CC BY
21
© Коллектив авторов, 2009 УДК 616.36-002.2:616.98:616-08
НЕКОТОРЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО ВЛИЯНИЯ ПРОТИВОВИРУСНОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВИРУСНОМ ГЕПАТИТЕ С
В.Х. Фазылов, Я.Р. Мангушева, Э.Г. Гайфуллина Казанский государственный медицинский университет
Вирус гепатита С (НСУ) в настоящее время является одним из ведущих этиологических факторов патологии печени у человека. Частота выявляемости НСУ-инфекции достигает 3% в популяции [10]. В мире число инфицированных НСУ составляет около 10 млн. человек [2]. В Российской федерации насчитывается более 2 млн. больных хроническим вирусным гепатитом С (ХВГС) [6].
Отличительной особенностью хронического гепатита С (ХГС) является латентное или мало-симптомное течение на протяжении длительного времени - от нескольких лет до десятилетий. Однако, несмотря на кажущееся благополучие, почти у трети больных ХГС ожидается развитие таких серьезных осложнений, как цирроз печени и гепатоцеллюлярная карцинома.
В ближайшие несколько десятилетий предполагается увеличение смертности и расходов, связанных с лечением терминальных форм поражения печени НОУ, что обосновывает необходимость лечения НОУ-ассоциированных заболеваний на максимально ранних сроках [7, 11]. В настоящее время широко определены показания к лечению НОУ-инфекции - все больные с различными её формами являются потенциальными кандидатами для противовирусной терапии (ПВТ) за исключением пациентов с декомпенси-рованным циррозом печени [9].
Препараты интерферона (а-ИФН), обладая выраженным иммуномодулирующим эффектом, являются потенциальным индуктором аутоиммунных процессов [5].
Начало 21 века ознаменовалось созданием пегилированного интерферона а (Пег-ИФН а), использование которого в комбинации с рибави-рином позволяет достигать элиминации вируса
Фазылов Вильдан Хайрулаевич, д. м. н., профессор, зав. кафедрой инфекционных болезней. Тел.: (843) 267-80-72. E-mail: [email protected]
более, чем у половины больных ХВГС [8]. Стойкий вирусологический ответ (СВО) на комбинированную терапию Пег-ИФН а с рибавирином у первичных больных ХГС наблюдается в 85% случаев, в том числе в 76% у больных с 1 генотипом НСУ и в 98% - с не-1 генотипом НОУ [4].
Известно, что а-ИФН проявляет широкий спектр иммунологической активности: стимулирует фагоцитоз, усиливает активность ЫК-клеток и других эффекторных клеток иммунной системы, индуцирует выработку цитокинов, усиливает экспрессию продуктов главного комплекса гис-тосовместимости 1 класса на поверхности инфицированных клеток [1,3].
Исходя из вышеперечисленного, ПВТ ХГС должна быть индивидуализирована и проводиться с тщательным мониторингом активности инфекционного процесса.
Целью нашего исследования явилось изучение эффективности противовирусной терапии ХГС и определение взаимосвязи аутоиммунных реакций с фагоцитарной активностью лейкоцитов на её фоне.
Материал и методы. Под наблюдением находилось 88 пациентов с ХГС, 43 (48,8%) мужчин и 45 (51,2%) женщин в возрасте от 18 до 49 лет (средний возраст 28,90±0,65 лет) с предположительным сроком инфицирования от 1 до 32 лет. Стаж болезни до 5 лет наблюдался у 55 (62,5%), более 5 лет - у 12 (37,5%) больных. Контрольную группу составили 32 здоровых добровольца.
Вероятные пути инфицирования удалось установить у 69 (78,4%) больных ХГС. Наиболее часто инфицирование происходило при внутривенном употреблении наркотиков - 22 (25%) и гемотрансфузиях - 17 (19,3%), при операциях - у 12 (13,6%), посещении стоматолога - у 7 (8%), семейно-бытовых контактах - у 7 (8%) пациентов; профессиональное заражение (медицинские работники) отмечено у 4 (4,5%) больных ХГС.
