CC BY
64
УДК615.281.8 Оригинальная статья
НЕйРОТОКСИКОЛОГИЧЕСКИй ПРОФИЛЬ новых Производных АДЕНИНА, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
Д.Г. Ковалев - НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета, зав. лабораторией психофармакологии, кандидат медицинских наук; Л.И. Бугаева - НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета, зав. лабораторией лекарственной безопасности, доктор биологических наук; А.А. Озеров - НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета, зам. директора НИИ, доктор химических наук.
NEUROTOXICOLOGIC PROFILE OF NEW ADENINE SUBSTANCES WITH ANTIVIRAL ACTIVITY
D.G. Kovalev - Volgograd State Medical University, Scientific Research Institute of Pharmacology, Head of Laboratory of Psychopharmacology, Candidate of Medical Science; L.I. Bugaeva - Volgograd State Medical University, Scientific Research Institute of Pharmacology, Head of Laboratory of Drug Safety, Doctor of Biological Science; A.A. Ozerov - Volgograd State Medical University, Scientific Research Institute of Pharmacology, Deputy Director, Professor, Doctor of Chemical Science.
Дата поступления - 10.05.10 г.
Дата принятия в печать - 15.06.2010 г.
Д.Г. Ковалев, Л.И. Бугаева, А.А. Озеров. Нейротоксикологический профиль новых производных аденина, обладающих противовирусной активностью. Саратовский научно-медицинский журнал, 2010, том 6, № 2, с. 253-256.
Целью данной работы явилось изучение фармакологических свойств, определения широты диапазона безопасного действия и токсикологических свойств нового оригинального производного аденина, 9-[2-(4-изопро-пилфенокси)этил]аденин, под лабораторным шифром VMA-99-82, проявляющего противовирусную активность in vitro. В работе представлены результаты изучения нейротоксикологического профиля соединения VMA-99-82, с использованием методики многотестового наблюдения по «S.lrvin». В ходе исследования установлено, что по токсичности и по степени безопасности вещество VMA-99-82 относится к классу малотоксичных соединений. Определен диапазон доз (от 18,7 до 300 мг/кг) отчетливой терапевтической активности вещества, в которой сопутствующие побочные эффекты выражены не существенно. Терапевтическая активность соединения VMA-99-82 находится в основном в области поведенческих реакций, что представляет интерес для дальнейшего углубленного изучения психотропной активности и механизма действия вещества
Ключевые слова: производные аденина; токсикологический профиль; тест «S.lrvin», крысы.
D.G. Kovalev, L.I. Bugaeva, A.A. Ozerov. Neurotoxicologic profile of new adenine substances with antiviral activity. Saratov Journal of Medical Scientific Research, 2010, vol. 6, № 2, p. 253-256.
The aim of the research is to study pharmacological properties and to determine safety effect diapason, toxico-logical properties of new adenine substances 9-[2-(4-isopropylphenopxy) aethyl] adenine under laboratory code VMA-99-82 which obtains antiviral activity in vitro. The results of the research of neurotoxicologic profile of combination of VMA-99-82 are presented in the work using technique of multistage testing according to «S.lrvin». While performing the research it has been established that safety level of substance VMA-99-82 refers to the class of low toxic combination. The diapason of doses (from 18,7 to 300 mg/kg) of substance evident therapeutic effect has been determined. Side-effects are not expressed significantly. Therapeutic effect of the combination VMA-99-82 has behavioral reactions. Thus the given substance must be further studied for psychotropic effect and its mechanism action.
Key words: adenine derivatives, toxicolologic profile, «S.lrvin» test, rats.
