CC BY
77
Некоторые аспекты оседания дрожжей
Ю.И. Шишков
ГУ ВНИИпивобезалкогольной и винодельческой промышленности (Москва)
Многократная генерация дрожжей обусловила специфическое требование к ним: кроме обладания высокой продуктивностью они должны обеспечивать хорошее осветление пива, т.е. быстро оседать на дно чана. Плохая оседае-мость дрожжей при главном брожении затрудняет фильтрование пива и придает ему дрожжевой привкус, что обусловливает важность этого вопроса. Поскольку оседанию подвергаются диспергированные клетки, то позднее его наступление приводит к более полному выбраживанию сусла. Следовательно, от оседаемости дрожжей в значительной степени зависят степень сбраживания сусла, осветление пива, количество собранных дрожжей для последующей генерации, эффективность фильтрования пива и его органо-лептические свойства.
Считается, что механизм агрегирования и оседания дрожжей связан с молекулярной структурой и функционированием оболочек клеток, в конечном итоге определяющих их физико-химические поверхностные параметры (электрический заряд клетки, двойной электрический слой и электрохимический потенциал), от которых зависят биоэлектрические процессы, например характер контактов между клетками. Доказано, что состав сусла в значительной степени влияет на химический состав выращенных в нем дрожжевых клеток, от которого зависит физиоло-го-биохимическая активность организмов, в свою очередь влияющая на мем-браногенез.
В ранних работах, посвященных агрегированию и оседанию дрожжей при главном брожении, показано, что начало и ход этих процессов происходят в стационарной фазе их роста, а точнее, они начинают образовывать хлопья спустя 2-3 ч после начала стационарной фазы. Агрегирование и оседание дрожжей имеют индуцибельный характер. Живая дрожжевая клетка обладает способностью снижать агрегирующую способность и жизнеспособность с ростом числа генераций, что свидетельствует об ухудшении физиологического состояния дрожжей. Старые клетки из-
за большего размера будут оседать быстрее, чем молодые и среднего возраста. Поэтому последующее неоднократное использование в производстве осевших клеток может привести к селекции субпопуляции старых клеток, которые могут изменить ход последующего брожения. В нормальной популяции должно быть 50 % только что отпочковавшихся дочерних клеток, имеющих один рубец рождения; 25 % дрожжей, делившихся один раз и имеющих рубец рождения и один почечный рубец; 12,5 %, имеющих рубец рождения и два почечных рубца; 6,25 %, имеющих рубец рождения и три рубца, и т.д. [1]. Следовательно, при каждом последующем использовании съемных дрожжей пивовар должен учитывать возраст культуры во избежание приготовления пива с отклоненными от нормы физико-химическими характеристиками и неудовлетворительными ор-ганолептическими свойствами.
В соответствии с большим разнообразием культур дрожжей, их биологических свойств, состава сусла и его концентрации интенсивность процессов агрегирования и оседания клеток может варьировать в очень широких пределах. Большого внимания в этом отношении заслуживают генетические особенности дрожжей, поскольку они могут существенно влиять на эти процессы. Так, в культурах Sacch. свгву1-siae выделены три доминантных и три рецессивных гена, ответственных за агрегирование клеток. Их экспрессия зависит от одного или нескольких су-прессорных генов. Проведение клонирования гена, ответственного за агрегирование клеток, его изучение показали, что этот ген соединен с геном АДЕ1 [2]. Авторы данной работы на основании клонирования и последующего анализа гибридов пришли к выводу, что гипотетические супрессоры агрегирования дрожжей и функционально связанное с этим процессом оседание клеток находятся, по крайней мере, частично в штамме, который обладает доминантным по этому признаку геномом.
Анализ изложенного материала позволяет сделать обобщение: агрегирование дрожжей и последующее за этим
процессом их оседание существенно зависят от факторов внешних условий ведения процесса главного брожения, поскольку они в совокупности влияют на формирование химического состава клеток, который, в свою очередь, обусловливает их биохимическую функцию и определяет количественный и качественный состав поверхностной структуры, а следовательно, электрофизические параметры организмов.
В настоящее время накоплен большой экспериментальный материал по молекулярной организации поверхностных структур микроорганизмов. Установлена строгая специфичность химического состава клеток и цито-плазматических мембран для каждого вида микроорганизмов. Соотношение компонентов этих структур весьма непостоянно и зависит от условий культивирования микроорганизмов и фазы роста.
