CC BY
89
СИБИРСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ № 32007
ЛАБОРАТОРНЫЕ И
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ
ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 612.17:612.172.6:616.12
С.А. Афанасьев, Д.С. Кондратьева,
Т.Ю. Реброва, М.В. Егорова, А.В. Евтушенко, С.В. Попов
E-mail: [email protected]
НЕКОТОРЫЕ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕМОДЕЛИРОВАНИЯ КАРДИОМИОЦИТОВ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ
ГУ НИИ кардиологии Томского научного центра СО РАМН
Как известно, сократительная дисфункция миокарда при сердечной недостаточности обусловлена нарушением внутриклеточного гомеостаза ионов кальция в клетках сердечной мышцы. При этом снижение уровня систолического кальция во многом связано с уменьшением депонирующих свойств саркоплазма-тического ретикулума (СПР) кардиомиоцитов в результате снижения экспрессии белков Са2+-АТФ-азы СПР и рианодиновых рецепторов [1,2]. Эти изменения отражаются на процессах электромеханического сопряжения и, соответственно, влияют на хроноинотропные возможности ремоделированного миокарда [3,4]. Кроме того, известно, что в зависимости от генеза сердечной недостаточности состояние кальций-транспортирую-щих систем СПР кардиомиоцитов различается. Однако в настоящее время явно недостаточно сравнительных данных о состоянии внутриклеточного гомеостаза ионов кальция и других метаболических изменений кардиомиоцитов при разных видах кардиомиопатий.
Ключевым звеном электромеханического сопряжения является саркоплазматический ретикулум, который поддерживает внутриклеточный баланс ионов кальция. Одним из проявлений электромеханического сопряжения является зависимость между силой и частотой сокращения [5]. В настоящей работе для воздействия на функционирования Са2+-транс-портирующих систем СПР кардиомиоцитов исполь-
42
зовали оценку инотропной реакции миокарда на тест post-rest [6]. Исследования проводились на мышечных трабекулах, выделенных из ушка правого предсердия, иссекаемых при подключении ИК во время хирургических операций [7]. Было показано, что при карди-омиопатии, развившейся в результате ишемического или ревматического поражения, инотропная реакция миокарда на тест post-rest может быть двух типов. В первом случае амплитуда сокращения остается либо без изменений, либо оказывается выше базовой. Для II типа было характерно значительное снижение амплитуды сокращений относительно базовых. Вместе с тем инотропные реакции миокарда с ишемическим и ревматическим поражением на воздействие теста post-rest имели существенные различия. Так, мышечные полоски миокарда с ревматическим поражением I типа реакции на тест post-rest отвечали значительным увеличением инотропного ответа, тогда как реакции миокарда с коронарогенной кардиомиопатией не отличались от базовых значений Миокард пациентов с ревматическим поражением с I типом реакции характеризовался значительной потенциацией инотропного ответа на паузы, что свидетельствует о большей сохранности функциональной активности СПР в сравнении с ишемизированным миокардом I типа реакции. Известно, что потенциация первого после паузы сокращения реализуется в результате активности Са2+-АТФ-азы СПР, осуществляющей обратный захват ионов кальция во время паузы в интактном миокарде, поэтому можно предположить, что активность или количество Са2+-АТФ-азы СПР при ишемическом поражении миокарда значительно снижается. Об этом же свидетельствуют данные литературы, сообщающие о снижении экспрессии Са2+-АТФ -азы СПР при формировании инфаркт-индуцированной кардиомиопатии [8]. Выраженность различий в проявлении реакции II типа при рассматриваемых патологиях была так же заметна. Уже само появление такой реакции свидетельствует не только об угнетение обратного захвата ионов кальций в СПР, но и об истощении этого внутриклеточного депо ионов кальция во время паузы. Последнее обстоятельство может быть обусловлено дисфункцией рианодиновых рецепторов СПР. Действительно, именно дисфункция рианодиновых рецепторов, осуществляющих выброс ионов кальция из СПР, характерна для кардиоми-оцитов при дилатационной кардиомиопатии [8]. Сочетание двух этих механизмов, видимо, следует считать наиболее неблагоприятным, оно встречается у больных ишемической болезнью сердца со II типом реакции. Нужно отметить, что у всех пациентов с ревматическим поражением, биопсийный материал которых проявил II тип реакции, наблюдались длительные эпизоды мерцательной аритмии. Представленные данные свидетельствуют, что развитие сердечной недостаточности приводит к изменению функций СПР. При этом ремоделирование патологического миокарда, вероятно, формируется двумя путями.
