CC BY
55© Коллектив авторов, 2004
НЕЙРОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА
центрального действия оригинального бронхолитика инсановина
Е.М.АСАДОВА*, Е.М.АГАЕВ*, А.А. УМНЯШКИН*, М.М. ГАНИЕВ**, П.М.КЛОДТ***,
В.Б. НАРКЕВИЧ***, В.С. КУДРИН***
*НИИ легочных заболеваний МЗ Азербайджана, Баку; **Азербайджанский медицинский университет, Баку;
***НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, Москва
Асадова Е.М., Агаев Е.М., Умняшкин А.А., Ганиев М.М., Клодт П.М., Наркевич В.Б., Кудрин В.С. Нейрохимическое изучение механизма центрального действия оригинального бронхолитика инсановина // Психофармакол. и биол. наркол. 2004. Т.4. № 1. С. 570-574. НИИ легочных заболеваний МЗ Азербайджана, Баку; Кафедра фармакологии Азербайджанского медицинского университета, Баку; Институт фармакологии им . В.В. Закусова РАМН, 125315, Москва, Балтийская ул., 8, тел. (095) 155-4753.
Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии изучено влияние бронхолитического препарата инсановина на содержание моноаминов и их метаболитов в коре и подкорковых структурах (стриатум, прилежащее ядро, гипоталамус и гиппокамп) головного мозга крыс. Установлено, что инса-новин в диапазоне доз 10-100 мг/ кг существенно влияет на нейрохимические параметры моноами-нергической системы мозга. Отме-
чено достоверное увеличение содержания норадреналина в гиппо-кампе и стриатуме. Выявлено модулирование концентрации дофамина и его метаболитов на фоне введения как низкой (10 мг/кг), так и высокой (100 мг/кг) доз инсановина. На основании полученных данных выдвинуто предположение о том, что инсановин, по-видимому, обладает некоторой селективностью в отношении мезолимбической до-фаминергической системы мозга.
I
Ключевые слова: инсановин, бронхолитики, норадреналин, дофамин, серотонин, стриа-тум, прилежащее ядро, гипоталамус, гиппокамп.
Asadova E.M., Agaev E.M., Umn-yashkin A.A., Klodt P.M., Narkevich V.B., Kudrin V.S. Neurochemical study of the central mechanisms of action of the original broncholytic Insa-novin // Psychopharmacol. Biol. Nar-col. 2004. Vol. 4. № 1. P. 570-574. Institute of Pulmonary Diseases, Baku, Azerbaijan; Azerbaijan Medical University, Baku; Institute of Pharmacol-
ogy, Russian Academy of Medical Sciences, 125315, Moscow, Russia.
The effects of Insanovin, a novel broncholytic drug, on the monoamine's and its metabolites content in the frontal cortex as well as in striatum, nucleus accumbens, hypothalamus and hippocampus of the rat brain were studied using HPLC technique. The significant modulation of monoaminergic neuro-chemical parameters was found after treatment with Insanovin at the dose range 10-100 mg/kg. The level of norepinephrine was found to be increased both in hippocampus and stria-tum. The modulation of the content of dopamine and its metabolites also was demonstrated after injection of low (10 mg/kg) as well as high (100 mg/kg) doses of Insanovin. Basing on the data obtained it is supposed that Insanovin reveals some selectivity to mesolimbic dopaminergic brain systems.
I
Key words: insanovin, bron-cholytics, norepinephrine, dopa-mine, serotonin, frontal cortex, striatum, nucleus accumbens, hypothalamus, hippocampus.
КОМБИНИРОВАННЫЙ препарат инсановин находит широкое применение в качестве эффективного бронхолитического средства при различных видах легочной патологии с бронхообст-руктивной симптоматикой [1, 2]. Предполагается, что в механизме бронхолитического эффекта инсановина могут принимать участие моноами-нергические системы мозга, в частности, норадре-нергическая (НА) [3]. Несмотря на то, что существуют отдельные работы, посвященные изучению нейротропных свойств инсановина [1, 2], в целом
нейрохимический профиль данного соединения остается малоизученным. В частности, отсутствуют сведения о влиянии препарата на биосинтез, кругооборот и метаболизм моноаминов и их метаболитов в различных структурах головного мозга. В связи с этим, целью данной работы было изучение возможного влияния различных доз инсановина на содержание норадреналина (НА), дофамина (ДА), серотонина (5-ОТ), а также 3,4-диокси-фенилуксусной (ДОФУК), гомованилиновой (ГВК), 5-оксииндолуксусной кислот (5-ОИУК) в
ГПфивн-J
570
коре и подкорковых структурах (стриатум, прилежащее ядро, гипоталамус и гиппокамп) головного мозга крыс с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии.