Несмотря на отсутствие постоянства соотношения компонентов клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, можно констатировать включение в их состав минеральных веществ, белков, липидов, полисахаридов и липопро-теидов. В связи с этим можно считать, что клеточная стенка представляет собой амфотерный полиэлектролит, поведение которого определяют вещества, ее формирующие.
Поверхностный заряд микроорганизмов формируется за счет диссоциации ионогенных групп и определяется соотношением щелочных и кислых групп. При определении вклада ионо-генной группы в значение общего поверхностного электрического заряда необходимо учитывать значение их элетроотрицательности, которая представлена в виде ряда Полинга: NH2 <
< он < ок < осок < сн, < сн <
3 6 5
< галоиды < СО < С№
У поверхностных структур значительного большинства микроорганизмов отмечается существенное преобладание кислотных групп, придающих клеткам отрицательный поверхностный заряд. Следует отметить отсутствие постоянства соотношения компонентов оболочки клеток, а поэтому их электрофизические параметры изменяются в зависимости от фазы роста. Однако весь накопленный экспериментальный материал, оценивающий величину поверхностного заряда клеток, свидетельствует о его небольшой величине, находящейся в пределах от -20 до -40 мВ. Вследствие того что разница в величине этого физического параметра между отдельными штаммами незначительна и он изменяется в зависимости от условий выращивания культуры, поверхностный заряд нельзя считать штаммо-вым показателем.
5•2006
12
Поверхностный электрический заряд клеток важен для установления межклеточных контактов. Контакт между клетками определяется главным образом двумя физическими факторами: силами притяжения Ван-дер-Ваальса и противодействующими им электростатическими силами отталкивания, возникающими между одноименно заряженными телами. При равновесии вандерваальсовых сил притяжения и отталкивания, обусловленных действием одноименных (в данном случае отрицательных) поверхностных зарядов, межклеточное расстояние составляет около 10 нм [3]. Эти силы зависят от величины заряда и могут изменяться под влиянием гидродинамических факторов, вязкости среды и др. Уменьшение расстояния между соседними клетками может играть существенную роль в агглютинации клеток, вызывающей, в свою очередь, их оседание при сбраживании сусла.
Влияние биохимических и микробиологических факторов на оседание дрожжей сочетается с физико-химическими процессами, связанными с электрофизическими параметрами оболочки клеток, изменяющихся под влиянием внешних условий. Однако, прежде чем рассматривать факторы, влияющие на это свойство дрожжевых клеток, необходимо точно сформулировать само понятие коагуляционной способности дрожжей, включающей их агрегирование и оседание.
Итак, оседание обусловлено физическим контактом между частицами с образованием крупных агрегатов, т.е. имеет место процесс коагуляции, вызванной взаимодействием коллоидов раствора, в том числе и клеток. Коллоидными растворами называют микрогетерогенные дисперсионные системы с частицами размером от 1 до 100 мкм. Их характеризует не только наличие поверхности раздела между дисперсной фазой (каждой частицей) и дисперсионной средой (растворителем), но и малая устойчивость.
Теория и практика образования коллоидных систем, их устойчивость и коагуляция подробно изложены в специализированной литературе [4]. Тем не менее, согласно теории коагуляции, при броуновском движении коллоидные частицы свободно сближаются на расстояние до 10-5 см (в среднем), однако дальнейшему их сближению препятствует так называемое расклинивающее давление, возникающее в тонких слоях воды, находящихся между двумя поверхностями. Оно возникает под влиянием электростатических полей, создаваемых ионами, расположенными на поверхности коллоидных частиц. Прилегающие к ним молекулы воды
сильнее поляризуются и располагаются более упорядоченно, придавая прилегающему к частице слою воды повышенные вязкость и упругость, что препятствует объединению частиц. Величина расклинивающего давления, образованного жидкой прослойкой, зависит от расстояния между поверхностями. Если частицы обладают достаточной энергией для преодоления давления расклинивания, то на расстоянии, равном диаметру частиц (пример-но10-7-10-8 см), начинают преобладать силы межмолекулярного притяжения, и частицы объединяются.
