CC BY
262020 т 10 № 3 крымскии журнал экспериментальной и клиническои медицины
УДК 616.24-002.5 DOI: 10.37279/2224-6444-2020-10-3-16-25
НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ ВТОРИЧНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА
Голубинская Е. П., Филоненко Т. Г., Ермола Ю. А., Геращенко А. В., Кубышкин А. В., Кальфа М. А., Крамарь Т. В.
Кафедра патологической анатомии с секционным курсом, Медицинская академия имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского», 295051, бульвар Ленина 5/7, Симферополь, Россия
Для корреспонденции: Голубинская Елена Петровна, кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник Центральной научно-исследовательской лаборатории, Медицинская академия имени С. И. Георгиевского, ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского», е-mail: [email protected]
For correspondence: Golubinskaya Elena P., PhD, Leading Researcher at the Central Research Laboratory, Medical Academy named after S.I. Georgievsky of Vernadsky CFU, е-mail: [email protected]
Information about authors:
Elena P. G., https://orcid.org/0000-0003-3917-924X Filonenko T. G., https://orcid.org/0000-0002-4674-7391 Kubyshkin A. V., https://orcid.org/0000-0002-1309-4005 Ermola Y. A., https://orcid.org/0000-0003-4474-3714 Kalfa M. A., https://orcid.org/0000-0002-7179-3402 Kramar T. V., https:// orcid.org/0000-0003-2632-0451
РЕЗЮМЕ
Туберкулез (ТБ) является социально-значимым заболеванием для всего мирового сообщества. Важной проблемой в успешной борьбе с данной инфекцией является лавинообразное увеличение случаев туберкулеза с лекарственной устойчивостью. В условиях туберкулеза легких (ТЛ) значимая роль отводится комбинации этиологических и патогенетических факторов, приводящих к значительным расстройствам клеточных иммунных реакций в ответ на стимуляцию возбудителем с последующим развитием вторичной иммунологической недостаточности (ВИН), характерной для данной патологии.
На сегодняшний день остаются неразрешенными вопросы нарушения кооперативных взаимодействий местного клеточного иммунного ответа легких, приводящей к слабой активации Т-клеточного звена, а также несостоятельности В-клеточного иммунитета, снижению пролиферативной активности клеток лимфоидного ряда и активации апоптоза, цитокинового дисбаланса и активации иммуносупрессорных механизмов, что препятствует полноценному пониманию единой картины патологического процесса.
Целью исследования являлось определение иммунофенотипических особенностей популяции лимфоцитов в фрагментах ткани легких пациентов с различными формами вторичного туберкулеза в зависимости от резистентности на примере фиброзно-кавернозного туберкулеза (ФКТ).
Материалом исследования являлись участки ткани легких 30 больных с подтвержденным диагнозом ФКТ, распределенные в 2 основные группы: с наличием лекарственной устойчивости (n=15) и 15 пациентов c нерезистентными формами ФКТ. Было проведено стандартное гистологическое исследование. Иммуногистохимическая панель маркеров включала CD68, CD4, CD8, CD20, CD138.
Исследования проведены в Центре коллективного пользования научным оборудованием «Молекулярная биология» Медицинской академии им. С. И. Георгиевского в рамках поддержанного ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского» гранта № ВГ09/2019.
В результате исследования установлено, что в условиях вторичного туберкулеза независимо от резистентности определяется формирование локального иммунодефицита с иммунным ответом по Th-2 пути.
Преобладание цитотоксических лимфоцитов в зоне специфической грануляционной ткани и дренирующего бронха индуцирует о пролонгации воспаления и переводе его в латентную фазу.
Увеличение количества Т-хелперов, а также активированных лимфоцитарных плазмоцитов может являться достоверным прогностическим и диагностическим критерием реактивации туберкулезного процесса.
Ключевые слова: патогенез, туберкулез, CD4 позитивные Т лимфоциты, CD8 позитивные Т лимфоциты, B лимфоциты, плазматические клетки, иммуногистохимия.
NON-SPECIFIC IMMUNOLOGICAL RESISTANCE IN DIFFERENT FORMS OF SECONDARY TUBERCULOSIS
Golubinskaya E. P., Filonenko T. G., Yermola Yu. A., Gerachenko A. V., Kubyshkin A. V., Kalfa M. A., Kramar T. V.
Medical Academy named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia
SUMMARY
Tuberculosis (TB) is a socially significant disease for the entire world community. An important challenge in suc-
cessfully combating this infection is the avalanche increase in the number of drug-resistant tuberculosis. Currently, among the reasons for the development of pulmonary tuberculosis, a complex of etiological and pathogenic factors contributing to the disruption of the immune response to M. tuberculosis and the formation of secondary immunological failure (SIF) accompanying the disease are of particular importance.
However, the issues of discoordination of cellular components of the local immune system of the lungs leading to T-cell deficiency, as well as the ineffectiveness of the B-cell link, reduction of lymphocyte proliferative activity and activation of apoptosis, cytokine imbalance and activation of immunosuppression mechanisms are not fully studied and have a scattered nature, which does not allow us to assess the overall picture of violations.