В первом случае СПР сохраняет свою функциональную активность, что позволяет лучше сохранить потенциальные возможности инотропных реакций миокарда. Во-втором случае функции СПР значительно подавляются, и в сокращении кардиомиоцитов участвует экстраклеточный пул кальция. Сходные результаты были получены и в экспериментах на миокарде крыс с постинфарктным кардиосклерозом. Функциональное состояние СПР может играть существенную роль в реализации терапевтического действия антиаритмических и кардиотонических препаратов. Так, при кратковременном воздействии на перфузиру-емые мышцы антиаритмическим препаратом Ш класса амиодароном регистрируется значительное усиление потенциации инотропного ответа в мышцах с I типом реакции на тест (р<0,01; критерий Вилкоксона для парных значений). Амплитуда сокращения возрастала до 2 раз по сравнению с контрольным значением. Вместе с тем время, необходимое для достижения половины максимума прироста амплитуды t(T50) [9], на фоне амиодарона и в контрольных условиях статистически значимо не различалось. Это может свидетельствовать о том, что после обработки мышц амиодароном скорость захвата ионов кальция в миоплазму кар-диомиоцитов осталась такой же, как в контрольных условиях. В то же время рost-rest реакция миокарда крыс, длительно получавших амиодарон, значимо не отличалась от post-rest реакции миокарда интактных крыс. Можно предположить, что в условиях длительного применения амиодарона происходит приспособление внутриклеточных структур кардиомиоцитов к изменившемуся гомеостазу кальция, и в результате инотропная реакция миокарда на кратковременное прекращение (post-rest тест) электрической стимуляции не отличается от контрольных значений.
Таким образом, проведенные исследования изменений внутриклеточного гомеостаза ионов кальция кардиомиоцитов патологического миокарда показали, что состояние кальций-транспортирующих систем СПР кардиомиоцитов миокарда с сердечной недостаточностью ишемического и ревматического генеза различается. Патологическое ремоделирование миокарда приводит к угнетению кальций-аккумулирующей способности СПР. Причиной этого могут быть изменения химического состава мембран клетки и её органелл и, как следствие, функциональной активности связанных с ними ион-транспортирующих систем.
В настоящее время экспериментальные и клинические исследования убедительно показали, что при ишемическом повреждении миокарда наблюдается интенсификация процессов перекисного окисления липидов в мембраных структурах клеток миокарда [10]. Одним из патогенетических механизмов негативного влияния неконтролируемой активации процессов пероксидации на клетки является окисление фосфолипидов и тиоловых групп белков, что в конечном итоге приводит к нарушению целостности липидного бислоя или снижению функциональной активности
мембран-связанных белков. При этом установлено, что фосфолипиды деградируют раньше белков. В постин-фарктном периоде перекисное поражение клеточных мембран не ограничивается только зоной некроза, а оказывает негативное влияние на непораженные участки сердца [11]. Также негативному влиянию могут быть подвержены форменные элементы крови, контактирующие с пораженным участком миокарда. Такое влияние, видимо, сохраняется на протяжении длительного времени и может стать патогенетически значимым фактором постинфарктного ремоделирования миокарда, а изменение спектра фосфолипидов может служить индикатором патологических процессов, происходящих в организме.
Наши исследования показали, что изменения фосфолипидного состава мембран наблюдаются уже в остром периоде развития инфаркта миокарда. Так, в мембранах эритроцитов пациентов, поступивших с диагнозом инфаркт миокарда, было отмечено исходно низкое процентное содержание сфингомиелина, фосфа-тидилхолина и фосфотидилсерина по сравнению с аналогичными показателями у здоровых добровольцев.