Введение. Изыскание новых высокоэффективных средств для лечения ВИЧ-1 и оппортунистических вирусных инфекций попрежнему остается одной их самых актуальных задач современной медицины. Однако высокая вариабельность генома ВИЧ-1 приводит к быстрому возникновению резистентности вируса к использующимся препаратам, что снижает клиническую эффективность антивирусных лекарственных средств. В этой связи поиск ингибиторов ВИЧ-1, имеющих принципиально иную химическую структуру по сравнению с известными препаратами, а значит, вероятно, и иной механизм противовирусного действия, представляет собой наиболее перспективный путь разработки лекарственных средств для лечения СПИД и других особо опасных и социально значимых вирусных инфекций. Одним из наиболее перспективных направлений является поиск селективных ненуклеозидных ингибиторов цитомегалови-русной ДНК-полимеразы [1, 2]. Соединения такого типа синтезируются и исследуются в НИИ фармакологии Волгоградского медицинского университета, в результате чего был открыт новый класс антицитоме-галовирусных агентов, демонстрирующих активность in vitro в наномолярном диапазоне [3].
Ответственный автор - Ковалев Дмитрий Геннадьевич,
НИИ фармакологии ГОУ ВПО “ВолГМУ Росздрава”, зав. лабораторией психофармакологии, к.м.н.
400066, г. Волгоград, пл.Павших Борцов, д.1,
тел.: (8442) 97-81-78, моб. 8-902-363-8950, факс (8442) 23-19-56,
E-mail: [email protected].
В рамках дальнейшего изучения фармакологических свойств и определения широты диапазона безопасного действия новых веществ были исследованы токсикологические свойства 9-[2-(4-изопропилфенок-си)этил]аденин, под лабораторным шифром VMA-99-82, как типичного представителя этого класса химических соединений.
В настоящей работе представлены результаты изучения нейротоксикологического профиля соединения VMA-99-82 с использованием схемы многотестового наблюдения по <^.1тп»
Методы. Эксперименты проводили на 90 белых лабораторных крысах обоего пола, массой 220240 г Проведение всех экспериментов над животными руководствуется базисными, нормативными Рекомендациями Комитета по экспериментальной работе с использованием животных при Минздрав-соцразвития России, Рекомендациями ВОЗ, «Международными рекомендациями по проведению медикобиологических исследований с использованием животных (1985)», а также согласно ГОСТ З 51000.396 и ГОСТ З 5100.4-96, правилами С1_Р. Приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики РФ», а также с разрешения Регионального независимого этического комитета ГУ Волгоградский Научный Центр РАМН и АВО. Вещество VMA-99-82, на 50% водном растворе ДМСО вводили крысам внутрижелудочно (металлическим
зондом) в арифметически возрастающих дозах от 18,7 до 4800 мг/кг за 1 час до тестирования.
Исследование нейротоксикологического профиля соединения VMA-99-82 проводилось по методу «S.lrvin» [4].
Спектр внешне наблюдаемых изменений, вызванных исследуемым веществом, выражали количественно по восьмибалльной шкале [5].
Кроме этого, в тесте «открытое поле» [6] у животных через 60 мин. после введения препарата исследовались двигательная, поисково-исследовательская и эмоциональная активности.
На втором этапе работ была проведена математическая обработка данных [5]. Интегральное состояние животных на каждую дозу отражалось графиком «дозовой траектории». По секторному местонахождению и местам преломления со сменой направления в пространстве траектории выделяли «особые точки» или так называемые, «особые дозы» вещества, способствующие резкому изменению профиля функционально - поведенческого статуса животных.
С учетом указанных точек на интегральном до-зовом графике вещества VMA-99-82 рассчитывали
уровни безопасного и токсического действия. Кроме того, с учетом данных ЛД50 у тестируемого вещества вычисляли диапазоны терапевтической активности, прогнозировали доклиническую степень безопасности.
Каждые сутки в течение двух недель отмечали количество погибших и выживших животных. Расчет Ю50 производился по методу Личфилда-Вилкоксона (версия 1.03;18.10.93).
Результаты. По результатам экспериментов был выявлен профиль психоневрологического действия VMA-99-82 в диапазоне доз от 18,7 до 4800 мг/кг. В обобщенном виде данные отражены в таблице 1.
