CC BY
48
Ветеринария "И#
УДК 615.324:615.281.8+615.273.3
НЕКОТОРЫЕ ПОДХОДЫ К РАЗРАБОТКЕ АЛГОРИТМА ИССЛЕДОВАНИИ ДЛЯ СТАНДАРТИЗАЦИИ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
Т. Л. БАХАРЕВА,
руководитель отдела биотехнического контроля,
Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций Роспотребнадзора
(620030, г. Екатеринбург, ул. Летняя, д. 23; тел.: В (343) 261-99-60),
И. М. ДОННИК,
доктор биологических наук, профессор, академик Россельхозакадемии, ректор,
Уральский государственный аграрный университет
(620075, г. Екатеринбург, ул. К. Либкнехта, д. 42; тел.: В (343) 371-33-63),
Н. П. ГЛИНСКИХ,
доктор медицинских наук, профессор, директор,
Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций Роспотребнадзора
(620030, г. Екатеринбург, ул. Летняя, д. 23; тел.: В (343) 261-99-60)
Ключевые слова: иммунобиологические препараты, селезенка быка, фракция 2-5 кДа, пептидные фракции, методы анализа, алгоритм, стандартизация.
Описаны возможные подходы к разработке алгоритма исследования для стандартизации иммунобиологических препаратов на примере Нуклеопептида и Лиелина, полученных из селезенки быка. В связи с тем, что лекарственным средствам данной группы характерны сложность состава, полифункциональность действия, содержание большого количества балластных веществ и варьирование количества активных компонентов в зависимости от технологии получения, в настоящей работе было использовано комплексное сочетание физико-химических и иммунологических методов анализа. Изучение спектральных характеристик исследуемых образцов было проведено в диапазоне ультрафиолета с расчетом их коэффициентов экстинкций. Содержание белковых соединений определяли микробиуретовым методом. N-концевые аминокислоты в пептидных фракциях идентифицировали дансильным методом тонкослойной хроматографии на полиамидных пластинках. Специфическую активность препаратов оценивали на 9-дневных куриных эмбрионах против штамма вируса ньюкаслской болезни Бор-74 ВГНКИ и по реакции розеткообразования В- и Т-лимфоцитов периферической крови быка. Исследования проведены на образцах различных серий Нуклеопептида, который производится с предварительным автолизом селезенки и Лиелина, который производится без предварительного автолиза. Исходные препараты очищали от балласта методом ультрафильтрации через мембраны УМ-5 и УМ-2. Методом ОФ ВЭЖХ в градиенте ацетонитрила получены биологически активные пептидные фракции. Показано, что наиболее подходящей величиной, стандартизирующей различные серии иммунобиологических препаратов из селезенки быка, является показатель коэффициента экстинкции их фракции 2-5 кДа. С целью определения специфической активности может быть использован метод активизации реакции розеткообразования В- и Т-лимфоцитов периферической крови быка через четыре часа совместной инкубации с исследуемым препаратом in vitro.
A NUMBER OF APPROACHES TO DEVELOPMENT OF STUDY ALGORITHM FOR STANDARDIZATION OF IMMUNOBIOLOGICAL PREPARATIONS
T. L. BAKHAREVA,
head of biotechnical control, Ekaterinburg research institute of viral infections epidemiology
(620030, Ekaterinburg, Letnyaya st., 23; phone: 8 (343) 261-99-60),
I. M. DONNIK,
doctor of biological sciences, professor, academician of Russian academy of agricultural sciences, rector,
Ural state agricultural university
(620075, Ekaterinburg, K. Libknehta st., 42; phone: 8 (343) 371-33-63),
N. P. GLINSKIH,
doctor of medical sciences, professor, director,
Ekaterinburg research institute of viral infections epidemiology
(620030, Ekaterinburg, Letnyaya st., 23; phone: 8 (343) 261-99-60)
Keywords: immunobiological preparations, bovin spleen, 2-5 kDa fraction, peptide fractions, analytical techniques, algorithm, standardization.