Развитие хронической ишемии миокарда также сопровождается изменением фосфолипидного состава мембран. При анализе фосфолипидного состава мембран эритроцитов у пациентов с ИБС и грубыми нарушениями липидного обмена было отмечено снижение содержания сфингомиелина и фосфатиди-лэтаноламина. У таких пациентов терапия флувас-татином в дозе 80 мг в сутки в течение 24 недель и соблюдение стандартной гипохолестеринемической диеты [12] способствовали увеличению содержания фосфатидилхолина на 8% (20,8±1,0%, против 19,2±1,0% в контрольной группе, р=0,001; t - критерий Стьюдента) и фосфотидилсерина на 12% (21,2±2,0%, против 18,9±1,7% в контроле, р=0,009; t - критерий Стьюдента). Обнаруженное нами увеличение содержания фосфатидилхолина позволяет говорить о том, что проводимая терапия снизила негативное влияние пероксидации липидов и способствовала сохранению структурной целостности клеточных мембран. Учитывая то, что фосфатидилхолин является основным фосфолипидом мембран клетки и вовлечен в синтез фосфотидилсерина и фосфатидилэтаноламина, увеличение процентного соотношения фракций фосфати-дилхолина и фосфотидилсерина может быть связано с нормализацией липидного обмена и синтезом фосфолипидов de novo.
Изменения фосфолипидного состава клеточных мембран и активности пероксидации липидов в условиях постинфарктного ремоделирования миокарда мы исследовали и в хронических экспериментах на лабораторных животных. Для животных с моделированным кардиосклерозом в результате стенозирования коронарной артерии было характерно статистически значимое снижение уровня минорного фосфолипида - фосфатидилинозитола более чем на 40% и, напротив, увеличение на 20% содержания массивного фосфоли-
ЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
пида - фосфатидилэтаноламина . Согласно данным литературы, усиление распада фосфатидилинозитола изменяет состояние кальциевого насоса, открывая “ворота” для поступления внеклеточных ионов кальция в цитоплазму [13].
У животных с кардиосклерозом в сравнении с ин-тактными было отмечено повышение содержания малонового диальдегида на 20% и диеновых коньюгатов на 90%. Активность ферментативных антиоксидантов при этом, напротив, была снижена. Так, активность каталазы уменьшалась в 4 раза, а супероксид дисму-тазы - в 10 раз.
Выявленные изменения указывают на определенную несостоятельность репаративных процессов, проходящих в клетке на фоне хронической патологии. Причиной этого может быть напряжение энергетического метаболизма. Это предположение согласуется с данными о том, что возникновение в сердечной мышце гипоксических зон может приводить к недостаточности продукции АТФ митохондриями [14]. При дефицитном энергоснабжении наиболее глубоко нарушается функция сократительного аппарата и ион-транспор-тирующих систем - основных потребителей энергии в клетках [15]. Показано, что при постинфарктном кардиосклерозе даже в неповрежденных участках сердечной мышцы существенно снижены энергетические ресурсы [16]. В связи с этим важно знать, насколько выражено нарушение способности к окислительному фосфорилированию у митохондрий кардиомиоцитов при постинфарктном кардиосклерозе.
Исследования проводили на крысах-самцах линии Вистар, масса 250-300 г с кардиосклерозом, развившимся в результате экспериментального инфаркта миокарда [17]. В качестве контроля использовали митохондрии, полученные из сердца интактных животных.
Митохондрии сердца получали методом дифференциального центрифугирования в стандартной сахарозной среде, содержащей (мМ) 300 сахарозу, 10 ЭДТА, 8 трис, рН 7.4. Скорость поглощения кислорода митохондриями определяли полярографически с помощью электрода Кларка. Измерения проводили в термостатируемой ячейке объемом 1 мл при температуре 27 С0 и постоянном перемешивании при помощи магнитной мешалки. Скорость потребления кислорода выражали в нМ О2 в мин на 1 мг белка.
Оказалось, что скорость поглощения кислорода митохондриями на фоне сукцината при постинфарктном кардиосклерозе относительно контроля увеличивалась более чем в 2 раза (р <0.001; Ь - критерий Стьюдента). При добавлении в ячейку АДФ, митохондрии как контрольных, так и опытных животных дополнительно увеличивали скорость потребления кислорода. Прирост этого показателя в рассматриваемых группах составил 54,6 и 50 единиц соответственно и был практически одинаков (р >0.05; Ь - критерий Стьюдента). По исчерпании АДФ скорость поглощения кислорода митохондриями интактных крыс приближалась к исходному уровню. В группе животных с постинфарктным кардиосклерозом
такого выраженного снижения скорости поглощения кислорода митохондриями не происходило.
Расчет коэффициента дыхательного контроля отражающего степень сопряжения и фосфорилирования в митохондриях проведенный в нашем исследовании, показал, что у интактных крыс он был равен в среднем 3,4±0,27, а при постинфарктном кардиосклерозе составлял лишь 1,3±0,03. Низкое значение дыхательного контроля свидетельствует о практически полном разобщении окисления и фосфорилирования в митохондриях крыс с постинфарктным кардиосклерозом.
