CC BY
15
УДК 612.821.6
НИТРАТ НАТРИЯ СНИЖАЕТ РАЗВИТИЕ СТРЕССОРНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ У КРЫС ЛИНИИ КРУШИНСКОГО-МОЛОДКИНОЙ
А.Л. Крушинский, В.С. Кузенков, В.П. Реутов, В.Б. Кошелев, Е.Г. Сорокина
(кафедра высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ; кафедра физиологии человека и животных биологического факультета МГУ; кафедра нормальной и патологической физиологии факультета фундаментальной медицины МГУ; e-mail: [email protected])
Оксид азота (NO) является важным регулятором физиологических функций у человека и животных в норме и патологии (Moneada et al., 1992; Марков, 1996; Реутов и др., 1997; Ванин 2000; Каменский, Савельева, 2002). В настоящее время опубликовано значительное число работ, посвященных различным биологическим эффектам этого соединения (Башкатова, Раевский, 1998; Дьяконова, Реутов, 1998; Раевский и др., 2000; Каменский, Савельева, 2002). Интерес к NO в большой степени обусловлен разнообразием его физиологических функций. Оксид азота участвует в синаптической передаче, выполняет роль активного вазодилтатора и способствует выделению нейромедиаторов (Radom-ski M.W., 1987; Марков, 1996; Гурин, 1997; Дьяконова, Реутов, 1998; Каменский, Савельева, 2002; Ситдикова, Зефиров, 2006). Основным субстратом синтеза этого вещества является L-аргинин. Синтез NO происходит под действием NO-синтазы. Оксид азота и продукты его метаболизма способны участвовать в циклических взаимопревращениях (Реутов и др., 1997, 2003). Поэтому NO может образовываться не только из L-аргинина, но и из ионов NO 2, которые восстанавливаются в NO при участии гемсодержащих белков (Реутов, Сорокина, 1998). Ионы NO22 в свою очередь могут образовываться путем восстановления ионов NO32 под действием нитратредуктаз (Реутов и др., 1997). Особенно интенсивно такой ряд трансформации NO 3 ^ ^ NO2 ^ NO протекает в условиях дефицита кислорода (Millar et al., 1997; Martin et al., 2004; Glad-vin, 2005).
Цель настоящей работы — изучение влияния нитрата натрия (NaNO3) на устойчивость животных к действию стрессирующего фактора, приводящего к сердечно-сосудистым нарушениям и внутричерепным кровоизлияниям. Удобным объектом для этого исследования явились крысы линии Кру-шинского—Молодкиной (КМ), генетически предрасположенные к аудиогенным судорожным припадкам. У этих животных в результате длительного акустического воздействия происходит резкое возбуждение мозга, которое сопровождается судорожными припадками, двигательными и вегетативными нарушениями, внутричерепными кровоизлияниями,
в ряде случаев заканчивающихся смертью (Крушинский, 1960; Ничков, Кривицкая, 1969; Крушинский и др., 1989). Ранее нами было показано, что воздействие относительно низких доз МО-генериру-ющего соединения — нитрита натрия (0,5 мг/100 г), не вызывающего увеличения содержания метгемо-глобина, приводит к повышению устойчивости крыс линии Крушинского—Молодкиной к акустическому стрессу (Реутов и др., 2002). Исходя из этого, мы предположили, что сходный защитный эффект может быть получен при применении нитрата натрия.
Материалы и методы исследований
Эксперименты выполнены на 96 крысах линии КМ (самцы в возрасте 4,5—5 мес, весом 240—310 г). Опытным животным (п = 49) вводили нитрат натрия внутрибрюшинно в дозе 0,5 мг/100 г, 5 мг/100 г, 50 мг/100 г. Контрольным животным (п = 47) вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме. Акустическое воздействие проводили по ранее разработанной схеме (Крушинский, 1960). После полутораминутного действия сильного электрического звонка (110—115 дБ) подавали серию сильных и слабых акустических сигналов длительностью 10 сек с десятисекундными интервалами между ними. Через 15 мин такого воздействия делали трехминутный перерыв, затем снова включали сильный звук на 1 мин. Во время акустического воздействия у опытных и контрольных крыс определяли параметры, характеризующие возбудимость центральной нервной системы: длительность латентного периода, интенсивность и характер судорожного припадка. Также оценивали выраженность нарушений движений и смертность животных во время акустической экспозиции. Выделяли нарушения трех степеней: легкие нарушения (незначительные нарушения мышечного тонуса, не ограничивающие передвижения животного); средние нарушения (парез конечностей, чаще задних, затрудняющий передвижение); тяжелые нарушения (животное практически теряет способность к передвижению). Сразу после окончания экспериментов животных декапитировали, мозг фиксировали в 10%-м растворе формалина. Площадь субдураль-
ных и видимых субарахноидальных кровоизлияний определяли с помощью бинокуляр-мик-рометра. Наличие или отсутствие внутрижелу-дочковых кровоизлияний определяли на поперечных срезах мозга толщиной 1—2 мм.