МЕТОДИКА
Опыты проводились на 24 белых крысах-самцах Вистар весом 180-210 г (питомник «Столбовая», Московская обл.), содержавшихся на стандартном лабораторном рационе. Инсановин (Azerfarm, Азербайджан), в состав одной таблетки которого входят теофиллин (150 мг), эфедрина гидрохлорид (25мг), преднизолон (1 мг), и фосфат хлорохина (40 мг), вводился внутрибрюшин-но в виде водной суспензии за 45 мин до начала эксперимента. Во избежание влияния суточных биоритмов на скорость биосинтеза и метаболизма нейромедиаторов, эксперименты проводили между 10 и 12 часами дня [4]. Структуры мозга (кора, гипоталамус, гиппокамп, стриатум и прилежащее ядро) извлекались на льду и замораживались в жидком азоте. Перед экспериментами по определению содержания нейротрансмиттеров пробы размельчали в ручном гомогенизаторе в 20 объемах 0,1 н НС1О4 с добавлением диоксибензилами-на (0,5 нмоль/мл) в качестве внутреннего стандарта. Пробы центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин. Содержание моноаминов и их метаболитов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД) на хроматографе LC-304T (BAS, West Lafayette, США) с инжектором Rheodyne 7125, оснащенным петлей на 20 мкл для нанесения образцов. Надосадочную жидкость в количестве 20 мкл наносили на термоста-тируемую (25 С) аналитическую колонку Ultraspherе C18. НА, ДА, 5-ОТ, ДОФУК, ГВК и 5-ОИУК разделяли с использованием в качестве подвижной фазы 0,1 М цитратно-фосфатного буфера, содержащего 0,3 мМ октансульфоната натрия, 0,1 мМ ЭДТА и 8% ацетонитрила (рН 3,2). Определение моноаминов и их метаболитов осуществляли на стеклоуглеродном электроде при потенциале +0,85 против Ag/AgCI электрода сравнения. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,7 мл/мин. Стандарты готовили в 0,1 Н НС1О4 в концентрации 100 мкг/мл с добавлением 0,2 мМ метабисульфита натрия в качестве консерванта. Рабочие стандарты готовили ежедневно. Все использованные для анализа реактивы были высокой степени чистоты. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием критерия Стьюдента и дисперсий отношений Фишера [5].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты опытов представлены в таблицах 1 и 2. Как видно из полученных данных, содержание НА в коре головного мозга оказалось достоверно сниженным через 45 мин после введения ин-сановина в дозе 10 мг/кг. Следует отметить, что в гипоталамусе и гиппокампе — структурах, наиболее богатых норадренергическими терминалями [6, 7], отмечалась лишь статистически недостоверная тенденция к повышению содержания НА (на 7 и 17% соответственно). Повышение дозы препарата до 50 мг/кг сопровождалось достоверным увеличением концентрации нейропередатчи-ка в стриатуме (до 17,8%) и в гиппокампе (до 40%), что хорошо согласуется с результатами наших прежних экспериментов [3], свидетельствующих о вовлечении пре- и постсинаптических НА рецепторов в механизм действия инсановина. Следует отметить, что содержание другого нейроме-диатора- ДА, заметно повышалось в коре головного мозга в случае применения препарата в дозах, оказывающих преимущественно постсинаптичес-кое действие (50 мг/кг и 100 мг/кг) и существенно не изменялось в таких дофаминсодержащих структурах, как стриатум и прилежащее ядро. В последнем наблюдалось достоверное снижение содержания этого нейротрансмиттера при введении малой дозы инсановина, что может свидетельствовать о вовлечении пресинаптического звена в механизм действия препарата.