При исследовании окислительного фосфорилирования в присутствии малата и глутамата было обнаружено значительное подавление свободного дыхания митохондрий крыс с постинфарктным кардиосклерозом. При этом нужно отметить, что не выявлено значительного отличия скорости поглощения кислорода митохондриями интактных крыс как в присутствии сукцината, так и в присутствии малата с глутаматом.
Нарушение процесса энергообразования в клетке может произойти вследствие самых разных причин. Наиболее вероятной причиной наблюдаемое нами разобщения окислительного фосфорилирования является накопление в клетке при длительной ишемии свободных жирных кислот (СЖК). Так, известно, что при ишемических синдромах в крови больных повышается содержание свободных жирных кислот [18]. Высокие концентрации СЖК блокируют поступление глюкозы в клетки, в миоплазме накапливаются токсичные продукты расщепления жирных кислот, которые в свою очередь разрушают клеточную мембрану [15]. Все это в конечном итоге снижает контрактильные возможности кардиомиоцитов и нарушает сократительную функцию и электрическую стабильность миокарда.
Эффект значительного увеличения свободного, не связанного с синтезом АТФ, дыхания интактных митохондрий, наблюдаемого при добавлении к их суспензии свободных жирных кислот, хорошо известен [19]. Можно предположить, что и в нашем исследовании увеличение свободного дыхания митохондрий при постинфарктном кардиосклерозе тоже связано с наличием эндогенных жирных кислот.
Показанное в нашем исследовании подавление свободного дыхания в присутствии глутамата вполне согласуется с гипотезой об участии эндогенных жирных кислот в разобщении окислительного фосфорили-рования при постинфарктном кардиосклерозе [20].
Известно, что накопление продуктов перекисного окисления липидов приводит к нарушению мембранных структур митохондрий [15,21]. В связи с этим можно предположить, что показанное нами нарушение окислительного фосфорилирования связано не только с протонофорным действием жирных кислот, но и с накоплением продуктов перекисного окисления липидов и нарушением мембранных структур митохондрий [15]. Это предположение не противоречит нашим данным о том, что в кардиомиоцитах при хронической ишемии нарушается баланс между перекисным окис-
лением липидов и эндогенными жирорастворимыми антиоксидантами [22]. В его пользу свидетельствуют и литературные данные о значительном повышении уровня жирных кислот в крови и снижении образования макроэргов, а также повышении содержания малонового диальдегида и глутатионпероксидазы у больных с постинфарктным кардиосклерозом [18].
Выявленные нами изменения фосфолипидного состава мембранных структур клеток и разобщение окислительного фосфорилирования в митохондриях кардиомиоцитов могут оказывать значимое влияние на функционирование основных внутриклеточных систем, ответственных за гомеостаз ионов кальция. При хронических патологиях сердечно-сосудистой системы такие нарушения способны стать существенным фактором, определяющим нарушение электромеханического сопряжения в кардиомиоцитах и формирование сердечной недостаточности. Медикаментозная коррекция сердечной недостаточности и нарушений ритма должна учитывать метаболические перестройки, происходящие в клетках сердечной мышцы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Bers D., Eisner D., Valdivia H. Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Heart Failure Roles of Diastolic Leak and Ca2+ Transport // Circ Res. 2003. V.93. P. 487-490.
2. Ono K., Yano M., Ohkusa T. et al. Altered interaction of FKBP12.6 with ryanodine receptor as a cause of abnormal Ca2+ release in heart failure // Cardiovasc Res. 2000. V.48. P. 323-331.
3. Pieske B., Kretschmann B., Meyer M. et al. Alterations in intracellular calcium handling associated with the inverse force-frequency relation in human dilated cardiomyopathy // Circulation. 1995. V.92. P. 1169 -1178.
4. Yano M ., Kobayashi S., Kohno M. et al. FKBP12.6-mediated stabilization of calcium-release channel (ryanodine receptor) as a novel therapeutic strategy against heart failure // Circulation. 2003. V.107. P. 477-484.
5. Изаков В.Я., Иткин Г.П., Мархасин В.С., и др. Биомеханика сердечной мышцы. Москва, “Наука”, 1981, 325 c.
6. Wu S.N., Shen A.Y., Hwang T.L. Analysis of mechanical restitution and post-rest potentiation in isolated rat atrium // Chinese J. Physiol. 1996. V.39. P. 23-29.