The goal: determining the immunophenotype of lymphocyte population in lung tissue biopsy specimens of patients with various forms of secondary tuberculosis depending on resistance in case fibrosecavernous tuberculosis (FCT).
The material in the study was pulmonary tissue fragments of 30 patients with the verified diagnosis of FCT, and distributed in 2 main groups: resistant forms of secondary tuberculosis (n = 15) and 15 patients not resistant forms of secondary tuberculosis. The standard histological method was used. Immunohistochemically panel of markers included CD68, CD4, CD8, CD20, CD138.
The study was conducted at the Center for the collective use of scientific equipment «Molecular Biology» of the Medical Academy named after S.I. Georgievsky in the framework of the grant № ВГ 09/2019, supported by federal state autonomous educational institution of higher education «V.I. Vernadsky Crimean Federal University».
The results of the study have shown that in the conditions of secondary tuberculosis, regardless of resistance, the formation of local immunodeficiency with an immune response along the Th-2 pathway is determined.
The prevalence of cytotoxic lymphocytes in the area of specific granulation tissue and the draining bronchus indicated the prolongation of inflammation and its transfer to the latent phase.
The increase in the number of T-helpers and activated plasma cells can serve a reliable prognostic and diagnostic marker for the reactivation of the tuberculosis process.
Key words: pathogenesis, tuberculosis, CD4 positive T lymphocytes, CD8 positive T lymphocytes, lymphocytes, plasma cells, immunohistochemistry
Туберкулез (ТБ) является социально-значимым заболеванием для всего мирового сообщества. Важной проблемой в успешной борьбе с данной инфекцией является лавинообразное увеличение случаев туберкулеза с лекарственной устойчивостью. В условиях туберкулеза легких (ТЛ) значимая роль отводится комбинации этиологических и патогенетических факторов, приводящих к значительным расстройствам клеточных иммунных реакций в ответ на стимуляцию возбудителем, с последующим развитием вторичной иммунологической недостаточности (ВИН), характерной для данной патологии. Значительное положение в данном процессе занимают свойства M. tuberculosis, а именно вирулентность, контаги-озность, резистентность и т.д. [1; 2; 3].
Феномен резистентности к химиотерапии обусловлен совокупностью факторов, к которым относятся устойчивость и изменчивость непосредственно самой M. tuberculosis, в результате чего вынужденно применяются, что требует применения высоких, иногда токсических доз лекарственных препаратов, доставка которых к патологическим очагам затруднительна из-за разрастания грубоволокнистой соединительной ткани [2; 4; 16].
Наиболее часто лекарственная устойчивость определяется у пациентов с фиброзно-каверноз-ным туберкулезом (ФКТ), для которого характерно формирование выраженной соединительнотканной капсулы. В соответствии с данными ВОЗ, именно ФКТ характеризуется высокой летальностью, достигающей 75-80% [3; 5].
Установлено, что для инициации процесса перепрограммирования макрофагов, активированных Т-лимфоцитами хелперами 2 типа, немаловажную роль играет преобразования микроокружения в очагах специфического воспаления. К сожалению, вопросы клеточных взаимодействий клеток иммунного ряда, в том числе и клеточных компонентов системы местной защиты легких, в результате чего происходит формирование Т-клеточного дефицита с реактивной неэффективностью В-клеточного звена, нарушение процессов дифференцировки лимфоцитов и интенсификация апоптоза, формирование иммуносупрессии, остаются малоизучены, а результаты исследований имеют неоднозначный характер, приводя к трудностям в оценке общей картины патологического процесса. [4; 6;7].
Цель исследования - определение иммуно-фенотипа популяции лимфоцитов в биоптатах ткани легких пациентов с различными формами вторичного туберкулеза в зависимости от резистентности.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Материалом исследования являлись резецированные участки легких 30 больных с верифицированным диагнозом вторичный туберкулез, а именно ФКТ, распределенные в 2 основные группы: туберкулез с лекарственной устойчивостью (ЛУ-ТБ) (п=15) и 15 пациентов с вторичным туберкулезом, получающих стандартное лечение с клинически подтвержденной положительной динамикой.
В качестве контроля (К) использовались резецированные фрагменты легочной ткани 30 больных, умерших от патологии, не связанной с патологией дыхательной системы (диффузный кардиосклероз, ХПН и т. д.).
Для исследования были отобраны пациенты с наличием подтвержденных данных о наличии/отсутствии химиорезистентности, отрицательных клинико-лабораторных данных наличия коморбидной патологии (вирусных гепатитов В, С и ВИЧ), обострения хронических заболеваний других органов и систем, информированное согласие.