Самопроизвольная коагуляция протекает медленно, и повышением скорости движения частиц можно добиться преодоления ими расклинивающего давления. Движение частиц ускоряется также путем повышения температуры раствора, его перемешиванием и концентрацией коллоидных частиц. Проведение этих технологических операций обеспечивает рост числа эффективных столкновений между коллоидными частицами, приводящих к их агрегированию.
Этот эффект может быть достигнут введением в раствор минеральных веществ и органических ионов [4]. Опытным путем было найдено, что при одинаковой валентности коагулирующее действие ионов коррелирует с величиной их радиусов, т.е. чем больше радиус ионов, тем выше их коагулирующая способность. Существенное значение имеет валентность катионов: с ее ростом увеличивается их коагулирующее действие. Подобное действие наблюдается и при росте валентности катионов. По убыванию коагулирующей способности одинаковой валентности ионы располагаются в лиотропных рядах: для одновалентных катионов — Cs+ >
> ВД+ > К+ > №+ > Li+; для двухвалентных катионов — Ва+ > Sr+ > Са2+ >
> М£2+; для анионов — С1- > Вг- >
> N0^ > I- > СШ-.
Следует также отметить весьма своеобразное коагулирующее действие, проявляемое органическими ионами. Их влияние на коагуляцию более интенсивно, чем соответствующее по валентности ионов неорганических электролитов. Это объясняется высокой адсорбционной способностью громоздких органических ионов, обладающих большой поляризуемостью. Следовательно, они в большей степени по сравнению с неорганическими ионами способствуют коагуляции частиц и их агрегированию.
Из общих моментов, характеризующих влияние ионов на коагуляцию, необходимо отметить, что эффективность коагуляции зависит: от аддитивности коагулирующего действия ионов;
антагонизма действия, выраженного в ослаблении действия ионов; синергизма действия. Однако при коагуляции частиц, вызываемой смесями ионов, обычно наблюдаются синергизм или антагонизм; аддитивность представляет собой редкое явление.
Все виды взаимодействия частиц, приводящие к агрегированию, принято считать коагуляцией, подразумевающей определенную степень дисперсности веществ, находящихся во взвешенном состоянии. Ближе всех стоящих к биологическим объектам — коллоидные растворы, включающие высокомолекулярную дисперсную фазу и жидкую дисперсионную среду (коллоидные растворы белков, полисахаридов и др.). По этому признаку зеленое пиво — коллоидный раствор, так как представляет собой дисперсную систему с размером частиц от 1,0 до 100 мкм. Такие системы характеризуются не только наличием поверхности раздела между дисперсной фазой (каждой частицей или клеткой) и дисперсионной средой, но и малой устойчивостью, т.е. частицы выпадают в осадок.
В соответствии с представлениями о строении коллоидных частиц можно считать дрожжевую клетку ядром коллоидной частицы, имеющей отрицательный заряд. В водном растворе она притягивает противоположно заряженные частицы. Начинается процесс адсорбции противоионов (например, белков), в результате которого устанавливается динамическое равновесие между адсорбированными и свободными ионами. Коллоидная клетка и адсорбированный слой в сусле приобретают электрокинетический потенциал, отличный от этого электрохимического параметра клетки в сусле до процесса сорбции частиц. Напомним, что электрокинетический потенциал представляет собой электрический потенциал, возникший на границе между адсорбционным (неподвижным относительно частицы) и диффузным (подвижным) слоями противоионов. Остаток проти-воионов удерживается электростатическими силами притяжения вблизи клетки с адсорбированными противо-ионами, образуя диффузный слой. Его толщина зависит от ионной силы раствора: чем она выше, тем толщина диффузного слоя меньше. Концентрация противоионов в диффузном слое убывает, и электрический потенциал диффузного слоя падает до нуля. Устойчивость коллоидного раствора (не выпадает в осадок) зависит от величины электрокинетического потенциала, формируемого частицей (клеткой) с адсорбированными противоионами. С его повышением увеличиваются силы взаимного отталкивания между колло-
5 • 2006
13
идными клетками, препятствующие их объединению при столкновениях.