7. Угдыжекова Д.С., Афанасьев С.А., Антонченко И.В. и др. Особенности инотропной реакции миокарда пациентов с ишемической болезнью сердца и миокарда крыс на фоне действия амиодарона // Кардиология. 2005. №3. С.71-75.
8. Sen L., Cui G., Fonarow G.C., Laks H. Differences in mechanisms of SR dysfunction in ischemic vs. idiopathic dilated cardiomyopathy // Am. J. Physiol. 2000.V. 279. H.709-718.
9. He H., Giorgano F.J., Hilan-Dandan R. et al. Overexpression of the rat sarcoplasmic reticulum Ca ATPase gene in the heart of tcansgenic mice accelerates calcium transients and cardiac relaxation// J. Clin. Invest. 1997. V.100. P. 380-389.
10. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Свободнорадикальные процессы при заболеваниях сердечно-сосудистой системы // Кардиология. 2000. №7. С. 48-61.
11. Кирк Е.С., Сонненблик Э.Г. Топография ишемии и некрозов, возникающих в результате окклюзии коронарных артерий. Патофизиология пограничной зоны. Метаболизм миокарда. Под ред. Е.И. Чазова, Х.Е. Моргана. М: Медицина, 1979, 408 с.
12. Применение современных липостатиков (флувастатина) у больных атеросклерозом венечных артерий в кардиохирургической клинике. Методические рекомендации Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, 2003, 24 с.
13. Шмидт Р., Тесс Г. Физиология человека. М.: Мир, 1996, 427 с.
14. Капелько В.И. Эволюция концепций и метаболическая основа дисфункции миокарда // Кардиология. 2005. №9. С. 55-61.
15. Huss J.M., Kelly D.R. Mitochondrial energy metabolism in heart failure: a question of balance // Clin. Invest. 2005. V115. P. 547-555.
16. Neubauer S., Horn M., Naumann A. et al. Impairtment of energy metabolism in intact residual myocardium of rat hearts with chronic myocardial infarction // J. Clin. Ivest. 1995. V92. P. 1092-1100.
17. Кондратьева Д.С., Афанасьев С.А., Фалалеева Л.П., Шахов В.П. Инотропная реакция миокарда крыс с постинфарктным кардиосклерозом на экстрасистолические воздействия // Бюл. экспер. биол. мед. 2005. №6. С. 613-616.
18. Молчанов С.Н., Люсов С.А., Говорин А.В., Неверов И.В. Сывороточные липиды при различных стадиях и морфофункциональных типах сердечной недостаточности у больных, перенесших инфаркт миокарда // Рос. кардиол. журнал. 2005. №2. С. 10-17.
19. Finck B.N., Han X., Courtois M. et al. A critical role for ppar -mediated lipotoxicity in the pathogenesis of diabetic cardiomyopathy: modulation by dietary fat content // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V100. P. 1226-1231.
20. Мохова Е.Н., Хайлова Л.С. Участие анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий в разобщающем действии жирных кислот // Биохимия. 2005. T70. C. 197-202.
21. Кожина О.В., Каратецкова М.П., Самарцев В.Н. Ресопрягающее действие АДФ при разобщении пальмитатом окислительного фосфорилирования в митохондриях печени // Биол. мембраны. 2006.T23. C. 213-218.
22. Лебедев А.В., Афанасьев С.А., Алексеева Е.Д. и др. Влияние возраста и ишемии на липопероксиды и липидорастворимые антиоксиданты сердца человека // Бюл. экспер. биол. мед. 1995. №6. С. 584-586.
SOME PATHOGENETIC ASPECTS OF CARDIOMYOCYTES REMODELLING IN FORMING CARDIAC INSUFFICIENCY
S.A. Afanasyev, D.S. Kondratyeva,
T.Yu. Rebrova, M.V. Yegorova,
A.V. Eutoushenko, S.V. Popov
SUMMARY
Function and intracellular mechanism of cardiomyocytes in experimental cardiac insufficiency were studied in CAD patients and in rheumatic valvular disease. Functioning of Са2+-transporting systems of sarcoplas-matic reticulum of cardiomyocytes, phospholipid level of cellular membranes and oxydation phosphorilation of mytochondria were studied. Change of phospholipid level and separation of oxidation phosphorilation is suggested to be associated with accumulation of fat acids and their peroxide oxidation products.
