CC BY
22
УДК 615.017:616.079+ 615.2/.3.001.37
НЕЙРОРЕЦЕПТОРНЫЕ ЭФФЕКТЫ АНТИМИГРЕНОЗНОГО АГЕНТА
9-ДИЭТИЛАМИНОЭТИЛ-2-(4-МЕТОКСИФЕНИЛ)ИМИДАЗО[1,2-A] БЕНЗИМИДАЗОЛА
Я.В. Агацарская12, Д.С. Яковлев1'2, Д.С. Мальцев1'2, Ю.В. Семенова1, Д.А. Салихов1,
К.Т. Султанова1, В.А. Анисимова3
ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации;
2ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр»;
3Научно-исследовательский институт физической и органической химии Южного Федерального университета
Были изучены 5-НТ2А-антагонистические, М-холинергические, гистаминергические и ГАМК-ергические свойства дигидрохлорида 9-диэтиламиноэтил-2-(4-метоксифенил)имидазо[1,2-а] бензимидазола - соединения РУ-31 с антимигренозными свойствами. Для соединения РУ-31 на моделях in vivo и in vitro было показано умеренное М-холиноблокирующее и ГАМК-миметическое действие и отсутствие влияния на гистаминергическую систему.
Ключевые слова: 5-НТ2А-антагонисты, серотонин, М-холинорецепторы, ГАМК-рецепторы, Н1-гистаминовые рецепторы, Н2-гистаминовые рецепторы.
DOI 10.19163/1994-9480-2019-1 (69)-120-124
NEURORECEPTOROLOGICAL EFFECTS OF ANTIMIGRAINE AGENT 9-DIETHYL-2-(4-METHOXYPHENYL)IMIDAZO[1,2-A]BENZIMIDAZOL
Ya.V. Agatsarskaya12, D.S. Yakovlev12, D.S. Maltsev12, Yu.V. Semenova1, D.A. Salikhov1,
K.T. Sultanova1, V.A. Anisimova3
FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation;
2SBI «Volgograd Medical Scientific Centre»;
3Research Institute of Physical and Organic Chemistry of Southern Federal University
The 5-НТ2А antagonistic, M-cholinergic, histaminergic and GABA-ergic properties of 9-diethylaminoethyl-2-(4-methoxyphenyl) imidazo [1,2-a] benzimidazole dihydrochloride - RU-31 compounds with antimigraine properties were studied. Moderate M-anticholinergic and GABA mimetic action and no effect on histaminergic system were shown for RU-31 compound in vivo models in vitro.
Key words: 5-HT2A-antagonists, serotonin, M-cholinoreceptors, GABA-receptors, H1-histaminoreceptors, H2-histaminoreceptors.
В предыдущих исследованиях было выявлено соединение РУ-476 с противомигренозными свойствами [3]. Для него был в ряде тестов широко изучен нейрорецепторный профиль и механизм действия [4]. В дальнейшем было разработано соединение РУ-31, для которого была показана антимигренозная активность [3, 4, 12]. С учетом сложности рецепторного профиля известных про-тивомигренозных препаратов с антисеротониновой активностью, таких как кетансерин [8] и ципрогепта-дин [11], считавшихся высокоселективными в отношении 5-НТ2А-рецепторов, для которых в последних исследованиях была показана активность в отношении М-холинорецепторов, гистаминорецепто-ров и ГАМК-рецепторов, для соединения РУ-31 становится целесообразным более детально изучить рецепторные аспекты механизма действия.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучить возможность взаимодействия нового 5-НТ2А-антагониста, соединения РУ-31, с холинер-гической, гистаминергической, адренергической и ГАМК-ергической системами in vitro и in vivo.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Соединение РУ-31 было синтезировано в лаборатории органического синтеза НИИ ФОХ ЮФУ. Чистота соединения составляла 99,9 %; идентификацию структуры проводили по данным ЯМР, молекулярная масса соединения 453,4; хорошо растворимо в воде [3]. Для исследований in vitro использовался серотонин в концентрации 0,1 нМ 100 мкМ (Sigma Aldrich, США), ацетилхолин в 0,1 мкМ (Биосинтез, Россия), гистамин 10 мкМ (Sigma Aldrich, США), атропина сульфат 10 мкМ (Sigma, США), хлоропирамина гидрохлорид 10 мкМ (Борисовский завод медицинских препаратов, Белоруссия), ранитидин 10 мкМ (Биосинтез, Россия). В качестве индукторов тремора или судорог для in vivo исследований использовались ареколин и пикро-токсин (Sigma Aldrich, США).