Диагноз ХВГС устанавливали на основании клинико-эпидемиологических данных и специ-
фической лабораторной диагностики. Серологические маркеры HCV (анти-HCVcore, NS3,4,5, IgM, IgG) в сыворотке крови определяли имму-ноферментным методом, а вирусную нагрузку (PHK-HCV) c генотипированием - методом поли-меразной цепной реакции (ПЦР). Из 88 пациентов низкая вирусемия обнаружена у 16 (18,2%), умеренная у 35 (39,8%), высокая у 37 (42%). У всех больных проводилось генотипирование, при этом у 48 (54,5%) пациентов определялся 1 (1а, 1в), у остальных 40 (45,5%) - не-1 (2a, 3a) генотип.
Морфологическое исследование биоптатов печени с вычислением индекса гистологической активности по бальной системе Knodell и степени фиброза проводились у 15 больных ХГС. По результатам биопсии печени признаки умеренного и тяжелого хронического гепатита выявлялись у 66,6% больных и у 53,3% - признаки фиброза.
У большинства больных клинические проявления заболевания ограничивались астеническим синдромом. Наиболее частыми были жалобы на повышенную утомляемость, немотивированную слабость, снижение трудоспособности. Диспепсические жалобы чаще встречались у больных с сопутствующими заболеваниями желудочно-кишечного тракта (хроническим холециститом, панкреатитом, гастродуоденитом и др.).
При первичном биохимическом исследовании крови больных ХГС активность сывороточных трансаминаз была низкой (N-1,5N) у 28 (31,8%), незначительно повышенной (1,5-3N) у 30 (34,1%), умеренно повышенной (3,5-5N) у 24 (27,3%) и высокой (>5N) - у 6 (6,8%) больных.
До начала лечения всем больным проводилось исследование показателей периферической крови, иммунного статуса, исследование уровня аутоантител (ANA, АМА, ASMA, LKM, anti-GPA), криоглобулинов, гормонов щитовидной железы,УЗ-исследование гепатобилиарной зоны и щитовидной железы.
После установления клинического диагноза с оценкой активности инфекционного и воспалительного процесса всем больным ХВГС была назначена индукционная ПВТ с введением высоких доз ИФН-а2 (3-5 млн. ЕД) в ежедневном режиме («Реаферон», «Интрон А», «Роферон») в комбинации с рибавирином («Ребетол», «Веро-рибави-рин») 13 мг/кг/сут. Длительность курса лечения составила 48 недель. В исследовании участвовали пациенты, ранее не получавшие противовирусную терапию.
На фоне лечения всем больным проводилось контрольное обследование в сроки 3, 6, 9, 12 месяцев терапии и через 6 месяцев после ее завершения.
Учет реакции иммунофлюоресценции проводили на проточном цитофлуориметре «FACScan» (Becton Dickinson, USA).
Криоглобулины определяли спектрофото-метрически на SPECTROMOM-204 (или ФЭК) при длине волны 500 нм по разности оптических плотностей AOD=OD4 и OD37, где OD4 и OD37 - оптические плотности растворов при темпера-
туре 4 0С и 37 0С соответственно.
Определение аутоантител - антинукпеарных (ANA), гладкомышечных (ASMA), антимитохон-дриальных (AMA), печеночно-почечных микро-сомальных (LKM-1) и антител к париетальным клеткам желудка (anti-GPA) проводили методом иммунофлюоресценции с использованием тест-систем (IMMGO Diagnostics, USA).
Функционально-метаболическую активность нейтрофилов определяли в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тесте) в спонтанном и индуцированном вариантах по методу Р.Н. Рас и со-авт. (1968) в модификации М.Е. Виксмана и А.Н. Маянского (1979). В индуцированном НСТ-тесте в качестве стимулятора применялся пирогенал в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.
Фагоцитарная активность лейкоцитов оценивалась по способности клеток захватывать St. аиге^. Рассчитывали фагоцитарную активность нейтрофилов (ФАН), фагоцитарное число (ФЧ), абсолютный фагоцитарный показатель (АФП).