Гистологическое исследование резецированных фрагментов легких из очага специфического воспаления и макроскопически интактной лёгочной ткани проводилось по стандартной методике. Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) проводили согласно стандартизированной методике с использованием серийных парафиновых срезов толщиной 4 мкм, помещенных на адгезивные стекла, покрытые поли-зином («Menzel-Glaser», Германия) и реактивов компании DAKO [8. С. 960]. Панель маркеров лимфоидного звена клеточного иммунного ответа включала : CD8 маркер цитотоксических T-лимфоцитов (clone C8/144B, monoclonal mouse, разведение 1:50, DAKO, Дания), CD4 -Т-хелперов 1 типа (clone 4B12, monoclonal mouse, разведение 1:50, DAKO, Дания), CD20 -В-лимфоцитов (clone L26, monoclonal mouse, Ready-to-use, DAKO, Дания) и CD138 - маркер синдекан-1, при мембранной экспрессии характеризует активированные плазматические клетки (clone MI 15, monoclonal mouse, Ready-to-use, DAKO, Дания). Визуализация макрофагов осуществлялась маркером CD68 (clone KP1, monoclonal mouse, Ready-to-use, DAKO, Дания). Для постановки реакции с маркерами использовали протокол окрашивания, рекомендованный производителем. Система визуализации Novocastra NovolinkTM на основе компактного полимера Novolink Compact Polymer™ (Leica, Германия) на иммуногистостейнере BondMax (Leica, Германия). С целью контроля адекватности реакций была проведена серия исследований с использованием позитивных (миндалины) и негативных образцов (жировая ткань), которые служили эталонами.
Последующая морфометрия полученных данных проводилась с помощью лицензионного программного обеспечения ImageJ в стандартизованной' площади фото цифрового изображения гистологического среза, полученного в фотокамере OLYMPUS C5050Z («Olympus», Япония) микроскопа OLYMPUS CX41 («Olympus», Япония) при увеличении
х200 (числовая апертура - 0,65; рабочее расстояние - 0,6 мм).
Статистический анализ данных выполнен с использованием программного пакета Statistica for Microsoft Windows, version 10.0. StatSoft Inc., США. Данные представлены в виде M±SD, где М - среднее арифметическое, а SD - стандартное отклонение. Были составлены статистические ряды, нормальность распределения определяли с использованием критерия Эппса-Палли. Оценка статистической значимости различий сравниваемых величин двух независимых групп проводилась при помощи двух выборочного критерия Стьюдента. Критический уровень значимости различий между группами был принят равным р = <0,05. Достоверность различий сравниваемых величин определяли с использованием непараметрического U-критерия Ман-на-Уитни при уровне значимости а = 5%. Для оценки статистической взаимосвязи высчитывали коэффициент корреляции Пирсона.
Морфологические исследования проведены в Центре коллективного пользования научным оборудованием «Молекулярная биология» Медицинской академии им. С. И. Георгиевского в рамках поддержанного ФГАОУ ВО «КФУ им. В. И. Вернадского» гранта № ВГ 09/2019 (НИ-ОКР «Особенности транскрипционных факторов в иммунорегуляции при ВИЧ-сочетанном туберкулезе», № государственной' регистрации АААА-А19-119122390054-9).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для более точной оценки иммуноморфологи-ческих характеристик фрагментов легочной ткани пациентов с ФКТ было использовано зонирование патологически измененных тканей по отношению к очагу кавернозной деструкции. Все образцы исследуемых тканей характеризовались наличием трехслойной стенки каверны : пиоген-ный слой (казеозный некроз), слой специфической грануляционной ткани и слой грубоволок-нистой соединительной ткани. В перикаверноз-ной зоне отмечались поля дис- и ателектазов и очаги эмфизематозного расширения альвеол.
Зона специфической грануляционной ткани представляла собой густую сеть функционально неполноценных сосудов капиллярного типа с лимфогистиоцитарной инфильтрацией. В группе пациентов с лекарственной устойчивостью непосредственно в прилежащей к пио-генному слою зоне грануляционной ткани определялась выраженная экспрессия CD4 маркера Т-лимфоцитов хелперов (97,27 ± 4,81) (рис.1).
Необходимо отметить, что CD8+ Т-клетки в описанных участках не визуализировались и определялись непосредственно в виде линии
Рис. 1. Количественные характеристики CD4+ лимфоцитов Т-хелперов (А) и CD8+ цитотоксических лимфоцитов (В) в образцах ткани легкого у пациентов с ФКТ. ГС - грануляционный слой, ФС - фиброзный слой, ДБ - дренирующий бронх, ПЗ - перикавернозная зона. * - достоверность различий по отношению к контрольной группе р<0,05; # - достоверность различий между группами МБТ+ и
МБТ- р<0,05.
по периферии грануляционного слоя на границе с фиброзной капсулой, окружающей стенку каверны. При сопоставлении количественных соотношений CD4+ и CD8+ клеток в ткани кавернозной полости, определен индекс иммунологической регуляции = 0,21±0,1, который достоверно отличался от показателя контрольной группы (1,5±0,3, р<0,05) (рис.1).
В пиогенном и грануляционном слоях стенки фиброзной каверны ИГХ реакция с маркером В-лимфоцитов продемонстрировала негативное окрашивание. При этом интенсивность экспрес-
сии маркера плазмоцитов имела разнородный характер в зависимости от наличия/отсутствия лекарственной устойчивости.