Установлено, что в дозе 18,7 мг/кг вещество VMA-99-82 не влияет на поведение и нервно-мышечную возбудимость крыс. У данных животных лишь несколько активируется частота дыханий и повышается ректальная температура (в среднем на 0,50С). После введения крысам vMA-99-82 в дозах 37,5 мг/кг в поведении животных существенных изменений не зафиксировано. Температура тела крыс повышалась также идентично группе, находящейся под влиянием VMA-99-82 в дозе 18,7 мг/кг. Более существенными
Влияние вещества VMA-99-82 на функционально-поведенческий статус крыс
Таблица 1
Параметры
Дозы вещества, мг/кг
Н.Ш.*
18,7
37,5
75,0
15G
3GG
6GG
12GG
24GG
48GG
Поведенческие реакции
Вокализация G G G 1 G G G G 1 G
Настороженность 4 4 4 4 5 5 4 З З З
Пассивность G G G G G G G G G G
Стереотипия G G G G G G G G G G
Беспокойство G G G G G G G G G G
Агрессия G G G G G G G G G G
Груминг 4 4 4 4,5 4,5 4,5 4 4 З 2
Спонтанная двигательная активность 4 4 4 5 5 5 4,5 З З 2
Нервно-мышечная возбудимость
Реакция на прикосновение 4 4 4,5 4,5 4,5 5 4,5 4,5 З 2
Реакция на боль 4 4 4,5 5 4,5 5 4,5 4,5 4 З
Реакция на стук 4 4 4 4,5 4 4 4 4 З З
Тремор G G G G G G G G G G
Подергивание G G G G G G G G G G
Судороги G G G G G G G G G G
Расстройство походки G G G G G G G G G G
Тонус конечностей 4 4 4 4,2 4,5 4,5 4,5 4 З З
Вегетативные эффекты
Положение мигательной перепонки 4 4 4 4 4 4 4 4 З З
Размер зрачка 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2
Саливация 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5
Уринация G G G G G G G 1 2 2
Дефекация 4 4 4 З З З 2 2 2 4
Температура 4 4,5 4,5 5 5,5 6 5 З З З
Цвет кожи 4 4,5 4,5 4,5 4,5 4,5 4 З З З
Частота дыхания 4 4,5 5 5,5 5,5 6 3,5 3,5 З 1
Примечание: НШ - оценка состояния животных в норме.
Саратовский научно-медицинский журнал. 2G1G. Том 6. № 2.
оказались эффекты испытуемого вещества, после введения в дозах от 75 до 300 мг/кг. В указанном интервале под действием VMA-99-82 у крыс дозозависимо повышались настороженность, груминг, спонтанная двигательная активность, также снижались пороги болевой и тактильной чувствительности, повышался тонус конечностей. Со стороны вегето-тропных эффектов, у крыс под действием вещества VMA-99-82 наблюдалось усиление дыхательной активности, прогрессирующее повышение ректальной температуры. У животных под действием вещества в дозе 300 мг/кг ректальная температура повышалась в среднем на 2-2,50С, а частота дыханий возросла в 2 раза. Кожные покровы крыс были гиперемирова-ны. В диапазоне доз от 600 до 4800 мг/кг у животных дозозависимо угнетались поведенческие реакции, нервно-мышечная возбудимость. В частности, снижались до нормы, а затем и ниже нормы акты груминга и горизонтальные формы передвижения. Повышались пороги болевой и тактильной чувствительности, понижалась ректальная температура (в среднем на 1,5-20С), угнеталось дыхание. У крыс под действием вещества в дозе 4800 мг/кг дыхание было единичным и не равномерным (до 5-10 актов в мин.).
Суммируя полученные данные, можно заключить, что фармакологическая активность вещества VMA-99-82, прослеживающаяся в диапазоне доз от 18,7 до 600 мг/кг, постепенно нивелируется при введении его в более высоких дозах. Эффекты VMA-99-82 после введения крысам в дозах от 1200 до 4800 мг/кг свидетельствуют о его токсическом влиянии.
Результаты балльной оценки эффектов вещества VMA-99-82 на спектры поведенческих, нервномышечных и вегетативных реакций и последующей интегральной обработке представлены в виде «до-зовой траектории» круговой диаграммы на графике (рис. 2).
