CC BY
99
Экспериментальная неврология
J
Нейропротективный эффект Актовегина и цитиколина in vitro: влияние на внутриклеточные деструктивные процессы, индуцированные ишемией
Л.Г. Хаспеков, Е.В. Стельмашук, Н.К. Исаев, Е.Е. Генрихе,
О.П. Александрова, А.М. Овезов, М.А. Лобов, А.В. Князев
Исследованы нейропротекторные свойства Актовегина и цитиколина в культуре клеток, полученных из мозжечка 7-дневных крыс и подвергнутых цитотоксическому действию глутамата. Деструкции зернистых нейронов мозжечка, вызываемой глутаматом (250 мкМ), препятствовал Актовегин в концентрации 1 мг/мл. Цитиколин оказывал выраженный нейропротекторный эффект в концентрациях 1, 10 и 25 мг/мл. Полученные данные свидетельствуют о возможной перспективе практического использования указанных лекарственных средств в клинике неврологических заболеваний (ишемический инсульт, хорея Гентингтона, болезнь Паркинсона и др.), одним из патогенетических факторов которых является нейроцитотоксическое действие глутамата.
Ключевые слова: ишемия головного мозга, нейродегенерация, глутаматная эксайтотоксичность, Актовегин, цитиколин, экспериментальная нейропротекция.
В последние годы отмечается увеличение частоты нарушений мозгового кровообращения, являющихся одной из наиболее значимых причин смертности и инвалидизации трудоспособного населения [1]. В связи с этим важной задачей экспериментальной и клинической неврологии является поиск оптимальных фармакологических подходов к лечению острой церебральной ишемии. При этом усилия многих исследователей сосредоточены на поиске соединений, влияющих на внутриклеточные деструктивные процессы, индуцированные ишемией. Большое разнообразие аген-
Леонид Георгиевич Хаспеков - докт. биол. наук, зав. лабораторией экспериментальной нейроцитологии отдела исследований мозга ФГБУ “Научный центр неврологии” (НЦН) РАМН, Москва.
Елена Викторовна Стельмашук - докт. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории экспериментальной нейроцитологии отдела исследований мозга ФГБУ “НЦН” РАМН, Москва.
Николай Константинович Исаев - докт. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории экспериментальной нейроцитологии отдела исследований мозга ФГБУ “НЦН” РАМН, Москва.
Елизавета Евгеньевна Генрихс - канд. биол. наук, науч. сотр. лаборатории экспериментальной нейроцитологии отдела исследований мозга ФГБУ “НЦН” РАМН, Москва. Ольга Петровна Александрова - канд. биол. наук, науч. сотр. лаборатории экспериментальной нейроцитологии отдела исследований мозга ФГБУ “НЦН” РАМН, Москва. Алексей Мурадович Овезов - докт. мед. наук, зав. кафедрой анестезиологии и реаниматологии факультета усовершенствования врачей (ФУВ) ГБУЗ МО “МОНИКИ” им. М.Ф. Владимирского.
Михаил Александрович Лобов - профессор, зав. отделом детской неврологии ФУВ ГБУЗ МО “МОНИКИ” им. М.Ф. Владимирского.
Александр Валерьевич Князев - канд. мед. наук, консультант.
тов, которые потенциально могут способствовать медикаментозной нейропротекции при остром нарушении мозгового кровообращения, определяется обилием развивающихся при данном состоянии патохимических изменений, к которым относятся нарушение внутриклеточного гомеостаза кальция; усиление продукции свободных радикалов, оксида азота и эйкозаноидов, образующихся и накапливающихся в зоне ишемии вследствие активации перекисного окисления липидов; накопление цитокинов, различных нейротрансмиттеров и медиаторов воспаления [1,2].
Одним из ключевых факторов развития ишемического повреждения головного мозга является глутаматная токсичность. Учитывая неоднозначность и многоплановость патобиохимических реакций при ишемии мозга, невозможно создать универсальное нейропротекторное средство, однако есть большая вероятность, что полный спектр защитного действия ряда препаратов, применяемых в настоящее время в неврологической клинике, полностью не раскрыт. Обнаружение новых защитных свойств уже известных фармакологических агентов позволило бы использовать их с большей эффективностью. В настоящей работе мы исследовали возможность снижения токсического действия глутамата при помощи таких препаратов, как Актовегин и цитиколин. Ранее были продемонстрированы положительные результаты использования Актовегина при неврологических осложнениях сахарного диабета, а также его благоприятное влияние у больных с хроническими цереброваскулярными заболеваниями [3-6]. Цитико-лин оказывает положительное воздействие при синдроме дефицита внимания и гиперактивности, а также при нарушениях памяти, вызванных травмой головного мозга [7, 8].
