CC BY
90
УДК 616.314.17 - 092.18 : 577.12 Ляшенко Л.1., Костенко В.О.
NF-КВ-ОПОСЕРЕДКОВАНИЙ ВПЛИВ NO-СИНТАЗ НА В1ЛЬНОРАДИКАЛЬН1 ПРОЦЕСИ У ТКАНИНАХ ПАРОДОНТА ЗА УМОВ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО МЕТАБОЛ1ЧНОГО СИНДРОМУ
ВДНЗУ «УкраГнська медична стоматологiчна академiя», м. Полтава
У експеримент1 на 40 блих щурах досл'джено роль NF-kB у механзмах порушень вльнорадикальних процес'т, залежних eid функцонального стану NOS, у тканинах пародонта при моделюванн метаболчного синдрому (МС). Показано, що здатнсть нейрональноУ NO-синтази (nNOS) регулювати (обмежувати) пероксидне окиснення лШд'т (ПОЛ) у м'яких тканинах пародонта за умов МС е NF-кВ-опосередкованим. Збльшення при введенн селективного ¡нг1б1тора nNOS утворення ТБК-активних сполук та зниження антиоксидантного (АО) потенц1алу усуваеться призначенням ¡нг1б1тора ядерно)' транслокацУУ NF-kB JSH-23 (4-метил^-(3-фен1лпропт)бензол-1,2-д1ам1ну). Показано, що дя селективного ¡нг1б1тора ¡ндуцибельно'У NO-синтази амногуандину за умов МС не супроводжуеться NF-кВ-залежними змнами ПОЛ i АО потенц1алу в м'яких тканинах пародонта. Введення JSH-23 за умов експерименту супроводжуеться пдвищенням АО да L-аргiнiну.
Ключов1 слова: метабол1чний синдром, ядерний фактор кВ, оксид азоту, NO-синтази, пародонт, пероксидне окиснення л1п1д1в, антиоксидантна система.
Робота е фрагментом НДР "Кисень- та NO-залежш механ1зми ушкодження внутр/шн/х орган1в та iх корекц1я ф1з1олог1чно активними речовинами" (№ держреестрацп 0108U010079).
В останш роки повщомляеться про наявнють сшльних механiзмiв у розвитку метаболiчного синдрому (МС) i запально-дистрофiчних захворювань пародонта [7].
Важливим аспектом МС, що сприяе розвитку кардюваскулярних ускладнень, вважаеться ендотелiальна дисфунк^я [6]. Слщ зазначити, що до цього часу все ще не виршено питання причинно-наслщкових взаемозв'язмв
шсулшорезистентносп (1Р) i ендотелiальноï дисфункци', проте безсумшвним е той факт, що 1Р та дисфунк^я ендотелш, основним наслщком яко'1 е порушення синтезу оксиду азоту (NO), являють собою ланки одного ланцюга.
У той же час в^^чаеться неоднозначна дiя NO на патогенез захворювань як серцево-судинно!' системи та обмшу речовин [10], так i пародонта [16].
Вщомо, що значна ктькють ефек^в NO опосередковуеться за допомогою активацп транскрипцшного ядерного фактора кВ (NF-кВ) [11,12]. В останш роки висунуто припущення, що порушення NF-кВ сигналiзацiï може бути загальною ланкою, яка об'еднуе вс компоненти МС та призводить до шсулшорезистентносп, лтотоксичносп, системно!' пперцитокшеми та артерiальноï гiпертензiï [2].
Актива^я NF-кВ та iндуцибельноï NO-синтази (iNOS) супроводжуеться посиленням вироблення активних форм кисню, зокрема,
супероксидного анюн-радикала (О 2 ) [11]. У той же час, у дослщах на кулы^ астроцитiв та in vivo (тканини тонко!' кишки) показано, що пригшчення NF-кВ може розглядатися як мехашзм регуляторного впливу нейрональноУ NO-синтази (nNOS) на експресш iNOS [15,18]. Пригшчення nNOS супроводжуеться актива^ею
NF-kB, зниженням вмюту шпбторного бтка 1кВа з наступним пiдвищенням мРНК iNOS, вмюту та активност цього ферменту [15].