Содержание основных метаболитов ДА- ДОФУК и ГВК оказалось достоверно сниженным как в стриатуме, так и в прилежащем ядре вне зависимости от использованных доз бронхолитика. Соотношения ДОФУК/ДА и ГВК/ДА — основные показатели, характеризующие изменение кругооборота ДА, были достоверно сниженными в обоих структурах при использовании инсановина в дозе 100 мг/кг. Ни в одной из изученных структурах головного мозга не отмечалось усиления кругооборота серотонина (соотношение 5-ОИУК/5-ОТ). Представляет интерес значимое повышение содержания метаболита серотонина 5-ОИУК в коре головного мозга, наблюдавшееся в случае введения инсановина в дозе 10 мг/кг. Эти данные подтверждают ранее высказанное предположение [2] о возможном вовлечении серотонинергических механизмов в реализацию поведенческих эффектов ин-сановина и свидетельствуют об участии 5-ОТ в патофизиологических механизмах формирования бронхолегочной патологии.
При обсуждении полученных результатов следует отметить, что данные этой серии эксперимен-
^2004 г. № VJ
571
Таблица 1
Влияние инсановина на содержание моноаминов и их метаболитов в коре, гипоталамусе и гиппокампе мозга крыс
Кора
Доза, мг/ кг НА ДА 5-ОТ ДОФУК ГВК 5-ОИУК ДОФУК / ДА ГВК/ДА 5-0ИУК/ 5-ОТ
Контроль 100,0 ± ± 2,0 100,0 ± ± 4,4 100,0 ± ± 3,6 100,0 ± ± 20,2 100,0 ± ± 13,4 100,0 ± ± 4,1 100,0 ± ± 18,1 100,0 ± ± 11,7 100,0 ± ± 3,9
10 95,4 ± ± 3,4* 123,9 ± ± 14,3** 99,2 ± ± 5,2 102,7 ± ± 16,7 159,1 ± ± 10,9** 113,4 ± ± 5,4* 95,4 ± ± 21,4 145,4 ± ± 26,0 115,0 ± ± 7,0
50 94,9 ± ± 6,4 113,1 ± ± 5,6* 92,4 ± ± 3,9 101,5 ± ± 23,7 120,9 ± ± 18,7 102,1 ± ± 6,8 99,9 ± ± 29,6 109,9 ± ± 17,6 110,8 ± ± 7,9
100 92,7 ± ± 8,6 140,0 ± ± 17,0** 101,1 ± ± 6,1 62,7 ± ± 16,6 126,7 ± ± 17,1 111,5 ± ± 9,5 47,5 ± ± 13,8** 94,0 ± ± 13,8 109,3 ± ± 5,1
Гипоталамус
Доза, мг/ кг НА ДА 5-ОТ ДОФУК ГВК 5-0ИУК ДОФУК/ДА ГВК/ДА 5-0ИУК/ 5-ОТ
Контроль 100,0 ± ± 7,5 100,0 ± ± 8,4 100,0 ± ± 8,9 100,0 ± ± 11,1 — 100,0 ± ± 5,3 100,0 ± ± 7,1 — 100,0 ± ± 4,4
10 106,8 ± ± 4,0 105,0 ± ± 7,3 109,2 ± ± 6,7 149,3 ± ± 47,5 — 107,5 ± ± 3,9 135,7 ± ± 36,0 — 97,7 ± ± 4,7
50 103,2 ± ± 3,3 116,0 ± ± 10,5 91,5 ± ± 6,7 134,9 ± ± 21,4 — 96,9 ± ± 5,5 117,5 ± ± 18,3 — 105,0 ± ± 5,3
100 99,1 ± ± 4,7 94,3 ± ± 5,0 94,8 ± ± 3,4 75,1 ± ± 19,4 — 104,2 ± ± 5,7 78,1 ± ± 18,8 — 107,4 ± ± 3,4
Гиппокамп
Доза, мг/ кг НА ДА 5-ОТ ДОФУК ГВК 5-ОИУК ДОФУК / ДА ГВК/ДА 5-0ИУК/ 5-ОТ
Контроль 100,0 ± ± 7,5 100,0 ± ± 8,7 100,0 ± ± 8,7 — — 100,0 ± ± 9,6 — — 100,0 ± ± 17,4
10 117,0 ± ± 14,5 87,3 ± ± 26,8 97,2 ± ± 8,5 — — 97,2 ± ± 8,5 — — 88,9 ± ± 4,0
50 139,8 ± ± 16,3 137,0 ± ± 20,8 92,1 ± ± 7,5 — — 92,1 ± ± 7,5 — — 88,0 ± ± 6,4
100 125,0 ± ± 15,4 84,7 ± ± 19,5 110,7 ± ± 7,1 — — 110,7 ± ± 7,1 — — 84,1 ± ± 8,9
Примечание: Приведены средние значения с контролем ^-критерий Стьюдента). и стандартные ошибки (М ± m). * — р < 0,05; ** — р < 0,001 в сравнении