На первом этапе производилось изучение возможности проявления разрабатываемым соединением различных рецепторных эффектов на м од елях in vitro по методике Блаттнера с соавт. [10], с использованием установки для изолированных
органов (UGO BASILE, Италия), при постоянной оксигенации 95 % О2, температуре 37 0С и рН = 7,4. Все исследования были выполнены на крысах массой 220-250 г. Инкубация исследуемых веществ составляла 3 мин. Блокирующую активность соединения и препарата сравнения оценивали по изменению сократительного ответа изолированного органа, в ответ на введение индуктора в Д%.
Изучение 5-НТ2А-зависимой антисеротони-новой активности проводилось на препарате изолированной матки крыс-самок. Исследуемое вещество и препарат сравнения ципрогептадин вводились в эквимолярных концентрациях - 0,1, 1 и 10 мкМ. Влияние соединения РУ-31 на спазмо-генную активность ацетилхолина (М-холино-рецепторы) изучали на препарате изолированной подвздошной кишки крыс. Исследуемое вещество вводилось в концентрациях 0,01-100 мкМ.
В качестве препарата сравнения использовался М-холиноблокатор - атропина сульфат в концентрации 10 мкМ. Для изучения Н1-гистаминорецепторов использовался препарат изолированной подвздошной кишки, а для Н2-гистаминорецепторов - препарат изолированных предсердий. В качестве индуктора брали гистамин (10 мкМ), в качестве препаратов сравнения брали селективный Н1-гистаминоблокатор - хлоропира-мина гидрохлорид (10 мкМ) и селективный H2-антагонист - ранитидин (10 мкМ).
На втором этапе оценивалась возможность взаимодействия соединения РУ-31 с модуляторами нейромедиаторных систем на моделях in vivo.
Исследование взаимодействия соединения РУ-31 с М-холиномиметиком -ареколином in vivo проводилось по методу Андреевой Н.И. [7] с использованием беспородых крыс-самцов массой 220-250 г. Соединение РУ-31 вводили интра-гастрально в эффективной дозе, выявленой в предыдущих исследованиях, и равной 10 мг/кг за 1 час до введения ареколина (15 мг/кг, внутри-брюшинно), контрольная группа животных получала дистиллированную воду. При проведении теста производилась регистрация латентного периода развития тремора и его длительности.
Влияние соединения РУ-31 на ГАМК-ерги-ческую систему оценивалось в тесте взаимодействия с ГАМК-блокатором - пикротоксином in vivo по методу Ворониной Т.А. [7]. Эксперименты были выполнены на 16 мышах, разделенных на 2 группы (1 контрольная, 1 опытная) по 8 животных в каждой. За 1 час до введения пикротоксина (2,5 мг/кг, внутрибрюшинно) животным интрага-стрально вводилось соединение РУ-31 в дозе 10 мг/кг, контрольным животным вводилась дистиллированная вода. В течение 1 часа велось наблюдение за животными, при этом отмечался латентный период появления тремора, латентный период развития судорог и количество судорожных приступов.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На модели серотонин-индуцированного спазма изолированной матки крыс, для соединения РУ-31 было зарегистрировано статистически значимое ингибирование эффектов серотонина, при этом характер зависимости кривой концентрация -эффект для РУ-31 соответствовал классической кривой обратимого связывания. Рассчитанный показатель отрицательного десятичного логарифма полуэффективной концентрации серотонина в присутствии ингибитора, для соединения РУ-31 в концентрации 1 и 10 мкМ был ниже данного показателя в эквимолярных концентрациях для препарата сравнения - ципрогептадина (рис.). Это может свидетельствовать о большей 5-НТ2А-ингибирующей способности изучаемого соединения.