Рашше нами показана участь nNOS за умов експериментального МС у регуляци' вироблення
у м'яких тканинах пародонта О2 , у т.ч. мiкросомальним i мiтохондрiальним електронно-транспортними ланцюгами (ЕТЛ) [4].
Проте роль NF-kB у реалiзацiï ефек^в рiзних iзоформ NOS на втьнорадикальш процеси у тканинах пародонта за цих умов залишаеться нез'ясованою.
Метою роботи було вивчення ролi NF-kB у мехашзмах порушень втьнорадикальних процесiв, залежних вiд функцiонального стану NOS, у тканинах пародонта щурiв за умов моделювання МС.
Матерiали та методи дослщження
Дослiдження були проведенi на 40 бiлих щурах-самцях лшп Вютар масою 180-230 г у 8-ми серiях дослiдiв: у першш необхiднi показники вивчали у штактних тварин (контрольна серiя), у другш - пiсля моделювання МС, у третш, четвертiй i п'ятiй серiях - протягом вiдтворення МС тваринам вводили вщповщно селективний iнгiбiтор nNOS 7-штрошдазол (7-NI), селективний iнгiбiтор iNOS - амшогуашдин i субстрат NO-синтазно' реакцп - L-аргiнiн, у шостш, сьомiй та восьмiй - поряд з наведеними вище речовинами щурам на ™i моделювання МС вводили шпбтор активацп NF-kB II - JSH-23 (4-метил-^(3-фешлпропт)бензол-1,2^амш).
Для моделювання МС гризунам протягом двох мюя^в призначали 20% водний розчин фруктози для пиття та '"фету захщного типу", що мютить такi складовi: рафшоване пшеничне
борошно - 45%, сухе знежирене коров'яче молоко - 20%, крохмаль - 10%, столовий маргарин (3i складом жирiв 82%) - 20%, переокиснена соняшникова олiя - 4%, натрш хлорид - 1%. 7-NI ("Sigma", США) призначали в дозi 30 мг/кг [14] , амшогуанщин ("Sigma", США) -20 мг/кг [17], L-аргшш ("Kyowa Hakko Kogyo Co LTD", Япоыя) - 500 мг/кг [1], JSH-23 ("Santa Cruz Biotechnology", ФРН) - 1 мг/кг маси тварини [13]. Уа сполуки вводили внутршньоочеревинно 2 рази на тиждень протягом перюду вщтворення МС. Тварин декаттували пiд ефiрним наркозом.
Утворення О2 у м'яких тканинах пародонта оцшювали при проведеннi тесту з штросишм тетразолieм з такими шдукторами: НАДН - для
оцшки продукци О2 мiтохондрiальним ЕТЛ;
НАДФН - для оцшки продукци О2 мiкросомальним ЕТЛ [9]. Рiвень пероксидного окиснення лiпiдiв (ПОЛ) у тканинах оцшювали за утворенням у реакцп тюбарб^уровоТ' кислоти (ТБК) з ТБК-активними продуктами забарвленого триметшового комплексу до i пiсля 1,5-годинноТ шкубаци у прооксидантному залiзоаскорбатному буферному розчиш [5]. Активнiсть антиоксидантноТ (АО) системи оцiнювали за приростом концентрацп ТБК-активних продуктiв за час твторагодинноТ iнкубацiТ гомогенату тканин у
залiзоаскорбатному буферному розчинi, а також за активнютю каталази [5].
Вплив NF-kB JSH-23 на вiльнорадикальнi процеси у м'яких
Отримаш данi обробляли варiацшно-статистичним методом з використанням критерш Ст'юдента.
Результати дослiдження та ïx обговорення
Для дослiдження можливоТ ролi NF-kB у реалiзацiï ефек^в NOS на вiльнорадикальнi процеси в тканинах пародонта за умов вщтворення експериментального МС щурам призначали JSH-23, який впливае на мехашзм активацп NF-kB, пов'язаний з ядерною транслока^ею вiльноï форми фактора, завдяки чому пригшчуеться генна транскрипцiя. При цьому процес деградацп бiлкiв родини IkB не порушуеться [13]
За умов сполученоТ дiï селективного iнгiбiтора nNOS 7-NI та JSH-23 (табл. 1)
генера^я О2 у м'яких тканинах пародонта щурiв мiкросомальним ЕТЛ знижуеться - на 13.2% (p<0,05), мiтохондрiальним ЕТЛ - на 18.5% (p<0,0l) у порiвняннi з даними третьоТ серiï. За цих умов концентра^я ТБК-реактантiв iстотно знижуеться - на (21.5%, p<0,05). Прирiст концентрацп ТБК-реактакпв за час iнкубацiï у прооксидантному буферному розчиш зменшуеться на 21.3% (p<0,01) у порiвняннi з даними третьоТ серiï.