34^
Нервные болезни 3*2014 http://atm-press.ru
Экспериментальная неврология
V
Глутамат, мкМ
Рис. 1. Влияние глутамата на выживаемость культур (данные подсчета морфологически неизмененных нейронов на фиксированных окрашенных препаратах). К - контроль.
Материал и методы
В работе использовались 7-8-суточные культуры зернистых нейронов мозжечка 7-дневных крыс, полученные методом ферментно-механической диссоциации по общепринятой методике. Крыс подвергали эфирному наркозу летальной дозой, после чего 5 мин стерилизовали 70% спиртом. Затем быстро вскрывали череп, извлекали мозжечок и помещали его в пластиковую чашку Петри, заполненную фосфатным буфером, лишенным ионов кальция и магния. Фрагменты ткани инкубировали 15 мин при 37°С в фосфатном буфере, содержащем 0,05% трипсина, 0,02% ЭДТА и 0,8% глюкозы. После инкубации ткань промывали в двух сменах фосфатного буфера и один раз в питательной среде для культивирования, далее подвергали механической диссоциации в питательной среде, в состав которой входило 90% минимальной среды Игла, 10% эмбриональной теля-
чьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 25 мМ KCl и 10 мМ буфера HEPES, pH 7,2-7,4. Суспензию клеток центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин, супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в питательной среде. Культивирование производили в 48- или 96-луночных пластиковых планшетах, покрытых полиэтиленимином или полилизином. В каждую ячейку планшета добавляли по 0,5 или 0,1 мл суспензии клеток соответственно. Культивирование проводили 7-8 сут в СО2-инкубаторе, заполненном газовой смесью (95% воздуха + 5% СО2), при температуре 35,5°С и относительной влажности 98%. К этому сроку культивированные зернистые нейроны достигают своей морфологической и нейрохимической зрелости. Состояние культур контролировали ежедневно и на каждом этапе эксперимента путем визуального просмотра в инвертированном микроскопе в фазовом контрасте. Глутамат (L-Glutamic acid monosodium salt 99-100%, Sigma-G1626, США), Актовегин 0,1-4 мг/мл (“Никомед, Австрия ГмбХ”, раствор для внутриартериального/внутри-венного/внутримышечного введения, серия № 10869882) и цитиколин 0,1-25 мг/мл (“Феррер Интернасьональ, С.А.”, Испания, раствор для внутривенного и внутримышечного введения, 1000 мг/4 мл 490 мМ, серия № E003R2) добавляли в среду культивирования на 7-8-е сутки in vitro на 24 ч.
Количественную оценку выживаемости клеток производили с помощью стандартной методики - прямого подсчета живых нейронов.
Для каждого вещества было выполнено как минимум три эксперимента, при этом на каждую точку брали по 3 культуры, в каждой из которых фотографировали и просчитывали по 5 последовательных полей зрения (как минимум 45 полей зрения из 9 культур в трех независимых эксперимен-
(а)
(в)
(г)
100 -
Л
&
о
2
О)
га
m
s
*
л
Ш
75 -50 -
25 -0 -
(д)
О 0,1
Актовегин, мг/мл
1,0
Рис. 2. Влияние Актовегина на выживаемость культур при глутаматной токсичности. Фиксированные культуры, окрашенные трипановым синим; стрелками указаны живые зернистые нейроны мозжечка. Масштаб 15 мкм. а - контроль; б-г - глутамат (250 мкМ, 24 ч): б - без Актовегина, в, г - с добавлением 0,1 и 1,0 мг/мл Актовегина соответственно; д - данные количественной оценки выживаемости нейронов (подсчет живых нейронов). * р < 0,01 по сравнению с действием глутамата без добавок.
Нервные болезни 3*2014 http://atm-press.ru
35
Экспериментальная неврология
J
Рис. 3. Данные количественной обработки результатов эксперимента с цитиколином: препарат защищает культивированные зернистые нейроны мозжечка от токсического действия глутамата. * р < 0,01 по сравнению с действием глутамата без добавок (красный столбец).