Достоверность различий средних параметров в разных экспериментальных группах животных оценивали с помощью ^критерия Стьюдента. Достоверность процентных соотношений оценивалась с помощью критерия Фишера.
Результаты исследований и их обсуждение
Влияние №N03 в дозе 0,5 мг/100 г на развитие стрессорных повреждений
Нитрат натрия в дозе 0,5 мг/100 г не оказывал достоверного влияния на устойчивость крыс линии КМ в условиях акустической экспозиции (таблица).
Влияние №N03 в дозе 5 мг/100 г на развитие стрессорных повреждений
Нитрат натрия в дозе 5 мг/100 г оказывал значительный протекторный эффект на крыс линии КМ в условиях акустической экспозиции. В опытной группе существенно снижена доля животных с тяжелыми нарушениями движений по сравнению с контролем (30,4 и 78,3% соответственно, р < 0,01) и увеличена доля животных с легкими нарушениями (26,1 и 0% соответственно, р < 0,01) (рис. 1). Площадь субдуральных и видимых субарахноидальных кровоизлияний у опытных животных была в 1,7 раза меньше, чем у контрольных (р < 0,05) (рис. 3). Внутри-желудочковые кровоизлияния у опытных крыс встречались значительно реже, чем в контроле (47,8 и 91,3% соответственно, р < 0,01). Наблюдалось увеличение латентного периода судорожного припадка в опытной группе животных по сравнению с контролем (2,2 ±0,1 сек и 4,0 ± 0,2 сек соответственно, р < 0,01).
Влияние №N03 в дозе 50 мг/100 г на развитие стрессорных повреждений
Нитрат натрия в дозе 50 мг/100 г также оказывал выраженный протекторный эффект на разви-
Рис. 1. Влияние нитрата натрия (№N03) в дозе 5 мг/100 г на нарушения движений у крыс линии КМ в условиях акустического стресса.
1 — контроль, п = 23; 2 — №N0.; 5 мг/100 г, п = 23, ** — р < 0,01
Рис. 2. Влияние нитрата натрия (№N03) в дозе 50 мг/100 г на нарушения движений у крыс линии КМ в условиях акустического
стресса.
1 — контроль, п = 12; 2 — NN03 50 мг/100 г, п = 14, * — р < 0,05, *** — р < 0,001
тие стрессорных повреждений у крыс линии КМ. В опытной группе преобладают животные без нарушений движений в отличие от контроля (85,7 и 0% соответственно, р < 0,001) (рис. 2). Площадь субдуральных и видимых субарахноидальных кро-
Частота нарушений движений, % Смертность, % Латентный период, сек Субдуральные и видимые субарах-ноидальные кровоизлияния, мм2 Частота внутри-желудочковых кровоизлияний, %
отсутствуют легкие средние тяжелые
Контроль, п = 12 0 8,3 ± 8,3 41,7 ± 14,9 50,0 ± 15,1 16,7 ± 11,2 2,5 ±0,3 12,6 ± 4,4 25,0 ± 13,1
№N0^ п = 12 0 33,3 ± 14,9 25,0 ± 13,1 41,7 ± 14,9 8,3 ± 8,3 3,2 ± 0,2 7,8 ± 3,7 25,0 ± 13,1
Достоверность различий н.д н.д н.д н.д н.д н.д н.д н.д
Примечание: н.д — различия статистически недостоверны. 8 ВМУ, биология, № 1
мм' 40 35 30 25 20 15 10 5 0
□ 2
1
***
Рис. 3. Влияние нитрата натрия (№N03) в дозе 5 мг/100 г на развитие субдуральных и субарахно-идальных кровоизлияний у крыс линии КМ в условиях акустического стресса.
1 — контроль, п = 23; 2 — NaN03 5 мг/100 г, п = 23, * — р < 0,05
Рис. 4. Влияние нитрата натрия (№N0^ в дозе 50 мг/100 г на развитие субдуральных и субарахно-идальных кровоизлияний у крыс линии КМ в условиях акустического стресса.