Общекомплементарная активность сыворотки определялась по 50% гемолизу эритроцитов барана по M. Mayer, E. Kabat (1961).
Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) исследовали методом преципитации полиэти-ленгликолем 6000 по M. Dygeon и соавт. (1977).
Математическую обработку статистических данных проводили общепринятыми методами статистики, достоверность различия полученных данных определяли по t-критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение. Оценку эффективности противовирусной терапии препаратами а-ИФН по критериям Европейской ассоциации по изучению печени проводили через 6 месяцев после завершения схемы лечения. Отсутствие сывороточных маркеров репликации в эти сроки свидетельствовало о СВО. В нашем исследовании из 88 больных ХГС, находившихся на ПВТ, 74 (84,1%) пациента получили полный курс лечения, остальные 14 (15,9%) пациентов самостоятельно прекратили лечение ввиду отсутствия приверженности к терапии. Из 74 пациентов у 62 (83,7%) получен СВО, у 12 (16,2%) пациентов вирусемия сохранилась в течение 3 или 6 мес. лечения или возобновилась на поздних сроках лечения - на 9, 12 месяце, а также через 6 месяцев после годового курса а-ИФТ.
С целью прогнозирования результатов противовирусного лечения всем пациентам ХВГС проводилась ПЦР-детекция на РНК-НСУ через 4 недели от начала терапии. На этом сроке у 68 (91,9%) пациентов наблюдалось отсутствие в крови РНК вируса, что расценивалось как быстрый вирусологический ответ (БВО), из них у 61 (89,7%) пациента наблюдалось формирование СВО. У остальных 6 больных с отсутствием БВО в 83,3% случаев наблюдался рецидив вирусемии на сроке СВО.
Результаты исследования эффективности индукционной ПВТ интерфероном и рибавирином показали частоту СВО в 65,8% случаев при 1 генотипе и 97,2% - при не-1 генотипе вируса.
Для более тщательного обследования боль-
ных ХГС была разработана специальная анкета с целью диагностики аутоиммунных реакций, которая охватывала характерные для этого состояния жалобы и данные объективного обследования. Из жалоб «внепеченочного» характера отмечались боли в суставах (19,1%), мышечная слабость (15,5%), сухость во рту (15,4%), ощущение онемения и зябкости рук (9,5%). При осмотре выявлены сухость кожи у 19,1%, сухость губ и заеды у 14,3% пациентов.
Самостоятельные заболевания аутоиммунного характера, ассоциированные с нОУ-инфекци-ей, были диагностированы у 7 (7,9%) пациентов ХГС. У 3 больных (3,4%) диагностирован аутоиммунный тиреоидит, у 2 (2,3%) - псориаз. Красный плоский лишай имел место у 1 (1,1%), синдром Шегрена - также у 1 (1,1%) больного.
Таким образом, клинические симптомы аутоиммунных реакций и самостоятельные аутоиммунные заболевания наблюдались относительно редко. Возможно, сказались небольшие сроки течения ХГС от момента инфицирования и молодой возраст больных.
Более рельефная картина аутоиммунитета наблюдалась при исследовании лабораторных показателей.
Отмечено, что неспецифические аутоантитела у здоровых людей, как правило, не выявляются. По нашим наблюдениям, из обследованных пациентов у 36 (40,9%) были обнаружены аутоантитела. Большая часть определяемых аутоантител не превышала титра 1:80. Таким образом, уже на ранних сроках течения НОУ-инфекции отмечалось незначительное повышение в сыворотке крови аутоантител, отражающее наличие неспецифической аутоиммунной реакции.
Из лабораторныхпараметров выявленоувеличенное содержание криоглобулинов, в 2 раза превышающее их уровень у здоровых (0,042±0,0047 опт. ед.; р<0,001).
Хорошо известно, что тромбоциты в организме человека участвуют в процессах свертывания, являясь маркерами гемостаза, а также отражают состояние иммунной системы, снижаясь при иммунодефицитах. Надо полагать, наблюдаемое нами снижение уровня тромбоцитов на 9,3% (224,018±5,93 х10 /мкл, р<0,05) связано в том числе с изменением иммунного статуса.