Possible approaches to development of study algorithm for standardization of immunobiological preparations using bovine spleen-derived Nucleopeptide and Lyelin were described. Considering the complex composition and the multifunctional effect of the given medical preparation group along with a considerable content of ballast substances, we used a complex of physicochemical and immunological assays. Spectral characteristics of the test samples were studied in the UV range with the extinction values calculated. The content of protein compounds was measured by the microbiuretic assay. N-terminal amino acids in the peptide fractions were identified by the thin-layer chromatography DNS procedure on polyamide sheets. Specific activity of the preparations was assessed against Newcastle disease virus, Bor-74 All-Union Research Control Institute strain in nine-day-old chicken embryos as well as by the rosette test on bovine B- and T-lymphocytes in bovine peripheral blood. The tests were performed on samples of various Nucleopeptide series produced with preliminary spleen autolysis and on those of Lyelin produced without preliminary autolysis. Ballast substances were eliminated from the original preparations using ultrafiltration through UM-5 and UM-2 membranes. Bioactive peptide fractions were obtained using the reverse phase high performance liquid chromatography assay. It was demonstrated that the extinction value of the 2-5 kDa fraction of immunobiological preparations was most suitable to standardize their various series. To determine the specific activity, the rosette activation test may be used on bovine B- and T-peripheral blood lymphocytes after four-hour combined incubation with the test preparation in vitro.
Положительная рецензия представлена Н. А. Верещак, доктором ветеринарных наук Уральского научно-исследовательского ветеринарного института Россельхозакадемии.
Ветеринария
В связи с интенсивным развитием промышленности на Среднем Урале происходит ухудшение экологической обстановки и как следствие снижение иммунного статуса сельскохозяйственных животных [5]. Поэтому применение иммуномодулирующей терапии не теряет своей актуальности [10]. Кроме того с ростом заболеваний бактериально-вирусной этиологии, особенно важным в последние годы стало изучение препаратов, проявляющих антивирусную активность. Одним из них является иммуномодулятор Нуклеопептид, разработанный для использования в ветеринарной практике [11, 4, 6]. Препарат относится к группе иммунобиологических препаратов, полученных из селезенки КРС, среди которых широко известны: Спленин, Солкоспленин, Просплен, Лиелин и другие [8]. Для этих препаратов характерны сложность состава, полифункциональность действия, содержание большого количества балластных веществ и варьирование количества активных компонентов в зависимости от технологии получения. Это создает значительные трудности при контроле их качества. Одним из путей совершенствования стандартизации лекарственных средств является комплексное сочетание физико-химических и иммунологических методов анализа, на основе научно обоснованного выбора оптимальных и экономичных методик, унифицированных в пределах группы близких по химическому строению препаратов [2]. Таким образом, детерминация биологической активности с химическим составом может стать основой для унификации оценок и контроля качества препаратов данной группы.
Цель и методика исследований.
Целью работы является определение возможных подходов для создания алгоритма исследований по стандартизации иммунобиологических препаратов из селезенки быка. Исследования были проведены на образцах различных серий Нуклеопептида, который производится с предварительным автолизом селезенки и Лиелина, который производится без предварительного автолиза.
Нуклеопептид (НП) представляет собой жидкую лекарственную форму, а Лиелин (ЛН) — это аморфный порошок. Поэтому образцы НП лиофилизиро-вали с целью дальнейшего исследования. Лиофили-зацию замороженных в жидком азоте исследуемых образцов, проводили на аппарате фирмы «Hitosicc» (Голландия) при разрежении 0,1 мбар (10 Па) и конвекционном подогреве 20 °С в течение 3-4 часов в предварительно взвешенных колбах.
Взвешивание осуществляли на электронных аналитических весах 2004 МР {^аГюйш» (ФРГ), с суммарной ошибкой 0,06 мг. Водные растворы НП и ЛН, содержащих не более 1-2 % сухого вещества, подвергали ультрафильтрации в ячейке ФМ02-200 через мембраны УМ-5 и УМ-2 («Атюоп», США) при давлении азота 4 атм. В результате были получены фракции 2-5 кДа — Фнп и Фш.
Спектрофотометрирование исходных препаратов и их фракций проводили в диапазоне УФ от 220 до 350 нм на регистрирующем двулучевом спектрофотометре фирмы «НйасЫ» (Япония). Коэффициент экстинкции рассчитывали в соответствии с ГФ XI, вып. 1. Содержание белка в исследуемых образцах определяли микробиуретовым методом с реактивом
Бенедикта в соответствии с ГФ XI, вып. 1. Оптическую плотность определяли на спектрофотометре Ultrospec 40500 (LKB, Швеция) при 330 нм в кюветах, с толщиной слоя 1 см против дистиллированной воды.