# ■&
5 40'
♦ серотонин - * л
РУ-31 0,1 mkM + серотонин
РУ-31 1 mkM + серотонин
РУ-31 10 mkM + серотонин /
/ / !£ рЕСэд (серотонин) = £
Г] pECso (РУ-31 0,1 мкМ
J I + серотонин) = 6,2
f pECgo (РУ-31 1 мкМ
/ + серотонин) = 5,6
L pECjo (РУ-31 10 мкМ
+ серотонин) = 5,2
1од[серотонин], М
Рис. Серотонин-опосредованное изменение сократительной активности матки крыс, в присутствии РУ-31 и ципрогептадина.
Данные в фиксированных точках представлены в виде М ± m
Также на модели in vitro была выявлена способность соединения РУ-31 блокировать спазм подвздошной кишки, индуцированный а цетилхолином. Данный эффект являлся дозо-зависимым, но при этом статистически значимо
уступал показателям препарата сравнения -атропина. В концентрациях 0,1 мкМ и 0,01 мкМ для соединения РУ-31 не было выявлено статистически значимых отличий от показателей контрольных измерений. На основании полученных данных была рассчитана величина р1С50, которая составила 5,1. Для препарата сравнения - ципро-гептадина также имеются данные о наличии умеренной М-холиноблокирующей активности [11].
Исследование гистаминоблокирующей активности показало, что в отношении Н1-рецеп-торов минимальная активная концентрация для соединения РУ-31 составила 10 мкМ, а в отношении
Гистаминергическая
Н2-рецепторов - 100 мкМ, но при этом показатели изучаемого вещества статистически значимо уступали показателям препаратов сравнения -хлоропирамина гидрохлорида и ранитидина. Для препарата сравнения - ципрогептадина, характерная Н1-гистаминблокирующая активность с величиной pKi = 10,2 [6], за счет которой при длительном применении данного препарата наблюдается ряд побочных эффектов, таких как сонливость, заторможенность и тахикардия. При этом для ципрогептадина Н2-гистамин-блокирующая активность не характерна [7], табл. 1.
Таблица 1
эсть РУ-31 в тестах in vitro
Вещество Н1-гистаминблокирующая активность Н2-гистаминблокирующая активность
концентрация, мкМ активность, Д% концентрация, мкМ активность, Д%
РУ-31 0,1 0,3 ± 0,2# 0,1 0,0 ± 0,4°
1 1,8 ± 0,5# 1 1,6 ± 0,4°
10 18,6 ± 1,3*# 10 3,6 ± 0,7°
100 27,0 ± 1,7*# 100 27,7 ± 1,6*°
Хлоропирамина гидрохлорид 10 58,0 ± 1,6* - -
Ранитидин - - 10 63,7 ± 4,2
*Изменение достоверно относительно показателей контроля (p < 0,05); #изменение достоверно относительно показателей хлоропирамина гидрохлорида 10 мкМ (p < 0,05); °изменение достоверно относительно показателей ранитидина 10 мкМ (p < 0,05).
Примечание. Данные представлены в виде M ± т. Статистическая обработка GraphPad Prism v.5.0. с использованием однофакторного дисперсионного анализа с критерием Ньюмена-Кеулса.
На втором этапе исследования, для уточнения М-холиноблокирующей активности в условиях целостного организма были проведены тесты in vivo с ареколином. Длительность ареколин-индуцированного тремора у группы, получавшей соединение РУ-31, сократилась в 1,5 раза и достоверно отличалась от показателей группы контроля (p < 0,05) (табл. 2). Полученные данные подтверждают наличие умеренной М-холино-блокирующей активности у соединения РУ-31. Далее производилось изучение взаимодействия соединения РУ-31 с ГАМК-блокатором -
пикротоксином in vivo. Установлено, что различия группы контроля и группы, получавшей соед и нение РУ-31 в следующих показателях: время развития тремора, время развития судорог и количества судорожных припадков, статистически достоверны (табл. 3).
При этом, по литературным данным, для ципрогептадина не характерно собственное влияние на ГАМКА-рецепторы, но есть данные о его серотонин-опосредованных эффектах на ГАМК-систему, через блокаду 5-НТ2-рецеп-торов [6].