Альфа-интерфероны сами по себе не обладают сильным противовирусным действием, их эффект осуществляется опосредованно - через синтезированные ферменты и ингибирующие пептиды, которые блокируют процессы транскрипции и трансляции вирусного генома и индуцируют каскад реакций, ведущих к элиминации вирусной РНК [3]. Однако, в ответ на модулирующее иммунную систему действие а-ИФН возникают разнообразные побочные эффекты, многие из которых проявляются аутоиммунными феноменами. Так, во время ПВТ происходит нарастание в большей степени симптомов характерных для аутоиммунных реакций - сухости кожи и слизистых, артралгий и миалгий, астеновегетативного синдрома. Наиболее часто из побочных эффек-
тов ПВТ наблюдались гриппоподобный синдром (98,2%), выпадение волос (61,9%), неврологические и психические нарушения (61,9%), снижение массы тела (57,5%), в 11,5% случаев наблюдалось поражение щитовидной железы от гипотиреоза до АИТ. У 11,2% на фоне ПВТ отмечались бактериальные инфекции, что, возможно, свидетельствует о подавлении фагоцитарного звена иммунитета.
В патогенезе аутоиммунных проявлений, нередко имеющих место при ХГС, лежат иммуно-комплексные реакции. Как известно, у здорового человека идет непрерывное образование и удаление ЦИК из крови путем фагоцитоза при активном участии комплемента. Комплемент, встраиваясь в состав ЦИК, способствует разрыву связей между антигеном и антителом, препятствует образованию крупных нерастворимых агрегатов, при этом удерживает их растворимые формы, легко удаляемые из организма. Причиной избыточного содержания ЦИК при HCV-ин-фекции [5] является избыток вирусного антигена, а образующиеся в недостаточном количестве антитела теряют способность нейтрализовать вирус. ЦИК откладываются в печени и в других органах, провоцируя воспалительные реакции. По мере увеличения ЦИК перестают «справляться» с функциями системы комплемента и фагоцитоза. В этих условиях страдает фагоцитарная активность лейкоцитов.
В нашем исследовании была проведена оценка фагоцитарного звена иммунитета и уровня ЦИК.
Результаты при первичном обследовании больных ХГС показали дефицит ФАН на 13,6% (1,84±0, 13%; р<0,05), общего количества частиц St.aureus, фагоцитированных ней-трофилами в виде снижения АФП, на 33,5% (8117,11±769,03х10 /л; р<0,001) при компенсаторном повышении функционально-метаболической активности нейтрофильных гранулоцитов в спонтанном НСТ-тесте на 65,8% (15,09±1,43%; р<0,01), их резервных возможностей в индуцированном варианте НСТ-теста на 34,7% (54,07±3,12%; р<0,01) и понижении уровня комплементарной активности сыворотки на 28,3% (43,39±1,73Е/мл; р<0,001) на фоне повышенного на 70% содержания ЦиК (0,051±0,005 опт. ед.; р<0,001).