тах). Количество нейронов с неизмененной морфологией в контрольных культурах принимали за 100% выживаемости. Всего было просчитано свыше 250 тыс. нейронов. Для статистического анализа использовали тест ANOVA с посттестом Бонферрони или Даннетта, при уровне значимости p < 0,05. Результаты выражали как среднее ± SEM.
Работа проводилась в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г. и требованиями, сформулированными в директивах Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС об использовании животных для экспериментальных исследований.
Результаты исследования
Как видно на рис. 1, глутамат оказывал сильное токсическое действие в интервале концентраций 100-500 мкМ, которые использовали в дальнейших исследованиях.
Выполнено 7 экспериментов по изучению влияния Ак-товегина (0,1-1,0 мг/мл) на глутаматную токсичность в культурах зернистых нейронов мозжечка. Защитный эффект Актовегина (снижение гибели нейронов на 11%) проявлялся при концентрации 1,0 мг/мл и носил достоверный (рис. 2, для каждой точки n = 60, где n - количество просчитанных полей зрения, p < 0,01), но нестабильный характер, так как не во всех попытках Актовегин защищал нейроны от глутаматной токсичности. В концентрации 0,1 мг/мл Акто-вегин не влиял на выживаемость зернистых нейронов при глутаматной токсичности.
В контроле (без глутамата) Актовегин в концентрации 0,1-1,0 мг/мл никак не влиял на выживаемость нейрональных культур.
Со вторым исследуемым препаратом - цитиколином - было выполнено 4 эксперимента по его влиянию на глутаматную токсичность в культурах зернистых нейронов мозжечка. Достоверный защитный эффект (увеличение
выживаемости клеток на 11-40%) проявлялся при концентрациях 1-25 мг/мл (рис. 3, для каждой точки n = 60, где n -количество просчитанных полей зрения, p < 0,01).
Следует отметить, что без предшествующего патологического действия глутамата сам цитиколин при его изолированном применении в максимальных (субтоксических) дозах мог в небольшой степени снижать выживаемость культур (в среднем от 7 до 20%).
Заключение
В многочисленных исследованиях установлено, что одним из важных патогенетических факторов повреждения нейронов при целом ряде неврологических заболеваний является гиперстимуляция глутаматных рецепторов, связанная с внеклеточным накоплением глутамата в результате нарушения энергозависимого обратного захвата глутамата нервными и глиальными клетками, а также активации митохондриальной глутаминазы. Поэтому в последние годы большое внимание уделялось поиску биологически активных соединений, влияющих на деструктивные процессы, связанные с токсическим действием глутамата. Однако создание новых препаратов сопряжено с большими затратами материальных и временных ресурсов. Подобные затраты можно значительно снизить, если осуществлять поиск таких протекторов среди лекарственных средств, которые уже применяются в клинической практике и потенциал которых может оставаться не до конца раскрытым.
Используя эту стратегию, мы выявили, что такие известные препараты, как Актовегин и цитиколин, достоверно оказывают дозозависимый защитный нейропротектив-ный эффект на модели глутаматной эксайтотоксичности. Полученные данные могут способствовать уточнению дозировок, схем лечения и расширению области применения обоих изученных соединений - их использованию не только при церебральной ишемии, но и при других заболеваниях, в развитии которых важную роль играют эксайтотоксиче-ские нейродеструктивные механизмы. В их числе - хорея Гентингтона, болезни Паркинсона и Альцгеймера, некоторые формы болезни двигательного нейрона. Вызывает интерес применение этих соединений и при заболеваниях центральной нервной системы, характеризующихся нарушением синтеза и обратного захвата глутамата клетками нейроглии, в том числе при травматических поражениях вещества головного мозга.
Список литературы
1. Инсульт: диагностика, лечение, профилактика / Под ред. З.А. Суслиной, М.А. Пирадова. М., 2008.
2. Очерки ангионеврологии / Под ред. З.А. Суслиной. М., 2005.
3. Строков И.А. и др. // Нервные болезни. 2012. № 3. С. 21.
4. Танашян М.М. и др. // Нервные болезни. 2010. № 2. С. 7.
5. Танашян М.М. и др. // Нервные болезни. 2014. № 2. С. 20.
6. Ziegler D. et al. // Diabetes Care. 2009. V 32. P 1479.
7. Jacotte-Simancas A. et al. // J. Neurotrauma. 2014. Aug 21. [Epub ahead of print],
8. SilveriM.M. etal.//NMRBiomed. 2008. V. 21. P. 1066. ,
36
Нервные болезни 3*2014 http://atm-press.ru