Максимальное число CD138+ клеток с мембранным окрашиванием определялось в специфической грануляционной ткани, причем в случаях с нерезистентными формами туберкулеза они располагались в максимальной близости к пиогенному слою, а у пациентов с ЛУ-ТБ -перераспределялись к фиброзному. Количество плазматических клеток увеличивалось по мере приближения к казеозному некрозу (табл.1).
Таблица 1
Количественные характеристики CD20+ В-лимфоцитов и CD138+ плазмоцитов в стенке фиброзной каверны пациентов с ФКТ в зависимости от наличия / отсутствия ЛУ
Локализация СБ20 CD138
Не резист. (M±SD) Резист. (M±SD) К (M±SD) Не резист. (M±SD) Резист. (M±SD) К (M±SD)
Зона грануляционной ткани 0 0 2,58±0,15 86,52±6,51*# 31,97±2,17* 0
Зона фиброзного слоя 8,97±0,49* 11,09±0,71* 2,49±0,17 23,99±2,08# 3,41±0,17* 0
Зона дренирующего бронха 17,97±1,41*# 12,97±0,71* 3,01±0,09 12,02±0,08*# 1,21±0,09 0
Зона окружающей ткани 14,01±1,19* 16,96±0,82* 2,63±0,21 31,87±3,67* 38,52±3,01* 0
Примечание: * - достоверность различий по отношению к контрольной группе р<0,05; # - достоверность различий между группами МБТ+ и МБТ- р<0,05.
Фиброзный слой каверны - поля разрастания грубоволокнистой соединительной ткани с формированием множества лимфоидных агрегатов со светлыми герминативными центрами. Превалирующим типом клеток в таких структурах являются В-лимфоциты (56,12±3,23% позитивных клеток), располагающихся как по периферии, так и в зародышевых центрах (рис. 2А). Важным является малое количество плазмоци-
тов (3,41±0,17), локализующихся по периферии лимфоидных фолликулов, на фоне преобладание зрелых В-лимфоцитов в указанных структурах в группе пациентов с фармрезистентностью (3,41±0,17) (рис. 2В).
В группе больных с нерезистентным ФКТ наблюдалась усиление как мембранной, так и цитоплазматической экспрессии синдекан-1. Количественные показатели CD138+ плазмоци-
2020, т. 10, № 3
крымскии журнал экспериментальном и клиническои медицины
Рис. 2. МБТ-. ИГХ. Лимфоидные фолликулы фиброзного слоя каверны. А - Выраженная мембранная экспрессия маркера CD20+ В-лимфоцитов в лимфоидном фолликуле. Ув. 200. В - Мембранная экспрессия маркера CD138+ плазмоцитов в виде «полумесяца» в лимфоидном фоликуле с расширенным герминативным центром. Ув.100. С - Мембранная экспрессия маркера CD8+ Т-цитотоксических лимфоцитов в лимфоидном фолликуле. Ув.200. D - Мембранная экспрессия маркера CD4+ Т-лимфоцитов хелперов в лифоидном фолликуле на границе с перикавер-
нозной зоной. Ув.40.
тов в зоне лимфоидных агрегатов статистически значимо отличалось от показателей группы пациентов с верифицированной резистентностью и составляло 23,99±2,08 клетки (р<0,05). Количество CD4+ Т-хелперов было в 2 раза ниже по сравнению с цитотоксическими лимфоцитами (49,40±2,69 и 27,62±1,33, соответственно).
В зоне дренирующего бронха также наблюдались выраженные гистологические межгрупповые отличия. При нерезистентных формах туберкулеза просвет бронха заполнен казеоз-ными массами, у пациентов с лекарственной устойчивостью - бронх запустевший либо со слизистым содержимым. При активации туберкулезного процесса с формированием большого количества казеозных масс количество CD4+ клеток в перибронхиальной зоне увеличивается в сравнении с фиброзным слоем, однако цито-токсические лимфоциты являются доминирующей популяцией лимфоидных клеток. Значи-
мое количество CD20+ клеток определялось как в просвете бронха, так и по периферии в виде очаговых скоплений (рис. 3А). Плазматические клетки с позитивным мембранным окрашиванием визуализировались вблизи стенки бронха, располагаясь циркулярно, в виде скоплений (рис. 3В). Важно отметить, что подобная интенсификация экспрессии визуализировалась и в зоне неспецифического панбронхита интактной легочной ткани.
Была выявлена прямая выраженная корреляционная связь между количественными показателями CD8+ цитотоксических лимфоцитов, локализованных в дренирующем бронхе и CD4+ Т-хелперов грануляционной ткани ^ = 0,80). Между количеством CD8+клеток и CD68+ макрофагами перикавернозной зоны выявлялась обратная взаимосвязь средней силы ^ = 0,63). По нашему мнению, данные характеристики межклеточных соотношений свидетельствуют
Рис. ЗА - МБТ+. ИГХ реакция с маркером СБ20. Позитивная мембранная экспрессия В-лимфоцитов в содержимом дренирующего бронха и в перибронхиальной ткани. Ув. 400. Рис. ЗВ - МБТ-. ИГХ реакция с маркером СБ138. Очаговые перибронхиальные скопления позитивно окрашенных
плазмоцитов с мембранной экспрессией синдекан-1. Ув. 400.