ВЭЖХ Ф и ФЛН проводили на приборе Altex (Beckman, США) с использованием колонки С-18 Ultraspheret (LKB, Швеция) с обращенной фазой в градиенте ацетонитрила. Для накопления массы сухого вещества проводили по 5 циклов хроматографии каждого образца [9]. N-концевые аминокислоты в пептидных фракциях идентифицировали дансиль-ным методом тонкослойной хроматографии на полиамидных пластинках [12, 3].
Специфическую активность исследуемых препаратов и их фракций оценивали: по антивирусной активности на 9-дневных куриных эмбрионах (РЭК) против штамма вируса ньюкаслской болезни Бор-74 ВГНКИ (по ТУ 10.07.13-90 Нуклеопептид); по реакции розеткообразования В- и Т-лимфоцитов [7].
Статистическую обработку результатов проводили по программе MIKROSTA, в соответствии с ГФ XI, вып. 1 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний».
Результаты исследований.
В ходе проведенных исследований было выявлено, что образцы различных серий НП и ЛН оказались в основном не однородны как по физико-химическим параметрам, так и по антивирусной активности. Среди серий НП были как активные (НП-2, НП-3, НП-5), так и не активные образцы (НП-1, НП-4). Все исследуемые образцы препарата ЛН оказались активными, но различия между ними были двукратными (рис. 1). Максимальная антивирусная активность, которую проявили оба препарата на 9-дневных куриных эмбрионах против штамма вируса болезни Ньюкасла Бор-74 ВГНКИ, в среднем составила 1,0 ± 0,25 lg ЭИД /мл. НП проявлял эту активность в концентрации 60 цг/РЭК, а ЛН — 270 цг/РЭК. Поэтому удельная активность НП оказалась в 4,5 раза выше, чем у ЛН. Полученные в результате ультрафильтрации ФНП и ФЛН значительно выравнивались по данному параметру, а их удельная активность возросла в 12 и 38,5 раз, соответственно.
По данным литературы, национальный стандарт интерферона с активностью 4 000 ИЕ максимально снижал репликацию штамма вируса болезни Ньюкасла Бор-74 ВГНКИ 9-дневных РЭк на 1,25 ± 0,25 lg ЭИД50/мл в концентрации 20 ИЕ/РЭК [11].
Процентное содержание сухой массы в образцах различных серий НП варьировало от 1,4 ± 0,04 до 2,8 ± 0,03 %. По содержанию фракций ФНП и ФЛН в исходных препаратах НП и ЛН различные серии были также неоднородны 3,4-7,8 % и 2,2 ± 0,16—
4,3 ± 0,18 %, соответственно. В среднем НП оказался примерно в два раза более насыщен соединениями 2-5 кДа, чем ЛН.
По содержанию общего белка образцы различных серий НП и ЛН были хорошо стандартизированы:
0,49-0,59 % и 10,0 ± 0,3-10,7 ± 0,9 %, соответственно. Это, вероятно, связано с нормированием данного параметра в Технических условиях. Но в пересчете на сухую массу препарата, образцы НП проявили неоднородность (21 ± 0,15-35 ± 0,25 %) и в среднем, со-
Ветеринария
Таблица І
Физико-химическая характеристика биологически активных пептидных фракций
Положение на профиле элюции, условный % ацетонитрила Спектры поглощения в УФ Число пептидов ^концевые аминокислоты присутствующих пептидов
А . нм min, А нм max,
29-30 251 277-279 4 1. глицин; 2. изолейцин; 3. аспарагиновая; 4. серин
32 251-252 276 5 1. пролин; 2. изолейцин; 3. фенилаланин; 4. глицин; 5. аминокислотах
36 253-254 273-276 3 1. треонин; 2. аминокислотах; 3. аминокислотаУ;
держали в 2 раз больше белка (26,4 %), чем образцы ЛН (10,4 %).
