [:^]ФМЗ на втором картридже С18 с
Рис. 2 - Технологическая схема получения [ F^M3 с выделением и очисткой методами а) ВЭЖХ и б) ТФЭ
последующим элюированием этанолом. Видно, что метод ВЭЖХ является трехступенчатой длительной процедурой, с большими потерями активности на ВЭЖХ-колонке; РХВ [18^]ФМЗ составил ~ 3% с поправкой на распад, общее время синтеза - 80 мин (таблица 1). Активность продукта была невысока - около 370 МБк, но вполне достаточна для одной клинической дозы (180 МБк). При этом продукт был получен с высокой удельной активностью, с радиохимической чистотой ~100% и с ничтожно малым содержанием 1. В синтезах с ТФЭ методом выделения целевого продукта РХВ составил 8-10 % (с поправкой на распад), а активности радиолиганда (750-1100 МБк) хватило для получения 2-5 клинических доз. Значения параметров качества радиолиганда при этом отвечали фармакопейным требованиям.
Однако содержание 1 (2-4 мкг/мл) было в несколько раз больше, чем в опытах с использованием ВЭЖХ процедуры (<0.5 мкг/мл). Поскольку фармакопейных норм для остаточного количества 1 в препарате [18Р]ФМЗ нет, то для доказательства допустимой нормы нитромазенила <4мкг/мл мы воспользовались результатами доклинических исследований на безопасность РФП [18Р]ФМЗ для ПЭТ, проведенными вместе с Научно-исследовательским Институтом гриппа МЗ РФ на группах аутбредных крыс (30 самок и 30 самцов). Исследования показали, что однократное введение [18Р]ФМЗ в дозе эквивалентной человеческой и в 30 раз её превышающей, не вызвало изменений в состоянии опытных животных в течение 14 дней. Структура поведенческого паттерна «открытое поле» у животных из всех экспериментальных групп соответствовала таковой у здоровых белых крыс. У всех опытных животных отмечалась положительная динамика массы тела, значения температуры тела не выходили за пределы физиологической нормы. Достоверные различия в величине внутренних органов и головного мозга опытных и контрольных животных не были выявлены. Гистологические исследования также не выявили признаков изменений во внутренних органах крыс самцов и самок, получавших как плацебо, так и препарат.
Метод твердофазной экстракции был положен в основу создания новой технологии получения флюмазенила, меченного 18F, первого в России радиолиганда для рецепторных исследований мозга методом ПЭТ.
Список литературы / References
1. Ametamey S.M. Molecular imaging with PET/ S. M. Ametamey, M. Honer, P.A. Schubiger // Chem.Rev. - 2008. -V. 108. - P.1501-1516.
2. Sigel E. Structure, function and modulation of GABAAreceptors / E. Sigel, M.E. Steinmann // J. Biol. Chem. -2012. - V. 287. - P. 40224-40231.
3. Chakravarty R. Positronemissiontomographyimage-guideddrugdelivery: current statusand future perspectives / R.Chakravarty, H.Hong, W.Cai // Mol. Pharmaceutics. - 2014. - V. 11. - P. 3777-3797.
4. Andersson J.D. PET radioligands targeting the brain GABAA / benzodiazepine receptor complex / J. D. Andersson, C. Halldin//J. Label Compd. Radiopharm. - 2013. - V. 56 - P.196-206.
5. Ryzhikov N. Preparation of high specific radioactivity [18F]flumazenil and its evaluation in cynomolgus monkey by positron emission tomography / N.N. Ryzhikov, N. Seneca, R.N. Krasikova [et al.] // Nucl. Med. Biol. - 2005. - V. 32. -P. 109-116.
6. Delforge J. Quantitation of Benzodiazepine Receptors in Human Brain Using the Partial Saturation Method / J. Delforge, L. Spelle, B. Bendriem [et al.] // J. Nucl. Med. - 1996. - V. 37. - P. 5-11.
7. Odano I. [18F]Flumazenil binding to central benzodiazepine receptor studies by PET - Quantitative analysis and comparisons with [11C]flumazenil / I. Odano, C. Halldin, P. Karlsson [et al.] // Neuroimage. - 2009. - V. 45. - P. 891-902.
8. Moon B. S. Facile aromatic radiofluorination of [18F]flumazenil from diaryliodonium salts with evaluation of their stability and selectivity / B. S. Moon, H. S. Kil, J. H. Park [et al.] // Org. Biomol. Chem. - 2011. - V. 9. - P. 8346-8355.
9. Nasirzadeh M. A novel approach to the synthesis of [18F]flumazenil, a radioligand for PET imaging of central benzodiazepine receptors / M. Nasirzadeh, D. D. Vaulina, O. F. Kuznetsova, N. A. Gomzina // Russ. Chem. Bull. Int. Ed.-2016 - V. 65. - P. 794-800.
10. Radiopharmaceutical preparation, in: European Pharmacopoeia. 8.0, European Directorate for the Quality of the Medicines; Strasbourg, 2014. - P. 759-763.