Таблица 2
Влияние соединения РУ-31 на показатели теста «ареколиновый тремор» и «пикротоксиновые судороги»
«Ареколиновый тремор» «Пикротоксиновые судороги»
№ Группа время развития эффекта, с Длительность эффекта, с время развития тремора, мин время развития судорог, мин количество судорожных припадков
1 Контроль 57,50 ± 4,35 1235,00 ± 55,38 3,0 ± 0,3 10,1 ± 0,4 4,9 ± 0,6
2 РУ-31 + индуктор 57,90 ± 2,42 956,4 ± 29,5* 6,2 ± 0,4# 30,8 ± 6,6# 0,90 ± 0,23#
*Различие достоверно относительно показателей группы, получавшей ареколин, непарный ^тест Стьюдента (р < 0,05); #различие достоверно относительно показателей группы, получавшей пикротоксин, непарный ^тест Стьюдента (р < 0,0001).
Примечание. Данные представлены в виде М ± т.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В проведенной серии экспериментов, для соединения РУ-31, с ранее показанной антисеро-тониновой активностью на модели сосудистого спазма, было подтверждено наличие выраженной 5-НТ2А - опосредованной антисеротониновой акивности in vitro. При этом для данного соединения форма кривой зависимости концентрация-эффект соответствует классическому виду кривой обратимого связывания. Однако необходимо отметить, что на основании литературных данных существует взаимосвязь между серотониновыми рецепторами 2А типа и ГАМК-рецепторами, которая была показана для препарата сравнения ци-прогептадина в ряде литературных источников [6].
Таким образом, активность в отношении ГАМК-системы, наблюдаемая в тесте «пикротоксиновые
Таким образом, для соединения РУ-31 подтверждена 5-НТ2А-блокирующая активность, умеренная М-холиноблокирующая активность, ГАМК-миметическая активность, слабая Н1-гистамин-блокирующая активность и отсутствует Н2-гистаминблокирующая активность.
ЛИТЕРАТУРА
1. Блаттнер Р. Эксперименты на изолированных препаратах гладких мышц / Р. Блаттнер, Х. Классен, Х. Денерт, Х. Дёринг; пер. с англ. - М.: Мир, 1983. - 208 с.
2. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / А.Н. Миронов, Н.Д. Бунатян и др. - М.: Гриф и К, 2012. -944 с.
3. Спасов А.А., Анисимова В.А., Яковлев Д.С., Петров В.И., Минкин В.И. Средства, проявляющие свойства антагонистов серотониновых 5-НТ2А-рецепторов: пат. 2465901 РФ: A61P43, A61K31/4188; № 2011104264; заявл. 07.02.11; опубл. 10.11.12, бюл. № 31.
4. Яковлев Д.С. Конденсированные азолы - новый класс лигандов серотониновых рецепторов: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. - Волгоград, 2016.
5. Abi-Saab W.M. 5-HT2 receptor regulation of extracellular GABA levels in the prefrontal cortex // Neuropsy-chopharmacology. - 1999. - Jan; № 20 (1). - P. 92-6.
6. Haitao Wang. 5-HT2 receptors mediate functional modulation of GABA receptors and inhibitory synaptic
судороги», может быть результатом опосредованной активации интернейронов, продуцирующих ГАМК, через блокаду 5-НТ2А-рецепторов [5], в связи с чем возникает необходимость дальнейшего, более детального изучения влияния данного соединения на ГАМК-систему. Для М-холинорецепторов информация о возможной активации через серотониновые 2А рецепторы отсутствует.
При этом отсутствие гистаминергической активности, характерной для известного противо-мигренозного агента ципрогептадина, вызывающей наличие ряда центральных нейротропных побочных эффектов, таких как седация, сонливость и тахикардия, вероятно, может свидетельствовать о более безопасном токсикологическом профиле соединения РУ-31 (табл. 3).
transmissions in human iPS-derived neurons // Scientific Reports. - 2016. - Article number: 20033.
7. Guide to Pharmacology [Electronic resource]. URL: http://www.guidetopharmacology.org/GRAC/LigandDisplayF orward?tab=biology&ligandId=277.
8. Marwood J. Influence of alpha 1-adrenoceptor antagonism of ketanserin on the nature of its 5-HT2 receptor antagonism // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. - 1994. -№ 21 (12). - P. 955-961.
9. Sattigeri B.M. Effect of picrotoxin and cyproheptadine pretreatment on sodium valproate induced wet dog s h a ke behavior in rats // Int. J. Biol. Med. Res. - 2012. -№ 3 (2). - P. 1606-1608.