Специфическая особенность коллоидной системы состоит в огромном развитии свободной поверхностной энергии. По второму закону термодинамики всякая свободная энергия стремится к минимуму. Данный закон применим к избыточной поверхностной энергии коллоидных систем, лежащих в основе адсорбции. Это заслуживает большого внимания, поскольку на поверхности клеток могут адсорбироваться поверхностно-активные вещества сбраживаемого сусла. К последним относят аминокислоты, жирные кислоты, белки и т.п. В клетках имеется большое количество поверхностей, на которых идут адсорбционные процессы: поверхностная оболочка, разнообразнейшие мембраны, ядра, митохондрии, вакуоли, а также коллоидные частицы — белки протоплазмы. Вещества, адсорбирующиеся на поверхности коллоидных частиц, могут уменьшать поверхностную энергию из-за снижения поверхностного натяжения или уменьшения общей энергии. В итоге происходит агрегирование коллоидных частиц и их оседание.
Изложенный материал указывает на большое разнообразие факторов и сложность их взаимодействия между собой, приводящих к агрегированию частиц и в конечном счете обусловливающих различные подходы к объяснению механизма коагуляции частиц. В настоящее время общепризнана физическая теория коагуляции частиц ионами неорганической и органической природы. Она базируется на рассмотрении баланса молекулярных сил притяжения и сил ионно-электростати-ческого отталкивания.
Эта закономерность имеет очень большое технологическое значение, так как дает возможность осуществить быстрое осаждение слабокоагулируе-мых дрожжей при главном брожении. Возможность применения физической теории коагулирования веществ к плохо оседающим дрожжам подтверждается результатами эксперимента, сущность которого состояла в индуцировании этого процесса катионами кальция и магния, которые при одной и той же валентности по своему коагулирующему действию существенно различаются вследствие значительного различия в величине ионных радиусов. Для иона кальция радиус равен 1,06 А, а для иона магния — 0,78 А.
Для понимания механизма индуцирования этими катионами процесса агрегирования, а затем и оседания дрожжей напомним очень важный аспект физической теории коагуляции: в результате взаимодействия катионов
кальция и магния с электрогенными участками поверхности клеток за счет коротко действующих вандерваальсо-вых сил притяжения происходят кон-формационные изменения, приводящие к агрегированию и оседанию клеток.
Методика эксперимента состояла в следующем. Из производственного чана, содержащего после 120 ч брожения отброд, равный 5,8 % массовой доли сусла и 13,4 млн кл/мл взвешенных дрожжей расы Sacch. саrbвrgiвns-is S-львовская, было отобрано 30 л молодого пива, которое, в свою очередь, разделяли на три равные части. В одну емкость вносили 0,0025 г/л хлористого кальция, во вторую — 0,005 г/л сернокислого магния, а третья служила контролем. Через три дня в сбраживаемом сусле с ионами кальция количество взвешенных клеток дрожжей было 5,6 млн кл/мл, и отброд составлял 3 %. В сбраживаемом сусле с ионами магния только на пятый день отброд был равен 3,1 %, а концентрация взвешенных дрожжей — 6,4 млн кл/мл. В контроле через 10 сут брожения эти показатели имели значение 4,3 % и 11,3 млн кл/мл. Количество мертвых клеток в контрольном и опытных вариантах эксперимента было практически одинаковым и находилось в интервале от 6 до 7,2 %.
Осаждение взвешенных клеток к концу главного брожения до 3,0 млн кл/ мл нецелесообразно, так как существенно замедляется процесс дображивания и соответственно снижается эффективность сложных биохимических превращений веществ, определяющих вкус и аромат пива. Опытно-промышленное приготовление пива с добавками указанных электролитов соответствует не только лабораторным данным, но и результатам исследования влияния катионов Са и на оседаемость дрожжей [5, 6]. Механизм индуцирования коагуляции дрожжей этими катионами в цитируемых работах объясняется образованием мостиков между двумя клетками вследствие формирования ионной связи катионов с карбоксильными или фосфатными группами поверхностных структур клеток.
Таким образом, коагулирующая сила ионов кальция существенно превос-
Таблица 1
Степень сбраживания, % гН, рН
5,7 19,5 5,0
11,58 18,0 4,74
25,0 17,0 4,7
36,75 15,5 4,53
52,65 11,0 4,41
61,05 10,0 4,37
66,25 9,5 4,31
67,45 9,5 4,24
ходит этот показатель ионов магния, что выразилось в использовании более низких концентраций ионов кальция по сравнению с ионами магния, указывающее, в свою очередь, на меньшую пороговую концентрацию ионов кальция. Пороговая концентрация показывает, какое минимальное количество концентрации электролита необходимо для начала коагуляции. Эта величина минимальной концентрации, очевидно, отвечает сжатию двойного электрического слоя до той степени, когда он перестает служить энергетическим барьером, предохраняющим частицы от слипания под действием молекулярных сил притяжения.