У той же час, актившсть каталази за цих умов ютотно не в^зняеться вiд результату третьоТ серiï.
Таблиця 1
инах пародонта умов в/дтворення МС та пригн1чення nNOS
(M+m, n=20)
Показники Серп' дослiдiв
lнтактнi тварини Вщтворення МС
Контроль + 7-NI + 7-NI + JSH-23
Продук^я О 2 , нмоль/гс мiкросомальним ЕТЛ (стимуляцiя НАДФН) мiтохондрiальним ЕТЛ (стимуляцiя НАДН) 19.07±1.52 18.53±1.15 28.40±0.97* 29.87±0.76* 32.27±0.85 */** 33.87±0.83 */** 28.00±1.54 */*** 27.60±1.35 */***
Концентра^я ТБК-реактантiв, мкмоль/кг 20.7±2.5 35.1±1.6* 40.4±2.1* 31.7±2.7 */***
Прирiст ТБК-реактантiв за час до шкубаци' 17.6±1.2 29.9±0.9* 33.8±0.9 */** 26.6±1.5 */***
Каталаза, мккатал/кг 2.73±0.32 1.68±0.22* 2.41±0.21** 2.57±0.33
Прим1тка: * - р <0,05 при пор1внянн1 з даними нтактних щур'в; ** -при пор1внянн1 з даними третьоТ серп
Таким чином, здатнють селективного
шпбтора nNOS 7-М пщвищувати продукцш О 2 мiкросомальним i мiтохондрiальним ЕТЛ, 1 концентрацш ТБК-реактантiв та Тх прирiст за час шкубаци у прооксидантному буферному розчинi усуваеться при пригшченш ядерноТ транслокацiТ NF-кB при застосуванш JSH-23.
Це вказуе, що вироблення О2 , штенсифка^я ПОЛ та зниження АО потен^алу у м'яких тканинах пародонта за умов вщтворення МС пов'язаш з пригшченням nNoS, I опосередкуються активацiею NF-кB.
■ Р <0,05 при пор1внянн1 з даними другоТсерТ *** - Р <0,05 Пригшчення nNOS супроводжуеться
гiперпродукцiею О 2 , яка може реалiзуватися через NF-кB-опосередковану експресiю iNOS. Вщомо, що з функцiонуванням останньоТ
пов'язана надлишкова генерацiя О2 у тканинах пародонта при рiзних токсичних впливах та запаленш [3,8].
При сполученому впливi селективного iнгiбiтора iNOS амiногуанiдину та iнгiбiтора активацiТ NF-кB II - JSH-23 за умов вщтворення експериментального МС у м'яких тканинах пародонта збер^аеться зменшений загальний
фон продукци О2 , рiвень його генераци мiкросомальним i мiтохондрiальним ЕТЛ, знижена концентрацiя ТБК-реактантiв та ïx прирют за час шкубаци у прооксидантному буферному розчиш (табл. 2).
Тобто, пригшчення iNOS досить ефективно
Вплив NF-kB j
обмежуе вироблення активних форм кисню та реакци ПОЛ i додаткове порушення меxанiзму активацiï NF-kB, що, як вщомо, також зменшуе експресiю iNOS, ютотно не позначаеться на вщповщних показниках.