По содержанию полипептидов фракции Ф и ФЛН в среднем значительно выравнивались (35,5 ± % и
26,3 %, соответственно). Образцы ФЛН оказались не однородны (14,1-33,8 %), а образцы ФНП были стандартны (35,0 ± 0,3-36,5 ± 0,25 %). При пересчете содержания полипептидов 2-5 кДа на исходный препарат, НП содержал их в 3 раза больше, чем ЛН — 2,2 и 0,76 %, соответственно (рис. 2). Если рассматривать только биологически активные образцы НП и ЛН, то прослеживается четкая взаимосвязь между содержанием полипептидов 2-5 кДа в сухой массе препарата и величиной его антивирусной активности = +0,990 и RЛН = +0,976). Связь показателей содержания общего белка с биологической активностью обоих препаратов не выявлена.
На основании спектрального анализа в области УФ так же была выявлена неоднородность химического состава всех исследуемых образцов. Свойственное для НП положение максимума поглощения и характер спектра свидетельствовали о присутствии в препарате не только белковых, но и нуклеотидных соединений, с явным преимуществом последних. Спектр препарата ЛН был приближен к спектру белков (Хтах = 278-279 нм) или свободных ароматических аминокислот (Хтах = 276 нм). Очищенные от крупных балластных белков и низкомолекулярных соединений фракции ФНП и ФЛН оказались ближе друг к другу по максимуму поглощения, чем исходные препараты. Сопоставляя спектральные данные в УФ с биологической активностью исходных препаратов и их фракций ФНП и Ф можно отметить следующую тенденцию: у всех биологически активных образцов в результате ультрафильтрации наблюдалось смещение спектра в сторону БСА (рис. 3). У биологически не активного образца НП-4 после ультрафильтрации спектр практически не изменился и даже незначительно сместился в коротковолновую зону.
Анализ полученных данных по коэффициентам экстинкции е X тах, е X 260 и е X 275 подтвердил неоднородность по химическому составу исходных образцов НП и их фракций ФНП. Эти величины были от
1,7 ± 0,13 до 6,2 ± 0,34, что характерно при значительном колебании содержания в составе смеси оптически активных как белковых, так и небелковых компонентов. В противоположность этому, различные серии ЛН более стандартны по данным показателям
(0,24 ± 0,05-0,30 ±), но их фракции также были не однородны и различались в 2 раза (рис. 4). Сопоставляя данные по биологической активности и коэффициентам экстинкции е X иммунобиологических
/-' max / 1 Л\
препаратов из селезенки быка (рис. 1 и 4), можно отметить, что е X фракций Фт и Фто биологически
’ max т.г НП •ЛН . -г^гл а
активных образцов приближалось к 1,0 (е X max БСА). Чем ближе к 1,0 значение коэффициента, тем выше биологическая активность препарата. Коэффициент корреляции между активностью препарата и е X max фракции ФНП (R= -0,996) и ФЛН (R= +0,9б5).
Для дальнейшего изучения компонентного состава фракций Ф и Ф был использован метод многократной ВЭЖХ. Из Ф было получено 25 пептидных фракций в градиенте ацетонитрила от 10 до 45 условных % (14 наиболее значимых), а из образцов ФЛН — только 13 пептидных фракций (6 наиболее значимых). Пять пептидных фракций ФНП оказались аналогичны фракциям ФЛН. Биологически активными были четыре пептидные фракции НП — № № 16, 18, 21, 24 и три фракции ЛН — № № 8, 9, 11 (табл. 1). Симбатность кривых элюции двух препаратов может свидетельствовать о сходстве активных фрагментов, проявляющих биологическую активность. Стандартность пептидного состава полученных с ВЭЖХ фракций была подтверждена по воспроизводимости хроматограмм в ходе определения N-концевых аминокислот и воспроизводимым характером их спектров поглощения в УФ. Таким образом, из исследуемых иммунобиологических препаратов НП и ЛН, были выделены биологически активные пептидные фракции, что позволило оптимизировать алгоритм их препаративного получения.