Из общих моментов, характеризующих коагуляцию клеток, следует отметить, что кинетика этого процесса в значительной степени обусловлена физио-лого-биохимической активностью дрожжей, зависящей от химического состава организма, физико-химических свойств сусла и других внешних факторов. Значит, варьированием биохимическими и физико-химическими свойствами сусла можно управлять физиологическим состоянием клеток, а следовательно, их кинетикой агрегирования и оседания, что имеет существенное значение для технологии приготовления пива.
Известно, что процесс главного брожения сопровождается количественным и качественным изменением состава сусла, обусловливающим смещение активной кислотности в сторону кислых значений рН и уменьшение величины окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) сбраживаемого сусла. Напомним, что ОВП характеризует направленность протекающих в сусле окислительно-восстановительных процессов. Восстановительную способность среды принято выражать через концентрацию водорода, а окислительную — через концентрацию кислорода. Из-за маленькой концентрации Н2 ее обозначают через гН2 = [Н2]. Величина гН2 может варьировать от 0 до 42. При равновесии окислительных и восстановительных процессов значение гН2 равно 28. При значениях гН2 от 28 до 42 преобладает процесс окисления. Чем меньше гН2 величины 28, тем больше восстановительная способность среды. Зависимость ОВП от величины гН2 и величины водородных ионов (рН) выражается уравнением гН2 = Еь + 0,059рН.
Приведем известные экспериментальные данные, убедительно доказывающие зависимость гН2 от степени сбраживания сусла (табл. 1, [7]).
Эта закономерность имеет большое технологическое значение, поскольку она указывает на изменение физиолого-биохимической активности
5 • 2006
14
Таблица 2
Продолжительность главного Варианты опыта
Показатель Контроль Питательная добавка
брожения, сут 1 2 3
Максимальное накопление дрожжей в процессе главного брожения, млн кл/ мл 3 30,9 31,0 36,5 41,8
Количество дрожжей в зеленом пиве перед началом дображивания, млн кл/ мл 8 9,3 8,9 8,3 5,6
Значение гН2 начального сусла — 19,8 — — —
Значение гН2 зеленого пива 8 10,7 10,5 10,0 9,6
дрожжей в процессе брожения, сопровождаемое соответствующим изменением состава поверхностных структур, а следовательно, отклонением у них электрофизических параметров от первоначальных показателей, определяющих показатели ОВП клеток и обусловливающих их агрегирование. Известно, что микроорганизмы в период роста и деления формируют свой ОВП, который характеризует их жизнеспособность вследствие того, что этот показатель зависит от состава клеточных мембран, существенно влияющих на эффективность функционирования транспортных систем организмов.
Таким образом, ОВП клеток коррелирует с их физиолого-биохимиче-ской активностью, влияющей на мем-браногенез, который, в свою очередь, определяет агрегирующую способность данных организмов, что подтверждается сравнительными экспериментами приготовления пива, различающимися между собой тем, что 12%-ное сусло перед сбраживанием обогащалось различными питательными добавками — смесью неорганических солей, вносимой из расчета 1,0 мл в 1,0 л сусла и содержащей (мг/л): сульфат цинка — 10; сульфат магния — 20; сульфат марганца — 4; хлорид кальция — 20; диаммоний фосфат — 100; гидролиза-том дрожжей, 0,05 г которого растворяли в 20 мл сусла с последующим его внесением в 1,0 л сусла, содержащего также вышеуказанную неорганическую питательную добавку; смесью аква-комплексных соединений в количестве 1,0 мл в 1,0 л сусла, содержащей (мг/л): цинк с глутаминовой кислотой — 10; магний с аспарагиновой кислотой — 20; марганец с метионином — 4; кальций с фосфатом — 20 (концентрации биокомплексов даны по металлу). Аква-комплексы приготовляли по способу, описанному в работе [8]. Эксперимент проводили с использованием дрожжей Sacch. сarlbergiensis, раса S-львовская. Сусло засевали дрожжами в количестве 12 млн кл/мл. Процесс главного брожения проводили при температуре 9 °С, дображивание — при 2...3 °С в течение 30 сут. Результаты исследований приведены в табл. 2.