Таблиця 2
1-23 на вiльнорадикальнi процеси у м'яких тканинах пародонта умов вiдтворення МС та пригшчення iNOS (M+m, n=20)
Показники Серп' дослав
1нтактш тварини Вiдтворення МС
Контроль + амiно-гуанiдин + амiногуанiдин + JSH-23
Продукф О 2 , нмоль/г с мiкросомальним ЕТЛ (стимуля^я НАДФН) мiтоxондрiальним ЕТЛ (стимуляцiя НАДН) 19.07±1.52 18.53±1.15 28.40±0.97* 29.87±0.76* 25.20±1.14* 24.27±0.88 */** 23.87±1.38 */** 23.07±1.16 */**
Концентра^я ТБК-реактантiв, мкмоль/кг 20.7±2.5 35.1±1.6* 21.6±2.7** 25.0±2.5**
Прирiст ТБК-реактантiв за час до шкубаци 17.6±1.2 29.9±0.9* 18.2±1.1 ** 21.0±1.4**
Каталаза, мккатал/кг 2.73±0.32 1.68±0.22* 2.67±0.27** 2.76±0.25**
Примiтка: * - р <0,05 при порiвняннi з даними нтактних шур'в; при порiвняннi з даними четвертоТ серп
При сполученому впливi субстрату NOS L-аргшшу та шпбтора активацп' NF-kB II - JSH-23 -за умов вщтворення експериментального МС у м'яких тканинах пародонта суттевих змш
Вплив NF-kB JSi
** - Р <0,05 при порiвняннi з даними другоТсерП'; *** - Р <0,05
загального фону продукци О2 та рiвня його генераци мiкросомальним i мiтоxондрiальним ЕТЛ у порiвняннi з даними п'ятоТ' сери ми не виявили (таблиця 3).
Таблиця 3
1-23 на вiльнорадикальнi процеси у м'яких тканинах пародонта лов вiдтворення МС та введення субстрату NOS (M+m, n=20)
Показники Серп' дослав
Iнтактнi тварини Вiдтворення МС
Контроль + L-аргiнiн + L-аргiнiн + JSH-23
Продукцiя О 2 , нмоль/г с мiкросомальним ЕТЛ (стимуля^я НАДФН) мiтоxондрiальним ЕТЛ (стимуляцiя НАДН) 19.07±1.52 18.53±1.15 28.40±0.97* 29.87±0.76* 25.87±0.91* 28.00±0.78* 27.07±1.52* 27.74±1.14 *
Концентра^я ТБК-реактантiв, мкмоль/кг 20.7±2.5 35.1±1.6* 23.6±1.9** 18.3±0.6 **/***
Прирiст ТБК-реактан"пв за час до шкубаци' Каталаза, мккатал/кг 17.6±1.2 2.73±0.32 29.9±0.9* 1.68±0.22* 20.3±1.0** 2.22±0.19 16.8±0.8 **/*** 2.65±0.25**
Примтка: * - р <0,05 при пор'внянш з даними нтактних ш,урiв; при порiвняннi з даними п'ятоТсерп
Проте за цих умов ютотно змшюються показники ПОЛ. Так, концентра^я ТБК-реактанпв зменшуеться - на 22.5% (p<0,05) у порiвняннi з результатом п'ято!' сери'. Прирют концентрацп' ТБК-реактанпв за час шкубаци у прооксидантному буферному розчиш знижуеться на 17.2% (p<0,05).
Таким чином, у цьому випадку пригшчення активност NF-kB супроводжуеться пщвищенням антиоксидантноТ ди L-аргшшу в м'яких тканинах пародонта.
Можна припустити наявнють нового мехашзму, що пояснюе феномен «аргшшового парадоксу». Так, за наявност умов для пригшчення активност NF-kB екзогенно введений L-аргшш утилiзуеться конститутивними NOS, що виробляють NO, який виконуе сигнальш функци (у т.ч. нацтеш на обмеження ПОЛ). При цьому експреая iNOS значно зменшуеться або вщсутня, що запоб^ае ^^аци втьнорадикальних реакцш.
- Р <0,05 при пор'внянш з даними другоГсери; *** - Р <0,05 Висновки
1. Здатнють nNOS регулювати (обмежувати) ПОЛ у м'яких тканинах пародонта щурiв за умов експериментального МС е NF-kB-опосередкованою. Збтьшення за умов введення селективного шпбтора nNOS утворення ТБК-активних сполук та зниження АО потен^алу усуваеться призначенням шпбтора активацп' NF-kB II - JSH-23.