1 — контроль, п = 23; 2 — NaN03 5 мг/100 г, п = 23, *** — р < 0,001
воизлияний у опытных животных была в 8,5 раза меньше, чем у контрольных (р < 0,01) (рис. 4). Внут-рижелудочковые кровоизлияния у опытных крыс встречались значительно реже, чем в контроле (33 и 0% соответственно, р < 0,05). Наблюдалось увеличение латентного периода судорожного припадка в опытной группе животных по сравнению с контролем (19,1 ± 2,4 сек и 7,3 ±1,2 сек соответственно, р < 0,01).
Таким образом, полученные результаты подтвердили предположение о возможном протекторном действии нитратов на развитие стрессорных нарушений у крыс линии КМ. Мы показали, что при введении нитрата уменьшается тяжесть двигательных нарушений, средние площади и частоты внутричерепных кровоизлияний.
Предполагаемый механизм защитного действия нитрата натрия реализуется в связи с тем, что в организме ионы N0 3 могут восстанавливаться в оксид азота (N0) по цепи трансформаций N0 3 ^ ^ N02 ^ N0 (Реутов и др., 1997). Ранее нами было показано, что воздействие относительно низких доз (0,5 мг/100 г) N0-генерирующего соединения — нитрита натрия — уменьшает развитие стрес-сорных нарушений у крыс линии КМ (Крушин-ский и др., 1989; Реутов и др., 2002). Сходное про-
текторное действие оказывал предшественник оксида азота L-аргинин в дозе 20 мг/100 г. Являясь активным вазодилататором (Марков, 1996; Реутов и др., 1997; Реутов, Сорокина, 1998), оксид азота способен увеличивать скорость кровотока в мозге (Каменский, Савельева, 2002; Zhang, Iadecola, 1993). Кроме того, NO обладает способностью ингиби-ровать агрегацию тромбоцитов (Марков, 1996; Radomski et al., 1987). Поэтому оксид азота может уменьшать гипоксию и ишемию мозга, возникающие в результате судорожного припадка и снижать вероятность возникновения внутричерепных кровоизлияний. Установлено, что гипоксия мозга является одним из критических факторов при развитии внутричерепных кровоизлияний (Кошелев, 1990). Умеренное повышение содержания NO и продуктов его метаболизма индуцирует пространственное перераспределение белков из растворимого в мемб-ранно-связанное состояние. При таком перераспределении белков может значительно увеличиваться как стабильность этих белков, так и стабильность мембран, а также могут активироваться многие ферментные системы, в том числе и ферменты гликолиза, участвующие в синтезе АТФ (Реутов и др., 1997), что в свою очередь может снижать последствия ишемии и гипоксии мозга, развивающиеся в результате судорожного припадка.
Некоторое снижение возбудимости центральной нервной системы у опытных животных под действием нитрата натрия, проявившееся в увеличении латентного периода судорожного припадка, также может вносить положительный вклад, уменьшая развитие стрессорных повреждений.
В заключение отметим, что протекторный эффект нитрата натрия на развитие стрессорных повреждений у крыс линии КМ проявляется в дозах, во много раз превышающих защитную дозу нитрита натрия. Это связано с тем, что большая часть нитратных ионов выводится из организма (Реутов и др., 1997), а меньшее количество восстанавливается до нитритов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Башкатова В.Г., Раевский К.С. 1998. Оксид азота в механизмах повреждения мозга, обусловленных нейротоксическим действием глутамата // Биохимия. 63. № 7. 1020—1028.
Березовский В.А., Назаренко А.И. 1964. Энергетические показатели состояния коры головного мозга собаки при экспериментальном судорожном припадке // Теплообразование в организме. Киев. С. 32—33.
Ванин А. Ф. 2000. Оксид азота в биомедицинских иссследованиях // Вестн. РАМН. № 4. 3—5.
Гурин А. В. 1997. Функциональная роль оксида азота в центральной нервной системе // Усп. физиол. наук. 28. № 1. 53—60.
Дьяконова Т.Л., Реутов В.П. 1998. Влияние нитрита на возбудимость нейронов мозга виноградной улитки // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 84. № 11. 1264—1272.
Каменский А.А., Савельева К.В. 2002. Оксид азота и поведение. М.
Кошелев В.Б. 1990. Структурная перестройка кровеносного русла при экспериментальной гипертензии и адаптации к гипоксии: механизмы и регуляторные последствия: Дис. ... докт. биол. наук. М.
Крушинский Л.В. 1960. Формирование поведения животных в норме и патологии. М.