В динамике альфа-интерферонотерапии выявлено достоверное изменение отдельных фагоцитарных показателей по сравнению с контролем, в виде снижения ФАН через 3 месяца на 53,1% (1,00±0,06%; р<0,001), 6 месяцев - на 45,1% (1,17±0, 12%; р<0,001), 9 месяцев - на 46% (1,15±0,14%; р<0,001), 12 месяцев - на 29,6% (1,50±0,14%; р<0,001), 6 месяцев после отмены терапии на 29,6% (1,50±0,19%; р<0,01), АФП на тех же сроках лечения соответственно на 62,5% (4581,44±379,05х106/л; р<0,001), 51,3% (5944,05±547,80х106/л; р<0,001), 58,8% (5030,00±784,23х106/л;р<0,001), 36,5% (7746,93±1085,36х106/л; р<0,01), 50,9% (5989,61±932,61х106/л;р<0,001), ФЧ через 3,
9 месяца терапии и 6 месяцев после ее отмены соответственно на 21,1% (4,52±0,24х106/ л; р<0,01), 23,2% (4,40±0,30х106/л; р<0,01) и 20,6% (4,55±0,33х106/л; р<0,01). Функционально-метаболическая активность нейтрофилов компенсаторно повышалась в спонтанном НСТ-тесте на сроках 3, 6, 9 месяцев лечения и через 6 месяцев после его отмены соответственно на 70,3% (15,5±1,73%; р<0,01), 87% (17,02±1,47%; р<0,001), 68,8% (15,36±2,09%; р<0,01), 70% (15,47±2,50%; р<0,05), в меньшей степени в индуцированном НСТ-тесте через 6 месяцев терапии на 35,4% (54,31±2,80%; р<0,01). На сроке 6 месяцев после завершения курса ПВТ функционально-метаболическая активность нейтрофилов в индуцированном НСТ-тесте оставалась повышенной на 38,4% (55,53±4,12%; р<0,01).
Уровень комплемента понижался на сроках 3, 6, 9 месяцев от начала ПВТ по отношению к уровню у здоровых соответственно на 15,6% (51,08±2,53 Е/мл; р<0,01), 19% (49,00±2,47 Е/ мл; р<0,001), 16,1% (50,77±3,21 Е/мл; р<0,05) на фоне повышения ЦИК на всех контрольных сроках ПВТ на 61,6% (0,048±0,004 опт.ед; р<0,001), 58,3% (0,047±0,002 опт.ед; р<0,001), 77,6% (0,053±0,003 опт.ед; р<0,001), 57,6% (0,047±0,003 опт.ед; р<0,001) с их полным восстановлением к 6 месяцам после отмены а-ИФН.
Таким образом, выявленные изменения в вышеперечисленных параметрах в той или иной степени отражают нарушения иммунного состояния у больных ХВГС, усугубляющиеся на фоне альфа-интерферонотерапии. Выводы
1. Эффективность (СВО) противовирусного лечения ХГС с использованием метода ежедневного введения высоких доз альфа-интерферона в комбинации с рибавирином (достижение стойкого вирусологического ответа) составила 83,7%, наилучшие результаты получены у больных с не-1 генотипом - 97,2%, с 1 генотипом - 65,8%. Отсутствие быстрого вирусологического ответа позволяет прогнозировать неблагоприятный исход лечения.
2. У больных хроническим вирусным гепатитом С наблюдаются аутоиммунные реакции в виде отдельных симптомов и синдромов и в 7,9% случаев аутоиммунные заболевания (тиреоидит, псориаз, красный плоский лишай, синдром Шег-рена) на фоне тромбоцитопении, повышенного содержания криоглобулинов, циркулирующих иммунных комплексов и неорганоспецифических аутоантител.
3. Аутоиммунные процессы при хроническом вирусном гепатите С, сопровождающиеся подавлением фагоцитарных механизмов защиты на фоне снижения общей активности комплемента, модулируются противовирусными средствами в процессе длительной терапии.
Литература
1. Беляева, Н.М. Вирусные гепатиты. Прошлое и будущее / Н.М. Беляева // Лечебная часть, инфекции. - 2004. - №3.- С. 9.
2. Лопаткина, Т.Н. Современная противовирусная терапия хронического гепатита С / Т.Н. Лопаткина // Клиническая фармакология и терапия. - 2002. - №1. - С. 11-14.
3. Маммаев, С.Н. Продукция цитокинов у больных хроническим вирусным гепатитом С на фоне терапии интерфероном-альфа. / С.Н. Маммаев, Е.А. Лукина, С.А. Луговская, А.А. Левина, Ю.О. Шульпекова, М.Е. Почтарь, В.Т. Ивашкин // Клиническая лабораторная диагностика. -2001. - №7. - С. 45-48.