Рисунок 4. МБТ+. ИГХ реакция с маркером СБ4 (А), СБ8 (В), СБ20 (С), СБ138 (Б). А - мембранная экспрессия СБ4 лимфоцитов в активной гранулеме в центральной зоне казеозного некроза (стрелка). Ув. 400. В - мембранная экспрессия СБ8 неактивных гранулемах (стрелка). ПЛ - клетки Пирогова-Лангханса. Ув.400. С - позитивно окрашенные В-лимфоциты с мембранной экспрессией по периферии от неактивной гранулемы (стрелка), центрально расположенные клетки Пирогова-Лангханса (ПЛ). Ув.400. Б - неактивные гранулемы (НГ) с отрицательной цитоплазматической и мембранной реакцией синдекан-1. Очаговые скопления СБ138+ плазмоцитов с мембранной экспрессией по периферии от гранулем (стрелка). Ув.100.
об активации цитотоксических лимфоцитов на фоне значительного увеличения количества CD4+ клеток с целью изолирования иммунного ответа, в результате чего, возможно, происходит прямое цитотоксическое воздействие на CD68+ макрофаги, содержащие возбудитель и дальнейшая стабилизации воспалительного процесса. На фоне этого общее снижение иммунорегуля-торного индекса по отношению к контрольной группе свидетельствует о неэффективности иммунного ответа в результате подавления клеточного иммунитета.
Значимым показателем активности туберкулезного воспаления, в том числе и в условиях ФКТ, является корреляция активных и неактивных гранулем непосредственно в перикаверноз-ной зоне и окружающей ее легочной ткани.
В процессе исследования нами было установлено статистически значимое повышение количества активных гранулем, характеризующихся центрально расположенной зоной казе-озного некроза, у пациентов с нерезистентными формами вторичного туберкулеза. У пациентов с верифицированной резистентности в ткани легких преобладали неактивные гранулемы, представленные в том числе и с рубцовыми изменениями. Так, в случаях с нерезистентными формами туберкулеза, нами установлено значимое увеличение числа активных гранулем, характеризующихся центрально расположенной зоной казеозного некроза. Как активные, так и неактивные гранулемы визуализировались в очагах специфического воспаления независимо от наличия лекарственной устойчивости.
Анализ ИГХ реакции с маркерами CD4 и CD8 показал, что количество позитивно окрашенных Т-хелперов увеличилось незначительно и они располагались непосредственно в зоне казеозно-го некроза (рис.4А). Такими же характеристиками обладал и пиогенный слой кавернозной полости. Основная масса таких лимфоцитов располагалась кольцевидно на границе с окружающими тканями.
Корреляционный анализ позволил установить сильную прямую связь между количеством Т-хелперов в очагах гранулематозного воспаления и количеством цитотоксических лимфоцитов в эмфизематозно расширенных участках перика-вернозной зоны ^=0,83) и одновременной обратной связи с CD68+ макрофагами в окружающей легочной ткани. По-видимому, выявленные закономерности количественной взаимозависимости клеточных компонентов системы локального иммунитета легких являются следствием цепи каскадных реакций, запускаемых первичным поражением ткани. Только последовательное изменение качественных и количественных
характеристик клеток по зонам воспалительной инфильтрации координирует степень агрессивности течения специфического гранулематозного воспаления, предопределяя в конечном итоге его исход и осложнения.
Независимо от активности гранулемы доминирующей популяцией клеток лимфоидного ряда являлись CD8+цитотоксические лимфоциты. Необходимо отметить, что наибольшее количество CD8+клеток определялось в неактивных гранулемах. В целом же они располагались по периферии от очагов гранулематозного воспаления (рис. 4В).
При анализе экспрессии маркера CD20 было установлено, что В-лимфоциты локализовались по периферии очага воспаления, циркулярно и являлись стабильной популяцией клеток (рис. 4С). Данный феномен, по-нашему мнению, обоснован изменением количественных характеристик CD138+ плазмоцитов в зависимости от стадии развития гранулемы.
Так, в участках с неактивными гранулемами количество CD138+ клеток составляло 9,3±0,13. При этом единичные плазматические клетки локализовались в центральных отделах, преимущественно в рубцующихся гранулемах. В остальных гранулемах CD138+ плазмоциты располагались очаговыми скоплениями в перигранулематозных областях. Необходимо отметить, что в неактивных гранулемах определялась либо слабая цито-плазматическая, либо негативная реакция с маркером, что свидетельствует о стабильности новообразованной соединительной ткани (рис. 4D).
В условиях активного воспаления с преобладанием альтеративных и некробиотических реакций количество плазмоцитов с выраженной мембранной экспрессией синдекана-1 возрастало. По нашему мнению, данные изменения свидетельствуют об интенсификации гуморального ответа в ответ на высвобождение большого количества микобактерий.
Легочная ткань вокруг перикавернозной зоны характеризовалась наличием очагов дистелекта-за, ателектаза, а также эмфизематозно расширенными альвеолами. В некоторых наблюдениях активного ФКТ определялись фокусы казеозной пневмонией, в которых определялось максимальное количество клеток макрофагального и лим-фоцитарного рядов, представленные в основном CD4+ и CD138+ клетками.