10. Spasov A.A. The derivatives of imidazo[1,2-a]benzimidazole as 5-ht2a receptor antagonists // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. - 2016. - Vol. 42, № 4. -P. 397-403.
11. Stanton T. Antagonism of the five cloned human muscarinic cholinergic receptors expressed in CHO-K1 cells by antidepressants and antihistaminics // Biochem. Pharmacol. - 1993. - № 45 (11). - P. 2352-2354.
12. Yakovlev D.S. Effect of 5-ht2a receptor antagonists on blood flow in the carotid vessels upon elevation of serotonin level // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2014. - № 3, Vol. 157. - P. 350-352.
REFERENCES
1. Blattner R. Eksperimenty na izolirovannyh prepara-tah gladkih myshc [Experiments on isolated smooth muscle preparations]. Moscow: Mir, 1983. 208 p.
Таблица 3
Рецепторный профиль соединения РУ-31
Вид активности Наличие активности у соединения РУ-31
5-НТ2А-блокирующая активность +++
М-холиноблокирующая ++
Н1-гистаминоблокирующая +
Н2-гистаминоблокирующая -
ГАМК-миметическая +
Примечание. - - отсутствие статистически значимой активности; + - слабая активность, значительно уступающая показателям препарата сравнения; ++ - умеренная активность, уступающая препарату сравнения в эквимолярных концентрациях; +++ -выраженная активность, не уступающая препаратам сравнения.
2. Rukovodstvo po provedeniyu doklinicheskih issle-dovanij lekarstvennyh sredstv. CHast' pervaya [Guidelines for conducting preclinical studies of drugs. Part One]. In A.N. Mironov, N.D. Bunatyan (ed.). Moscow: Grif i K, 2012. 944 p.
3. Spasov A.A., Anisimova V.A., YAkovlev D.S., Petrov V.I., Minkin V.I. Sredstva, proyavlyayushchie svojst-va antagonistov serotoninovyh 5-HT2A-receptorov [Agents showing the properties of serotonin 5-HT2A receptor antagonists]: pat. 2465901 RF: A61P43, A61K31/4188; № 2011104264; zayavl. 07.02.11; opubl. 10.11.12, byul. № 31.
4. YAkovlev D.S. Kondensirovannye azoly - novyj klass ligandov serotoninovyh receptorov. Avtoref. dis. dokt. med. nauk [Condensed azoles - a new class of serotonin receptor ligands. Dr. Sci. (Medicine) Thesis]. Volgograd, 2016.
5. Abi-Saab W.M. 5-HT2 receptor regulation of extracellular GABA levels in the prefrontal cortex. Neuropsycho-pharmacology, 1999, Jan; no.20 (1), pp. 92-6.
6. Haitao Wang. 5-HT2 receptors mediate functional modulation of GABA receptors and inhibitory synaptic transmissions in human iPS-derived neurons. Scientific Reports, 2016, Article number: 20033.
7. Guide to Pharmacology [Electronic resource]. URL: http://www.guidetopharmacology.org/GRAC/LigandDisplayF orward?tab=biology&ligandId=277.
8. Marwood J. Influence of alpha 1-adrenoceptor antagonism of ketanserin on the nature of its 5-HT2 receptor a ntagonism. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 1994, no 21 (12), pp. 955-961.
9. Sattigeri B.M. Effect of picrotoxin and cyproheptadine pretreatment on sodium valproate induced wet dog s h a ke behavior in rats. Int. J. Biol. Med. Res, 2012, no. 3 (2), pp. 1606-1608.
10. Spasov A.A. The derivatives of imidazo[1,2-a]benzimidazole as 5-ht2a receptor antagonists. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2016, Vol. 42, no. 4, pp. 397-403.
11. Stanton T. Antagonism of the five cloned human muscarinic cholinergic receptors expressed in CHO-K1 cells by antidepressants and antihistamines. Biochem. Pharmacol, 1993, no. 45 (11), pp. 2352-2354.
12. Yakovlev D.S. Effect of 5-ht2a receptor antagonists on blood flow in the carotid vessels upon elevation of serotonin level. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2014, no. 3, Vol. 157, pp. 350-352.
Контактная информация Агацарская Яна Владимировна - ассистент кафедры фармакологии и биоинформатики, Волгоградский государственный медицинский университет, e-mail: [email protected]