2. Дiя селективного шпб^ора iNOS амшогуанщину за умов експериментального МС не супроводжуеться NF-KB-залежними змшами ПОЛ i АО потен^алу в м'яких тканинах пародонта.
3. Введення шпбтора NF-kB JSH-23 за умов експериментального МС супроводжуеться пщвищенням антиоксидантноТ ди L-арпншу в м'яких тканинах пародонта.
Лтература
1. Дробшська О. Вплив L-аргшшу на ураження в слизовiй оболонц шлунка, спричиненi cepoTOHiHOM / О. Дробшська, Л. Остапченко, О. Цирюк [та ш.] // Вюн. Львiв. ун-ту. Сер. бioл. -2004. - Вип. 38. - С . 201-204.
2. Кайдашев 1.П. Актива^я NF-kB при мeтабoлiчнoму cиндpoмi / 1.П. Кайдашев // Фiзioл. журн. - 2012. - Т.58, №1. - С. 93-101.
3. Коваленко О.В. NO-залежш змши продукцп супероксидного анioн-pадикала в пiднижньoщeлeпних слинних залозах за умов експериментального травматичного Ыаладешту / О.В. Коваленко, В.О. Костенко // Актуальш проблеми сучасноТ медицини: Вюн. УкраТнськоТ мед. стоматол. академп. - 2011. -Т.11, №2. - C. 42-45.
4. Ляшенко Л.1. Роль NO-синтаз у мехашзмах порушень втьнорадикальних процеЫв у тканинах пародонта i слинних залоз щуpiв за умов експериментального мeтабoлiчнoгo синдрому / Л.1. Ляшенко, А.М. блшська, В.В. Талаш, В.О. Костенко // Свп- бioл. та мед. - 2014. - № 2. - С. 139-142.
5. Методи кшшчних та експериментальних дослщжень в медицин / [Л.В.Беркало, О.В.Бобович, Н.О.Боброва та ш.] ; за ред. 1.П. Кайдашева. - Полтава, 2003. - 320 с.
6. Мазуров В.И. Эндотелиальная дисфункция при метаболическом синдроме / В.И. Мазуров, В.А.Якушева // Эфферентная терапия. - 2006. - Т.12, № 3. - С. 19-25.
7. Романенко И.Г. Генерализованный пародонтит и метаболический синдром. Единство патогенетических механизмов развития / И.Г. Романенко, Д.Ю. Крючков // Кримськ. терапевт. журн. - 2011. - №1. - С. 60-67.
8. Стасюк О.А. Роль iзoфopм NO-синтази у мехашзмах порушень втьнорадикальних процеЫв у слинних залозах щуpiв за умов сптьного надлишкового надходження штрату та фториду натрто / О.А. Стасюк, В.О. Костенко // Свп" мед. та бюл. -2012. - № 4.
9. Цебржинский О.И. Дифференцированное спектрофотометрическое определение продукции супероксида в тканях НСТ-тестом / О.И. Цебржинский // Актуальш проблеми сучасноТ медицини: Вюн. УкраТнськоТ мед. стоматол. академп. -
2002. - Т. 2, №1. - C.96-97.
10. Эндогенные механизмы кардиопротекции как основа патогенетической терапии заболеваний сердца / под ред. А.А. Мойбенко, В.Е. Досенко, А.Н. Пархоменко. - К. : Наукова думка, 2008. - 520 с.
11. Brady T.C. Extracellular superoxide dismutase is upregulated with inducible nitric oxide synthase after NF-kappa B activation / T.C. Brady, L.Y. Chang, B.J. Day, J.D. Crapo // Am. J. Physiol. - 1997. - V. 273, №5 (Pt 1). - P. L1002- L1006.
12. Fan Y.H. Arginine vasopressin increases iNOS-NO system activity in cardiac fibroblasts through NF-kappaB activation and its relation with myocardial fibrosis / Y.H. Fan, L.Y. Zhao, Q.S. [et al.] // Life Sci. - 2007. - V.81, №4. - P. 327-335.
13. Kumar A. JSH-23 targets nuclear factor-kappa B and reverses various deficits in experimental diabetic neuropathy: effect on neuroinflammation and antioxidant defence / A. Kumar, G. Negi, S.S. Sharma // Diabetes Obes. Metab. - 2011. - V. 13, №8. -P.750-758.