Тем не менее, из-за нестандартности биохимического состава иммунобиологических препаратов селезенки быка (НП и ЛН), по-прежнему оставалась актуальной разработка различных методов определения их биологической активности как нормирующего показателя специфической активности. В связи с этим определенный интерес представляло изучение действия НП на активность В- и Т-лимфоцитов периферической крови быка по реакции розеткообразова-ния [1]. Полученные результаты показали, что образцы семи серий НП с относительной погрешностью среднего результата 6,8 % активизировали реакцию розеткообразования in vitro у В-лимфоцитов (от 1,6 ±
0,14 до 2,2 ± 0,12 раза) и у Т-лимфоцитов (от 1,5 ±
0,11 до 2,0 ± 0,11 раз). Таким образом, иммунобиоло-
ІВЗНД50/ил
Т---Т-----Т—Т—1 ї
Нуклеопептид GO |іг IРЭК
—Г Лиелин 270 рг / РЭК
Ветеринария
Рисунок 1
Антивирусная активность ЭИД50/мл) на 9-дневных куриных эмбрионах против штамма вируса болезни Ньюкасла Бор-74 ВГНКИразличных серий Нуклеопептида (Я), Лиелина (Я) и их фракций 2-5 кДа (□)
L AL
НП-1 НП^ НП-3 НП4 НП 5
ПН-1 ПН^ ПН-3
Рисунок 2
Процентное содержание в сухом веществе препаратов Нуклеопептида (НП) и Лиелина (ЛН): □ — общего белка;
Н — низкомолекулярной фракции 2-5 кДа;
Я — полипептидов 2-5 кДа
Рисунок З
Максимумы поглощения в УФ различных серий Нуклеопептида (НП), Лиелина (ЛН) и их фракций 2-5 кДа (ФНП, ФЛН)
гический препарат из селезенки быка статистически достоверно активизировал В- и Т-лимфоциты периферической крови быка через четыре часа совместной инкубации in vitro. Следовательно, данная методика может быть предложена для разработки алгоритма исследований по стандартизации исследуемой группы лекарственных средств.
Выводы.
1. Иммунобиологические препараты НП и ЛН проявляют антивирусную активность на 8-9-дневных РЭК против штамма вируса ВБН «Бор-74 ВГНКИ ветпрепаратов» до 1,0 ± 0,25 ^ЭИД50/мл. Удельная активность НП примерно в 4 раза выше, чем ЛН.
2. Величина антивирусной активности НП, как и ЛН, определенным образом связана с антивирусной активностью их фракций 2-5 кДа и процентным содержанием полипептидов (2-5 кДа) в препарате (ЯНП = +0,990 и Я = +0,976). Отсутствие антивирусной активности образцов НП сопровождается отсутствием активности их фракций 2-5 кДа.
3. Фракции 2-5 кДа биологически активных образцов НП и ЛН оказались ближе друг к другу по биохимическому составу и биологической активности, по сравнению с исходными препаратами.
4. Чем ближе к 1,0 значение коэффициента экстинкции (є X тах) фракции 2-5 кДа, тем выше биологическая активность препарата (Я = -0,996 и Я = +0,965).
3555 ► - Аграрный вестник Урала № 11 (117), 2013 г. - < ^ %Фф
Ветеринария "И#
5. НП и ЛН (полученные из селезенки быка на основе разных способов) имеют пять сходных пептидных фракций, выходящих в одном проценте ацетонитрила при хроматографировании методом ВЭЖХ. Три из этих фракций, выходящие в 29-30, 32-33 и 36 усл. % ацетонитрила, проявляют антивирусную активность.
Рекомендации.
Опираясь на проведенный анализ экспериментальных данных, можно предположить, что наиболее подходящей величиной, стандартизирующей различные серии иммуномодулирующих препаратов из селезенки быка, является показатель коэффициента экстинкции их фракции 2-5 кДа. С целью определения специфической активности может быть использован метод активизации реакции розеткообразова-ния В- и Т-лимфоцитов периферической крови быка через четыре часа совместной инкубации с исследуемым препаратом in vitro.
Полученные ультрафильтрацией очищенные от балласта фракции 2-5 кДа препаратов НП и ЛН, после доработки их стабильности, могут быть рекомендованы как самостоятельные иммунобиологические препараты из селезенки быка, либо как референс-препарат для стандартизации лекарственных средств данной
еАшз 7 -i—
6 — 5 —
4 — 3 — rh 1
2 — 1 — 4 >1 i
o -I— 12 3 4 Нуклеопептид 1 Ш-1 — 1 5 12 3 Лиелин
Рисунок 4
Коэффициенты экстинкции е X max различных серий Нуклеопептида (Я), Лиелина (Я) и их фракций 2-5 кДа (П)
группы. Не исключено, однако, что в ряде случаев, например, для сравнения между собой по эффективности действия иммунобиологических препаратов из селезенки быка, получаемых по разным технологиям, возникнет необходимость обратиться к методу ВЭЖХ и анализировать количество и активность пептидов во фракциях с колонки С18.