Рис. 1. Интегральная оценка острого влияния вещества УМА-99-82 на функционально-поведенческий статус крыс
Обозначения: римские цифры на «дозовой траектории» от і до ІХ соответствуют дозам вещества - 18,7 мг/кг; 37,5 мг/ кг; 75,0 мг/кг; 150,0 мг/кг; 300,0 мг/кг; 600,0 мг/кг; 1200,0 мг/кг; 2400,0 мг/кг; 4800,0 мг/кг.
Цифры на круговой диаграмме: 1 - вокализация, 2 - настороженность, 3 - пассивность, 4 - стереотипия, 5 - беспокойство, 6 - агрессия, 7 - груминг, 8 - спонтанная двигательная активность, 9 - реакция на прикосновение, 10 - реакции на боль, 11 - реакции на стук, 12 - тремор, 13 -подергивание, 14 - судороги, 15 - расстройство походки, 16 - тонус конечностей, 17 - положение мигательной перепонки, 18 - размер зрачка, 19 - саливации, 20 - уринации, 21 - дефекации, 22 - температура, 23 - цвет кожи, 24 - частота дыханий.
Обсуждение. «Дозовая траектория» вещества VMA-99-82 на графике охватывает все три сектора функционально-поведенческого статуса крыс. Анализируя расположение дозовых точек на «дозовой траектории» диаграммы, можно предположить отсутствие существенного влияния вещества VMA-99-82 в дозе 18,7 мг/кг на спектры поведенческих и нервнорефлекторных реакций. При этом интегральное отражение эффектов вещества в точке I на «дозовой траектории» свидетельствует о превалировании влияний VMA-99-82 в дозе 18,7 мг/кг на центры терморегуляции и дыхание. В связи с этим можно предположить, что данная точка отражает минимальную фармакологическую активность вещества, которая не затрагивает качественную основу поведенческих и двигательных реакций. В следующем диапазоне точек от II до V (соответствуют дозам от 37,5 до 300 мг/ кг), расположенных на «дозовой траектории» испытуемого вещества, спектр его эффектов приблизительно одинаков, при этом точка II графика (доза вещества 37,5 мг/кг) расположена практически рядом с точкой I. Данное расположение точек на траектории свидетельствует о равном влиянии VMA-99-82 на поведенческо-функциональный статус крыс, причем в этой дозе у вещества превалируют эффекты вмешательства в центры теплорегуляции и дыхания, тогда как влияние на поведение остается минимальным, поэтому дозы VMA-99-82 от 18,7 до 37,5 мг/кг в плане влияния на ЦНС и поведение можно рассматривать как минимально эффективные (или, вероятно, разовые терапевтические, учитывая профиль противовирусной активности вещества). Все последующие дозы вещества до 300 мг/кг, отраженные на графике, обуславливают дозозависимый эффект влияния на ЦНС и поведенческий профиль. При этом в действии вещества начинают дозозависимо превалировать эффекты влияния на поведенческий статус крыс. То есть можно предположить, что в дозе 300 мг/кг (точка V) фармакологическая (или терапевтическая) активность будет максимальной. В данном диапазоне превалируют эффекты полезной фармакологической активности VMA-99-82, при этом побочные реакции выражены слабо. Последнее свидетельствует о том, что действие вещества VMA-99-82 в дозах от 18,7 до 300 мг/кг входит в диапазон безопасной терапевтической активности. Резкий сдвиг траектории дозовых эффектов в сторону сектора нервно-мышечной возбудимости, наблюдающийся в точках VI и VII, отражает произошедшие изменения в качественном реагировании гомеостатических структур организма крыс на вещество, введенное в дозах 600 и 1200 мг/ кг. Учитывая это, можно предположить, что фармакологическая эффективность вещества VMA-99-82 в диапазоне доз от III до V (соответственно от 75 до 300 мг/кг) сопряжена с побочными эффектами. Первоначально степень проявления этих эффектов предикторная. Однако при увеличении вводимых доз VMA-99-82 животным степень выраженности предикторов возрастает, а затем они начинают превалировать и снижать терапевтическую и безопасную ценность исследуемого вещества. Вместе с тем, все изменения, зафиксированные в этом диапазоне доз, у вещества восстанавливались в течение первых суток наблюдений и к гибели животных не приводили. В связи с этим можно заключить, что в диапазоне доз от 600 до 1200 мг/кг (точки VI и VII) фармакологическая активность вещества VMA-99-82 безопасна, но крайне низкая в отношении терапевтической эффективности.