Независимо от наличия ЛУ в участках кол-лабированных альвеол отмечается рост числа клеток с цитоплазматической экспрессией син-декан-1, что свидетельствует о реактивации клеток стромы, в том числе и фибропластического ряда. Подобная реакция говорит о нарастающей функциональной активности этих клеток и прогрессии их способности к коллаген образо-
ванию. В зонах дистелектаза и ателектаза им-мунофенотипические особенности популяции клеток лимфоидного ряда по-прежнему свидетельствуют о достоверном преобладании цито-токсических лимфоцитов, действие которых направлено в том числе и на гиперактивированные макрофаги. Иммунорегуляторный индекс CD4/ CD8 = 0,61±0,01.
По мере отдаления от кавернозной полости количественные показатели CD4+ и CD8+ лимфоцитов стабильно снижались, и данные клетки определялись как рассеянные единичные позитивно окрашенные элементы с мембранной экспрессией, а популяция В-лимфоцитов и плазмо-циты вообще не визуализировались.
ОБСУЖДЕНИЕ
В условиях вторичного туберкулеза важная роль в стабилизации патологического ответа отводится Т-лимфоцитам. Было определено, что в обеих группах общее количество Т-клеток значительно увеличилось по отношению к группе контроля [9; 11; 12]. Однако, несмотря на высокие количественные показатели, было установлено снижение регуляторного индекса, что свидетельствует о переходе патологического процесса в латентную стадию. Данные показатели свидетельствуют о развитии иммунодефи-цитного состояния с характерным превалированием Т-киллеров и супрессоров, число которых отличается от показателей Т-хелперов в 5 раз. По нашему мнению, это говорит о неполноценном взаимодействии активированных макрофагов и клеток лимфоидного происхождения на фоне персистенции M. Tuberculosis, приводя к дестабилизации иммунных реакций.
Во время анализа данных ИГХ реакций с маркерами лимфоцитов было установлено, что в ткани легких больных ФКТ, независимо от наличия либо отсутствия лекарственной устойчивости, максимальное количество CD20+ В-лимфоцитов определялись в бронхо-ассоци-ированной лимфоидной ткани и в лимфоидных фолликулах, располагаясь по периферии и непосредственно в герминативных центрах. Популяция CD8+лимфоцитов была основной и превышала количество Т-хелперов в 2 раза. В условиях вторичного туберкулеза количество клеток лимфоидного ряда статистически значимо отличалось от данных контрольной группы что, по нашему мнению, свидетельствует о реактивной лабильности гуморального иммунитета. На фоне преобладания зрелых форм В-лимфоцитов парадоксальным являлось малое количество клеток, экспрессирующих маркер CD138. Плазматические клетки визуализировались небольшими группами в виде полукруга вокруг лимфоидных
фолликулов к группе пациентов с ЛУ ФКТ. В группе пациентов без лекарственной устойчивости плазмоциты с интенсивным мембранно-ци-топлазматическим окрашиванием определялись в лимфоидных агрегатах и непосредственно в стенках кавернозной полости с максимальной концентрацией CD138+клеток на границе грануляционной ткани с зоной казеозного некроза. Необходимо отметить повышение количества плазматических клеток в стенке дренирующего бронха и прилегающей легочной ткани.
Таким образом, при оценивании динамики прогрессирования специфического воспаления при вторичном туберкулезе, значимым является характер распределения клеток лимфоидного ряда в области активных и неактивных гранулем. Установлено, что в сравнении с контролем у пациентов обеих групп снижается иммуноре-гуляторный индекс за счет значительного повышения CD8+ Т-киллеров. В активных гранулемах было установлено увеличение количества CD4+ Т-хелперов, которые локализовались вокруг казе-оза в виде плотного кольца. CD20+ В-лимфоциты определялись в виде относительно стабильной популяции, перифокально по отношению к очагу воспаления. При дестабилизации гранулемы, пропорционально с увеличением зоны казеозно-го некроза, отмечалось увеличение пула CD138+ клеток с мембранной экспрессией и интенсивности цитоплазматической реакции стромальных клеток, что является критерием роста реактивности фибробластов.
Парадоксальное прогрессирование иммуноде-фицитного состояния при вторичных формах туберкулеза следует рассматривать с точки зрения первичного инфицирования антигенпрезентиру-ющих клеток, в особенности макрофагов, программируемых M. tuberculosis для переключения иммунного ответа по альтернативному пути и активации макрофагов 2 типа, функционально направленных на ремоделлирование окружающих тканей, интенсификацию процессов ангиогенеза и пневмофиброза (рис.5) [10; 13; 14].