Литература
1. Бахарева Т. Л. Определение биологической активности иммуномодулятора из селезенки быка по реакции розетко-образования В- и Т-лимфоцитов. Проблемы инфекционной патологии в Уральском регионе. Сб. работ III-й окружной научно-практической конференции. Екатеринбург : Издательство АМБ., 2010. С. 99-104.
2. Буран А. В. Основные направления государственного контроля лекарственных средств в свете внедрения GMP EC и вступления России в ВТО // Эконом. вестник фармации. 2003. № 11 (69). С. 7.
3. Дарбре А. М. Практическая химия белка. Мир, 1989. С. 366-370.
4. Денисов Е. Н., Сковородин Е. Н., Леонов Д. В. Влияние Нуклеопептида на повышение привесов при откорме крупного рогатого скота // Ветеринария. 2012. № 10. С. 18-19.
5. Донник И. М. с соавт. Влияние экологических факторов на организм животных // Ветеринария. 2007. № 6. С. 38-42.
6. Ибатова Г. Г. с соавт. Влияние нуклеопептида на прирост живой массы бычков черно-пестрой породы. Инновации, экобезопасность, техника и технологии в переработке сельскохозяйственной продукции. Уфа : Башкирский ГАУ 2012. С. 52.
7. Методы оценки Т- и В-систем иммунитета у крупного рогатого скота при бурцеллезе и туберкулезе. Методические рекомендации / сост. М. А. Бажин и др. Омск : вАСхНИЛ. ВНИИБТЖ., 1989.
8. Павлова С. Н. Новые аспекты применения селезенки в мясной промышленности : диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук. Улан-Удэ, 2001.
9. Петтерсон С. В. Общее руководство по разработке препаративной очистки пептидов // Биофармацевтический журнал. 2010. Т. 2. № 1. С. 30-34.
10. Федоров Ю. Н. Иммунодефициты крупного рогатого скота // Ветеринария. 2006. № 1. С. 3.
11. Щедрин Е. Л. и др. Прогнозирование интерфероноподобной активности стимуляторов резистентности // Ветеринария. 1989. № 12. С. 2.
12. Gray W. R. Methods in Enzymol. 1972. V. 25. P. 121-138.
References
1. Bahareva T. L. Determination of biological activity of spleen bull by the reaction of rosette B-and T-lymphocytes. The problems of infectious diseases in the Ural region. Sat District III works of scientific and practical conference. Ekaterinburg : Publishing AMB, 2010. P. 99-104.
2. Buran A. V The main directions of the state control of medicines in the light of the implementation of GMP EC and the entry of Russia into the WTO // Economy. Journal of Pharmacy. 2003. № 11 (69). P. 7.
3. Darbre A. M. Practical protein chemistry. Mir, 1989. P. 366-370.
4. Denisov E. N., Skovorodin E. N., Leonov D. V Effect Nukleopeptid to increase weight gain in fattening cattle // Veterinary Medicine. 2012. № 10. P. 18-19.
5. Donnik I. M. et al. The influence of environmental factors on the animal // Veterinary. 2007. № 6. P. 38-42.
6. Ibatova G. G. et al. Influence nukleopeptid on live weight gain of calves black and white breed. Innovation, environmental safety, equipment and technology in the processing of agricultural products. Ufa : Bashkir State Agrarian University, 2012. P. 52.
7. Methods of evaluation of T-and B-systems of immunity in cattle at burtselleze and tuberculosis. Guidelines / comp. M. A. Bazhin, et al. Omsk Agricultural Sciences. VNIIBTZH, 1989.
8. Pavlova S. N. New aspects of the spleen in the meat industry : diss. of doctor of science. Ulan-Ude, 2001.
9. Petterson S. V. General guidance for the development of preparative purification of peptides // Biopharmaceutical magazine. 2010. Vol. 2. № 1. P. 30-34.
10. Fedorov Yu. N. Immunodeficiencies cattle // Veterinary Medicine. 2006. No. 1. P. 3.
11. Shchedrin E. L. et al. Prediction interferon similar activity stimulants resistance // Veterinary Medicine. 1989. № 12. P. 2.
12. Gray W. R. Methods in Enzymol. 1972 . V. 25. P. 121-138.