Интегральное отражение эффектов вещества на «дозовой траектории» в точках VIII и IX (дозы от 2400 до 4800 мг/кг) наглядно иллюстрирует инверсию положительного действия VMA-99-82. В указанном диапазоне доз влияние вещества больше отражает динамику токсических эффектов. То есть можно заключить, что в дозах от 2400 до 4800 мг/кг вещество VMA-99-82 проявляет достоверно токсическую активность. По графику траектории интегральных «дозовых эффектов» видно, что общее состояние животных в обозначенных дозах резко инвертировано эффектам, наблюдающимся в диапазонах доз от 18,7 до 300 мг/кг. В данном случае преобладают эффекты влияния VMA-99-82 на вегетотропные реакции, которые оказались необратимыми (т.е. токсическими) и способствовали гибели животных.
В результате проведенных исследований установлено, что в диапазоне от 18,7 до 4800 мг/кг в действии вещества VMA-99-82 на психоневрологический статус крыс прослеживаются четыре этапа. При этом в первой и второй зонах отчетливо прослеживаются нарастающие дозозависимые эффекты. На «дозовой траектории» точки ^ (дозы вещества от 18,7 до 300 мг/кг) расположены по вертикали рядом, поэтому влияние исследуемого соединения на психоневрологический статус крыс можно рассматривать как эффективное. Третью зону активности вещества VMA-99-82 в диапазоне доз, расположенных на траектории в точках V-VII (соответствует 300-1200 мг/кг), можно отнести к диапазону безопасной активности вещества VMA-99-82 с минимальной терапевтической активностью и выраженными побочными эффектами. Четвертая зона соответствует токсическому диапазону активности вещества в дозах 2400 и 4800 мг/кг.
Заключение. По уровню токсичности и по степени безопасности вещество VMA-99-82 относится к классу малотоксичных соединений. ЛД50 составил 4000 мг/кг.
Активность вещества VMA-99-82 в диапазоне доз от 18,7 до 300 мг/кг свидетельствует об отчетливой терапевтической активности вещества, в которой сопутствующие побочные эффекты выражены несущественно.
Терапевтическая активность соединения VMA-99-82 находится в основном в области поведенческих реакций, что представляет интерес для дальнейшего углубленного изучения психотропной активности и механизма действия вещества.
Конфликт интересов. Данная работа проводилась в рамках плана научно-исследовательской работы НИИ фармакологии ГОУ ВПО «ВолГМУ Росз-драва».
Библиографический список
1. Chan L., Jin Н., Stefanac Т. et al. Discovery of 1,6-naphthyridines as a novel class of potent and selective human cytomegalovirus inhibitors // J. Med. Chem. 1999. Vol. 42, №. 16. P. 3023-3025.
2. Slater M.J., Baxter R., Bonser R.W. et al. Synthesis of N-alkyl substituted indolocarbazoles as potent inhibitors of human cytomegalovirus replication // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001. Vol. 11, № 15. P. 1993-1995.
3. Петров В.И., Озеров А.А., Новиков М.С. и др. Новый класс ненуклеозидных ингибиторов вирусной репродукции -производные 9-[2-фенокси(бензилокси)этил]аденина // Бюлл. ВНЦ РАМН и АВО. 2006. Вып. 1. С. 15-16.
4. Иёжица И.Н., Спасов А.А., Бугаева Л.И. и др. Токсическое влияние бромантана на неврологический статус животных при однократном введении // Бюлл. Экспер. биологии и медицины. 2002. Т. 133, № 4, С. 38-44.
5. Бугаева Л.И. Токсикологическая характеристика новых психотропных препаратов класса актопротекторов и ноотро-пов: Автореф. дис. докт. биол. наук. Волгоград, 2001. 36 с.
6. Буреш Я. Бурешова О., Хьюстон Д.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М.: Высшая школа, 1991. 399 с.