При этом цитотоксический эффект Т-киллеров, который происходит путем впрыскивания перфо-ринов и других цитолитических веществ в цитоплазму макрофагов, приводит к апоптотической трансформации клеток без некробиотических изменений, а также к высвобождению микобак-терий, персистирующих в макрофагах и про-грессированию специфического туберкулезного воспаления за счет нарастающей бактериальной инсеминации окружающих тканей легкого и повторному неэффективному фагоцитозу. Определенная доля M. Tuberculosis уничтожается плазматическими лимфоцитами из достаточно стабильной популяции В-лимфоцитов, локали-
NK.-► ЛПК с М, tuberculosis-Апоптоз АПК
Высвобождение У М. tuberculosis
1иФН-7 1ИЛ-12, NF-kB
Нативные Т^клеткн-► Т-киллеры (CD8+)
I +
Tli-► |Th2 (CD4+V
+
I МНС I
ÍThl (CD4+) +
M tuberculosis -*|МНС If
DSF
■у ремоя
CD] 38+
плазм от м м
I L
! I регрессия -+■ воспаления МБТ+
] I о шорны i i фагоцитоз
Латентная фаза МБТ-
9,10.13
GM-CSF [1ФН-
ИЛ-2 ФНО
Активация ремоделнрующих М2
Альтернативная амижщнч CD20+ В-лимфоцито»
Активация т провоспалитильних М1
Рис.5. Схематическое изображение патогенетических механизмов активации специфического воспаления при ФКТ.
зованной в бронхо-ассоциированной лимфоид-ной ткани. При этом происходит ингибирование острого воспаления и перевод его в латентную фазу, что замыкает формирование патогенетического «порочного круга» [11; 12; 15].
Принимая во внимание значимую роль ма-крофагальной популяции в определении пути развития иммунного ответа, возможность иму-нокоррекции должна быть направлена непосредственно на стимуляцию макрофагальной аутофа-гии, что приведет к ликвидации внутриклеточной персистенции M. Tuberculosis.
Соблюдение этических стандартов
Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского» (протокол №9 от 21.03.2016 г.).
Благодарности
Авторы выражают благодарность доктору медицинских наук, профессору кафедры нормальной анатомии Медицинской академии имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского» Е. Ю. Зяблицкой за оказанную помощь в проведении иммуногистохимических исследований.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
ЛИТЕРАТУРА
1. Global Tuberculosis Report 2018. WHO/CDS/ TB/2018.20. Geneva, World Health Organization, 2018:95-96.
2. Ваниев Э. В., Васильева И. А., Эргешов А. Э., Багдасарян Т. Р Трудности ведения больного туберкулезом легких с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя и сопутствующей патологией. Туберкулез и болезни легких. 2016;94(7):56-60.
3. Голубинская Е. П., Филоненко Т. Г., Ку-бышкин А. В. и др. Особенности иммунофенотипа макрофагальной популяции при фиброзно-каверноз-ном туберкулезе легких. Бюллетень сибирской медицины. 2019; 18 (1):190-201.
4. Гурова Я. В., Мордык А. В., Гурова И. С. Моле-кулярно-генетические методы исследования у больных с разным течением туберкулеза. Туберкулез и болезни легких. 2019;97(6):52-53.
5. Шиман О. В., Вабищевич И. М. Морфологическая характеристика туберкулёза. Смоленский медицинский альманах. 2017;(1):375-378.
6. Голубинская Е. П., Филоненко Т. Г., Ермола Ю. А. Ультраструктурные особенности компонентов аэрогематического барьера лёгких при фиброзно-ка-вернозном туберкулёзе легких. Медицинский вестник Северного Кавказа. 2019;14(1-2):180-186.
7. Piacenza L., Trujillo M., Rafael R. Reactive species and pathogen antioxidant works during phagocytosis. J. Experimental Med. 2019; 216(3): 501-516.
8. Бурмистрова И. А., Ваниев Э. В., Самойлова А. Г., Ловачева О. В., Васильева И. А. Нарастание спектра лекарственной устойчивости возбудителя на фоне неадекватной химиотерапии туберкулеза легких. Туберкулез и болезни легких. 2019;97(8):46-51. doi:10.21292/2075-1230-2019-97-8-46-51.
9. Huygen K. The immunodominant T-cell epitopes of the mycolyl-transferases of the antigen 85 complex of M. tuberculosis. Front. Immunol.2014;5:1-11. doi:10.3389/ fimmu.2014.00321
10. Jasenosky L. D., Scriba T. J., Hanekom W. A. et al. T cells and adaptive immunity to Mycobacterium tuberculosis in humans. Immunol. Rev.2015; 264:74-87. doi:10.1007/978-3-319-20478-9_5
11. Голубинская Е. П., Кальфа М. А., Ермола Ю.
A. Пролиферативная активность метапластического эпителия слизистой оболочки бронхов при фиброзно-кавернозном туберкулезе. Цитология. 2019;(6):461-468.
12. Melo M. G. Imbalance of NET and alpha-1-antitrypsin in tuberculosis patients is related with hyperactive inflammation and severe lung tissue damage. Frontiers in Immunology. 2019;9:3147. doi:10.3389/2018.03147.
13. Шовкун Л. А., Кампос Е. Д., Константинова А.
B., Франчук И. М. Влияние различных способов патогенетического лечения на процессы свободно-радикального окисления у больных инфильтративным туберкулезом легких. Медицинский вестник юга России. 2017;2(8):46-52.