тов подтверждают наши предположения о том, что в механизме действия инсановина определенную роль играют моноаминергические системы мозга. Об этом свидетельствуют наблюдаемые изменения параметров биосинтеза, кругооборота и метаболизма нейромедиаторов как норадренергической, так и дофаминергической систем мозга. Необходимо подчеркнуть, что роли последней в механизме осуществления центрального эффекта инсановина до сих пор не придавалось принципиально важного значения. Вовлеченность дофаминергической системы в реализацию эффектов инсановина подтверждается изменением содержания ДА в изученных структурах мозга, особенно в тех, где сосредоточены терминали дофаминергических нейронов- в стриатуме и прилежащем ядре [7, 8]. Подобные сдвиги нейрохимических параметров могут объясняться специфическими эффектами эфедрина, входящего в состав инсановина. Так, методом внутри-мозгового микродиализа показано, что при введе-
ГпФвГ^
572
Таблица 2
Влияние инсановина на содержание моноаминов и их метаболитов в стриатуме и прилежащем ядре мозга крыс
Стриатум
Доза, мг/ кг НА ДА 5-ОТ ДОФУК ГВК 5-ОИУК ДОФУК / ДА ГВК/ДА 5- ОИУК / 5-ОТ
Контроль 100,0 ± ± 4,0 100,0 ± ± 8,0 100,0 ± ± 4,5 100,0 ± ± 8,4 100,0 ± ± 5,6 100,0 ± ± 5,7 100,0 ± ± 11,4 100,0 ± ± 7,3 100,0 ± ± 4,6
10 87,2 ± ± 6,8 95,5 ± ± 3,7 94,1 ± ± 2,5 96,1 ± ± 7,4 91,6 ± ± 5,6 105,9 ± ± 7,3 95,8 ± ± 6,6 94,6 ± ± 6,6 111,7 ± ± 5,6
50 124,6 ± ± 14,8* 105,4 ± ± 10,3 104,5 ± ± 8,2 91,0 ± ± 8,0 92,2 ± ± 4,8 101,0 ± ± 8,0 83,5 ± ± 4,1* 88,2 ± ± 5,1* 97,2 ± ± 5,9
100 94,9 ± ± 7,6 98,8 ± ± 5,4 93,2 ± ± 3,6 78,3 ± ± 8,3* 80,5 ± ± 5,0* 115,2 ± ± 12,9 75,1 ± ± 5,8** 81,5 ± ± 8,0* 123,5 ± ± 14,6
Прилежащее ядро
Доза, мг/ кг НА ДА 5-ОТ ДОФУК ГВК 5-ОИУК ДОФУК/ДА ГВК/ДА 5-0ИУК/ 5-ОТ
Конт -роль 100,0 ± ± 22,2 100,0 ± ± 4,2 100,0 ± ± 12,8 100,0 ± ± 8,8 100,0 ± ± 7,2 100,0 ± ± 10,6 100,0 ± ± 4,8 100,0 ± ± 6,5 100,0 ± ± 5,1
10 92,6 ± ± 18,2 82,5 ± ± 5,3** 83,7 ± ± 9,7 81,6 ± ± 5,3 80,6 ± ± 6,8* 93,9 ± ± 9,2 109,3 ± ± 4,8 104,9 ± ± 3,0 110,8 ± ± 4,1
50 120,7 ± ± 24,0 96,4 ± ± 7,4 92,5 ± ± 8,7 72,1 ± ± 7,4* 79,1 ± ± 13,4 86,3 ± ± 5,7* 82,1 ± ± 5,5** 88,0 ± ± 11,5 93,8 ± ± 6,3
100 127,3 ± ± 30,0 106,3 ± ± 4,0 111,4 ± ± 6,3 72,1 ± ± 4,3* 76,1 ± ± 5,7** 115,2 ± ± 7,5 74,1 ± ± 2,4** 78,4 ± ± 7,0 101,0 ± ± 3,1
Примечание: Приведены средние значения и стандартные ошибки (М ± т). * — с контролем (^критерий Стьюдента). р < 0,05; ** — р < 0,001 в сравнении
нии эфедрина в диапазоне доз 5-20 мг/кг внеклеточное содержание ДА в прилежащем ядре увеличивалось до 400%, в то время как уровень ДОФУК и ГВК снижался. Эти данные хорошо согласуются с полученными нами результатами, поскольку увеличение внеклеточной концентрации ДА может быть следствием увеличенного высвобождения ней-ромедиатора, приводящего, в конечном итоге, к снижению содержания ДА в нейронах [10]. Выраженные изменения содержания ДА и его метаболитов в указанных структурах дают основание предположить, что инсановин, по-видимому, обладает некоторой селективностью в отношении дофами-нергических систем мозга, что может проявляться в модулирующем эффекте препарата на высвобождение нейропередатчика из пресинаптических окончаний ДА нейронов. Такой механизм действия характерен для ряда нейротропных