4. Никулкина, Е. Эффективность и переносимость комбинированной терапии пегилиро-ванным интерфероном a-2b и рибавирином у больных хроническим гепатитом С в России / Е. Никулкина, В. Сюткин, Т. Лопаткина, Т. Игнатова, П. Крель, И. Никитин, О. Корочкина, М. Маевская [и др.] // Сб. статей российских авторов «Хронический гепатит С». - С. 4-7.
5. Рабсон, А. Основы медицинской иммунологии / А. Рабсон, А. Ройт, П. Делвз. - М., 2006.
- 920 с.
6. Шахгильдян, И.В. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика) / В.И. Шахгильдян, М.И. Михайлов, Г.Г. Онищенко. - М., 2003. - 165 с.
7. Armstrong, G.L. The past incidence of hepatitis C Virus infection: implications for the future burden of chronic liver disease in the United States / G.L. Armstrong // Hepatology. - 2000.
- P. 777-782.
8. Fried, M.W. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection / M.W. Fried // N. Engl. J. Med. - 2002. - Vol. 347. - P 975-982.
9. National Institute of Health Consensus development conference statement: Management of hepatitis C: 2002 // Hepatology. - 2002. - Vol. 36, № 5, Suppl.l. - P 3-19.
10. Wasley, A. Epydemiology of hepatitis C virus: geographic, differences and temporal trends / A. Wasley, М. Alter // Semin. Liver Dis. - 2000.
- Vol. 20. - P. 1-16.
11. Wong, J.B. Estimating future hepatitis C morbidity, mortality, and costs in the United States / J.B. Wong // Am. J. Publ. Health. - 2000. - Vol. 90. - P. 1562-1569.
НЕКОТОРЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО ВЛИЯНИЯ ПРОТИВОВИРУСНОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВИРУСНОМ ГЕПАТИТЕ С
В.Х. ФАЗЫЛОВ, Я.Р. МАНГУШЕВА, Э.Г. ГАЙФУЛЛИНА
Изучены эффективность и взаимосвязи аутоиммунных реакций с фагоцитарными механизмами защиты на фоне индукционной комбинированной противовирусной терапии хронического вирусного гепатита С (ХГС). Обследованы 88 пациентов с ХГС в возрасте от 18 до 49 лет, у 62,5% из них предполагаемые сроки инфицирования составляли до 5 лет.
Установлено, что у больных ХГС в 7,9% случаев встречаются аутоиммунные заболевания на фоне присутствия различных маркеров ау-тоиммунитета. Аутоиммунные реакции при хГс сопровождаются подавлением фагоцитарной активности лейкоцитов при снижении активности комплемента, усугубляются под влиянием аль-фа-интерферонотерапии и отражают нарушения фагоцитарного звена иммунитета.
Наилучшие результаты лечения ХГС получены у больных с не-1 генотипом. Отсутствие быстрого вирусологического ответа позволяет прогнозировать неблагоприятный исход лечения.
Ключевые слова: НСУ-инфекция, иммунопа-тогенез,противовирусная терапия
SOME MECHANISMS IMMUNOMODULLATING INFLUENCE OF ANTIVIRUS THERAPY AT CHRONIC VIRUS HEPATITIS C
FAZYLOV V.H., MANGUSHEVA Ya. R.,
GAIFULLINA E.G.
Efficiency and interrelations of autoimmune reactions with phagocyte mechanisms of protection on a background of induction combined antiviral therapy of chronic viral hepatitis C are investigated. 88 patients with chronic hepatitis C in the age of 18-49 years are surveyed, 62,5 % of them had prospective terms of infection till 5 years.
It is established, that in patients with chronic hepatitis C in 7,9 % of cases there can be autoimmune diseases on a background of presence of various autoimmunity markers. Autoimmune reactions at chronic hepatitis C are accompanied by suppression of phagocytes activity of leukocytes at decrease in activity of complement, are aggravated under influence of alpha-interferon therapy and reflect infringements of phagocyte link of immunity.
The best results of treatment of chronic viral hepatitis C are received from patients with not-1 genotype. Absence of the fast virologic answer allows predicting a failure of treatment.
Key words: the HCV-infection, immunopatho-genesis, antiviral therapy