14. Laude K. NO produced by endothelial NO synthase is a mediator of delayed preconditioning-induced endothelial protection / K. Laude, J. Favre, C. Thuillez [et al.] // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. -
2003. - V. 284, №6. - P. H2053-H2060.
15. Qu X.-W. Neuronal nitric oxide synthase (NOS) regulates the expression of inducible NOS in rat small intestine via modulation of nuclear factor kappa B / X.-W. Qu, H. Wang, I.G. de Plaen [et al.] // FASEB. - 2001. -V.15. - P. 439-446.
16. Sa Siqueira M.A. Nitric oxide and oral diseases: can we talk about it? / M.A. de Sa Siqueira, R.G. Fischer, C.M. da Silva Figueredo [et al.] // Cardiovasc Hematol Agents Med Chem. - 2010. - V.8, №2. -P. 104-112.
17. Takeuchi K. Role of endogenous nitric oxide (NO) and NO synthases in healing of indomethacin-induced intestinal ulcers in rats / K. Takeuchi, R. Hatazawa, M. Tanigami [et al.] // Life Sci. -2007. - V. 80, №4. - P. 329-336.
18. Togashi H. Neuronal (type I) nitric oxide synthase regulates nuclear factor kappaB activity and immunologic (type II) nitric oxide synthase expression / H. Togashi, M. Sasaki, E. Frohman [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci USA. - 1997. -V. 94, №6. - P. 2676-2680.
Реферат
NF-kB-ОПОСРЕДОВАННОЕ влияние no-синтаз на свободнорадикальные процессы в тканях пародонта при экспериментальном метаболическом синдроме
Ляшенко Л.И., Костенко В.А.
Ключевые слова: метаболический синдром, ядерный фактор kB, оксид азота, NO-синтазы, пародонт, пероксидное окисление липидов, антиоксидантная система.
В эксперименте на 40 белых крысах исследована роль NF-kB в механизмах нарушений свободнорадикальных процессов, зависящих от функционального состояния NOS, в тканях пародонта при моделировании метаболического синдрома (МС). Показано, что способность нейрональной NO-синтазы (nNOS) регулировать (ограничивать) пероксидное окисление липидов (ПОЛ) в мягких тканях пародонта при Мс является NF-кВ-опосредованным. Увеличение при введении селективного ингибитора nNOS образования ТБК-активных соединений и снижение антиоксидантного (АО) потенциала устраняется назначением ингибитора ядерной транслокации NF-кВ JSH-23 ^-метил-N- (3-фенилпропил) бензол- 1,2-диамина). Показано, что действие селективного ингибитора индуцибельной NO-синтазы аминогуанидина в условиях МС не сопровождается NF-кВ-зависимыми изменениями ПОЛ и АО потенциала в мягких тканях пародонта. Введение JSH-23 в условиях эксперимента сопровождается повышением АО действия L-аргинина.
Summary
NF-kB-MEDIATED influence of no-synthases on free radical processes in the periodontal tissues UNDER modeled METABOLIC SYNDROME Ljashenko L.I., Kostenko V.A.
Key words: metabolic syndrome, nuclear factor кВ, nitric oxide, NO- synthases, periodontium, lipid peroxidation, antioxidant system.
The role of NF-кВ in the mechanisms of free radical processes impairment depending on the functional state of NOS in periodontal tissues under modeled metabolic syndrome (MS) was studied in the experiment on 40 white rats. We have shown the ability of neuronal NO-synthases (nNOS) to regulate (limit) lipid peroxidation (LPO) in periodontal soft tissues under conditions of MS is NF-кВ- mediated. The introduction of selective nNOS inhibitor leads to the increase in the formation of TBA- active compounds, while the reduction in antioxidant potential (AO) is eliminated by the inhibitor of nuclear translocation of NF-кВ JSH- 23 (4-methyl-N- (3-phenylpropyl) benzene -1,2-diamine). It has been shown that the effect of selective inhibitor of inducible NO-synthase aminoguanidine under MS is not accompanied by NF-kB-dependent changes of LPO and AO capacity in periodontal tissues. The introduction of JSH-23 under conditions of metabolic syndrome is accompanied by increased AO action of L-arginine.