препаратов, предпочтительно влияющих на пресинаптические ауторегуляторные звенья катехоламинергической передачи [8, 9]. Наши предположения о механизме действия инсановина на центральные дофаминер-гические системы мозга хорошо согласуются с данными нейрофармакологических исследований, проведенными нами ранее [1]. Согласно последним, введение бронхолитика в высоких дозах (100-200 мг/кг и выше), при котором наблюдалась выраженная стимуляция двигательной активности животных, не вызывала, в то же время, возникновения стереотипии и других видов аномального поведения, связанных с усиленным высвобождением ней-ропередатчика из окончаний нигростриатных до-фаминергических нейронов. С другой стороны, полученные в данном исследовании результаты расширяют представления о механизме действия инсановина, поскольку свидетельствуют о существенном вкладе, наряду с норадренергической, также и дофаминергических систем мозга — нигро-стриатной и мезолимбической. В связи с этим, логично предположить, что препараты, модулирующие центральную дофаминергическую нейропере-дачу, могут оказаться эффективными в терапии ряда бронхообструктивных патологий. Таким образом, результаты наших экспериментов позволяют придти к заключению, что в реализации некоторых центральных эффектов инсано-вина принимают участие катехоламинергические системы мозга, прежде всего, дофаминергические.
^2004 г. № Г^
573
ЛИТЕРАТУРА
1. Инсанов А.Б., Гасанов Н.К. // Современные методы лечения бронхиальной астмы. Баку: Азернешр, 1999. С.83-92.
2. Инсанов А.Б., Гасанов Н.К. Инсановин: Новое в фармакотерапии бронхиальной астмы. Баку: Азернешр, 2001. 52 с.
3. Агаев EM, Асадова E.M., Алескерова М.В., и др. // Азерб. мед. журн. 2002. № 2. С. 12-15.
4. Warren P.F., Peat MA, Gibb J.W. The effects of single dose of amphetamine and iprindole on the serotoninergic system of the rat brain // Neuropharmacol. 1984. Vol. 23. P. 803-806.
5. Гублер Е.В. // Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. М.: Медицина, 1978. С.68-91.
6. Iversen S.D., Koob G.F. Behavioral implications of dopaminegic neurons in the mesolimbic systems // Nonstriatal dopaminergic neurons. Advances in
biochemical psychopharmacology / Ed. by E. Costa, G.L. Gessa. N.Y.: Raven, 1977. P. 209-214.
7. Ungerstedt U. Stereotaxic mapping of the monoamine pathway in the rat brain // Acta Physiol. Scand. 1971. Vol. 367. Suppl. 1. P. 49-68.
8. Раевский К.С. Дофаминовые рецепторы мозга: структура, функциональная роль, модуляция пси-хоторопными веществами // Вопр. мед. химии. 1997. Т. 43. Вып. 6. С. 553-565.
9. Sotnikova T., Gainetdinov R., Grekhova T.,
Rayevsky K. Effects of intrastriatal infusion of D2 and D3 dopamine receptor preferring antagonists on dopamine release in rat dorsal striatum (in vivo microdialysis study) // Pharmacol. Res. 2001. Vol. 43. P.283-289.
10. Wellman P.J., Miller D.K., Livermore C.L., et al. Effects of (-) ephedrine on locomotion, feeding and nucleus accumbens dopamine in rats // Psychopharmacol. (Berl.). 1998. Vol. 135. P. 133-140.
ГПфИВН-J
574