KpymHHCKiH A.n., PacHHa T.B., Ko-meneB B.E., CoTCKaa M.H., Ec6hhob E.M., Eenax A.T., CTpeiKOB P.E., KopmyHo-Ba T.C., lapcKHH 3.T. 1989. npoTeKTopHoe Aefi-
CTBHe pa3HMx bhaob h pexHMoB aAaптaцнн k rHnoKCHH Ha pa3BHTHe CTpeccopHbix noBpexAeHHH y Kpbic ^hhhh KM // ®H3Hon. xypH. CCCP. 75. № 11. 1576-1584.
MapKoB X.M. 1996. OKHCb a3oTa h oKHCb yrne-poAa — hobmh Knacc CHraanbHbix MoneKyn // Ycn. $H3Hon. HayK. 27. № 4. 30—43.
Hhhkob C., Kpнвнцкaн T.H. 1969. AKycTH-necKHH CTpecc h цepe6poвнcцepaпbHbie HapymeHHH. M.
PaeBCKHH K.C., EamKaToBa B.T., Bah h h A. O. 2000. Ponb oKCHAa a3oTa b rnyTaMaTeprH-necKon naTonorHH Mo3ra // BecTH. PAMH. № 4. 11—15.
PeyToB B.n., CopoKHHa E.T. 1998. NO-chh-Ta3Haa h HHTpHTpeAyKTa3Haa KoMnoHeHTbi цнкпa oKCHAa a3oTa // Ehoxhmhh. 63. № 7. 1029—1040.
PeyToB B.n., CopoKHHa E.T., Koch-цнн H.C., Oxothh B.E. 2003. npo6neMa oKCHAa a3o-Ta b 6HonorHH h мeAHцннe h пpннцнп цнкnнннocтн. M.
PeyToB B.n., CopoKHHa E.T., Oxothh B.E., Kocнцнн H.C. 1997. UHK^HHecKHe npe-Bpa^eHHH oKCHAa a3oTa b opraHH3Me MneKonHTaro^nx. M.
PeyToB B.n., Ky3eHKoB B.C., KpymHH-okhh A.n., KomeneB B.E., PacHHa T.B., leBmHHa H.n., 0yiKHH H.H., Koch-цнн H.C., Aнpaпeтннц M . T. 2002. Pa3BHTHe
CTpeccopHMx noBpe^AeHHH y Kpbic nHHHH KpymHHCKo-ro—MonoAKHHon, reHeTHHecKH npeApacnonoxeHHbix k cy-AopoxHMM npHnaAKaM, npH AencTBHH NO-reHepHpyro^ero coeAHHeHHH // BecTH HAH EenopyccHH. Cep. MeA.-6Hon. HayK. № 1. C. 5—10.
CHTAHKoBa T.O., 3e$HpoB A.n. 2006. Ta-3oo6pa3HMe nocpeAHHKH b HepBHon CHCTeMe // Poc. $h-3Hon. xypH. hm. KM. CeneHoBa. 92. № 7. 872—882.
Gladwin M.T. 2005. Hemoglobin as nitrite reductase regulating red cell-dependent hypoxic vasodilatation // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 32. N 5. 363—366.
Martin H.M., Hancock J.T., Salisbury V., Harrison R. 2004. Role of Xantine oxireduc-tase as an antimicrobical agent // Infection and Immunity. 72. N 9. 4933—4939.
Millar T. M., Stevens C. R., Blake D.R. 1997. Xantine oxidase can generate nitric oxide from nitrate in ishaemia // Biochem. Soc. Trans. 25. N 3. 528—531.
Moncada S., Palmer R.M.J., Higgs E.A. 1992. Nitric oxide: phisiology, patophisiology, and pharmacology // Pharmacol. Rev. 43. 109—142.
Radomski M.W., Palmer R.M.J., Moncada S. 1987. Comparative pharmacology of endote-lium-derived relaxing factor // Nature. 327. 524—527.
Zhang F., Iadecola C. 1993. Nitroprusside improves blood flow and reduces brain damage after local ishe-mia // NeuroReport. 4. N 5. 559—562.
nocTynHna b peAaKUHro 20.12.07
SODIUM NITRATE DECREASES DEVOLOPMENT OF ACUSTIC STRESS-INDUCED DISCORDERS IN RATS OF KRUSHINSKY-MOLODKINA STRAIN
A.L. Krushinsky, V.S. Kuzenkov, V.P. Reutov, V.B. Koshelev, E.G. Sorokina
Effects of NaN03 on the development of stress-induced disorders were studied on a model of acoustic stress in Krushinsky—Molodkina rats genetically predisposed to audiogenic seizures. NaN03 at 5 mg/100 g and 50 mg/100 g body weight caused a decrease in severity of motor disorders and areas of subdural and subarahnoid hemorrhages. NaN03 at 0,5 mg/100 g had no effect.
9 BMY, SHonoraa, № 1