14. Syal K., Chatterji D. Vitamin C: a natural inhibitor of cell wall functions and stress response in mycobacteria. Adv. Exp. Med. Biol. 2018;1112: 321-332.
15. Qualls J. E., Murray J. P. Immunometabolism within the tuberculosis granuloma: amino acids, hypoxia, and cellular respiration. Semin Immunopathology. 2016;38(2):139-152.
16. Шовкун Л. А., Кампос Е. Д., Франчук И. М., Константинова А. В., Володько Н. А. Эффективность патогенетического лечения у больных туберкулезом легких с экссудативным типом воспалительной тканевой реакции. Медицинский вестник юга России. 2016;1:87-91.
17. Фролова К. С., Борисов С. Е., Слуцкая О. М. Туберкулез у больных с воспалительными заболеваниями на фоне лечения ингибиторами ФНО-альфа. Туберкулез и социально значимые заболевания. 2018;2:31-41.
REFERENCES
1. Global Tuberculosis Report 2018. WHO/CDS/ TB/2018.20. Geneva, World Health Organization, 2018:95-96.
2. Vaniev E. V., Vasilyeva I. A., Ergeshov A. E., Bagdasaryan T. R. Difficulties in managing a patient with pulmonary tuberculosis with multidrug-resistant pathogen and concomitant pathology. Tub. and lung disease. 2016;94(7):56-60. (in Russ)
3. Golubinskaya E.P., Filonenko T.G., Kubyshkin A.V. and other Features of the immunophenotypes of the macrophage population in fibrous-cavernous pulmonary tuberculosis. Bulletin of Siberian Medicine. 2019;18(1):190-201. (In Russ).
4. Gurova Ya. V., Mordyk A. V., Gurova I.S. Molecular genetic research methods in patients with different courses of tuberculosis.Tub. аnd lung disease. 2019;97(6):52-53. (In Russ).
5. Shiman O. V., Vabishchevich I. M. Morphological characteristics of tuberculosis. Smolensk Medical Almanac. 2017;(1):375-378. (In Russ).
6. Golubinskaya E. P., Filonenko T. G., Ermola Yu. A. Ultrastructural features of the components of the air-blood barrier of the lungs in fibro-cavernous pulmonary tuberculosis. Medical Bulletin of the North Caucasus. 2019;14(1-2):180-186. (In Russ).
7. Piacenza L., Trujillo M., Rafael R. Reactive species and pathogen antioxidant works during phagocytosis. J. Experimental Med. 2019;216(3):501-516.
8. Burmistrova I. A., Vaniev E. V., Samoilova A. G., Lovacheva O. V., Vasilyeva I. A. Increase in the spectrum of drug resistance of the pathogen against the background of inadequate chemotherapy of pulmonary tuberculosis.Tub. and lung disease. 2019; 97(8):46-51. doi:10.21292/2075-1230-2019-97-8-46-51. (in Russ)
9. Huygen K. The immunodominant T-cell epitopes of the mycolyl-transferases of the antigen 85 complex of M. tuberculosis. Front. Immunol. 2014;5:1-11. doi:10.3389/ fimmu.2014.00321
10. Jasenosky L.D., Scriba T.J., Hanekom W.A. et al. T cells and adaptive immunity to Mycobacterium tuberculosis in humans. Immunol. Rev. 2015;264:74-87. doi:10.1007/978-3-319-20478-9_5
11. Golubinskaya E. P., Kalfa M. A., Ermola Yu. A. Proliferative activity of metaplastic epithelium of the bronchial mucosa in fibrocavernous tuberculosis. Cytology. 2019;(6):461-468. (In Russ).
12. Melo M. G. Imbalance of NET and alpha-1-antitrypsin in tuberculosis patients is related with hyperactive inflammation and severe lung tissue damage. Frontiers in Immunology. 2019;9:3147. doi:10.3389/2018.03147.
13. Shovkun L. A., Kampos E. D., Konstantinova A. V., Franchuk I. M. Influence of various methods of pathogenic treatment on the processes of free radical oxidation in patients with infiltrative pulmonary tuberculosis // Medical Bulletin of the South of Russia. 2017;2(8):46-52. (In Russ).
14. Syal K., Chatterji D. Vitamin C: a natural inhibitor of cell wall functions and stress response in mycobacteria. Adv. Exp. Med. Biol. 2018;1112: 321-332.
15. Qualls J.E., Murray J.P. Immunometabolism within the tuberculosis granuloma: amino acids, hypoxia, and cellular respiration. Semin Immunopathology. 2016;38(2):139-152.
16. Shovkun L. A., Kampos E. D., Franchuk I. M., Konstantinova A. V., Volodko N. A. The effectiveness of pathogenetic treatment in patients with pulmonary tuberculosis with exudative type of inflammatory tissue reaction // Medical Bulletin of the South of Russia. 2016;1:87-91. (In Russ).
17. Frolova K. S., Borisov S. E., Slutskaya O. M. Tuberculosis in patients with inflammatory diseases during treatment with TNF-alpha inhibitors. Tuberculosis and socially significant diseases. 2018;2:31-41. (In Russ).