Данные табл. 2 показывают, что изменение физиолого-биохимической активности дрожжей сопровождается уменьшением гН2 сусла и выраженной оседаемостью клеток. Наибольший эффект достигается при обогащении сусла аквакомплексами. Наблюдаемый высокий позитивный эффект от применения аквакомплексов можно объяснить вызываемой ими множественной корреляцией, связанной с увеличением дрожжегенерации, осуществляемой формированием клеток с измененным
химическим составом, приводящим к повышению физиолого-биохимиче-ской активности дрожжей, влияющей не только на интенсивность брожения сусла и глубину его выброда, но и на повышение скорости их оседания.
Представляет интерес факт, наблюдаемый только при использовании в сусле аквакомплексных соединений биогенных металлов, заключающийся в более раннем заканчивании формирования высоких завитков по сравнению с другими вариантами эксперимента. Это свидетельствует, с одной стороны, о повышенной бродильной активности дрожжей, а с другой — о начале коагуляции клеток.
Таким образом, повышение физио-лого-биохимической активности дрожжей, сопровождаемой изменением состава поверхностных структур, коррелирующего с изменением значения их ОВП, усиливает процессы агрегирования клеток и оседания клеток.
Дрожжи характеризуются высокой степенью диссоциации, приводящей к гетерогенности популяции. Диссоциация — это расщепление однородной культуры на варианты, отличающиеся от исходной формы популяции стойкими изменениями ряда признаков: фи-зиолого-биохимических и морфологических. Для бактерий установлено, что диссоцианты отличаются постоянным характером таких изменений и высокой частотой возникновения и реверсии порядка 10-2—10-4 на одну клетку на одну генерацию. Первичные фенотипические изменения при диссоциации однородной популяции происходят в клеточной оболочке, т.е. в размере и составе клеточной стенки; в насыщенности липидами, входящими в состав мембраны [9].
Вышесказанное, очевидно, в полной мере можно отнести и к дрожжам. В пользу последнего предположения свидетельствуют данные, показывающие увеличение вариабельности культуры дрожжей при ее длительном хранении. Весьма существенные изменения в клеточной оболочке, в свою очередь, приводят к изменению поверхностного электрического заряда клетки, который формирует ее электрокинетический потенциал в растворе, а следовательно,
ОВП. Проведенные нами исследования с гетерогенными продуцентами биологически активных веществ достоверно указывают на существование взаимосвязи между электрокинетическим потенциалом микроорганизмов и их продуктивностью по целевому продукту.
Совокупность литературных данных и результатов собственных исследований позволяет констатировать: физиолого-биохимическая активность дрожжей влияет на показатель их ОВП и, как следствие, на кинетику коагуляции дрожжей. Накопленный большой экспериментальный материал по коагуляции дрожжей в процессе главного брожения свидетельствует о том, что их физиологическое состояние, агрегация и оседание ухудшаются с каждой последующей генерацией. По-видимому, это связано с диссоциацией дрожжей, приводящей к накоплению в популяции клеток вариантов, различающихся по физиолого-биохимической активности и электрофизическим параметрам, обусловливающим способность агрегирования клеток, функционально связанного с процессом их оседания.
ЛИТЕРАТУРА
1. Смарт К. Спутник пивовара. 2001. № 10. С. 10-17.
2. Steensman H Jde. et al. 1-nd Yeast Gen. Proc. Alko. Symp. Helsinki, June 9-10, 1987.
3. Поликар А. Молекулярная цитология мембранных систем животной клетки. — М.: Мир, 1972. С. 86.
4. Воюцкий С.С. Курс коллоидной химии. — М.: Химия, 1976. С. 269-281.
5. Покровская Н.В., Каданер Я.Д. Биохимическая и коллоидная стойкость пива. — М.: Пищевая промышленность, 1978. С. 105-111.
6. Pollok J.R. A Brewing Science. 1981. T. 1,2.
7. Булгаков Н.И. Биохимия солода: — М.: Пищевая промышленность, 1965. С. 399-409.
8. Шишков Ю.И. Аквахелат, способ получения аквахелата, способ модулирования характеристики культуры клеток, культуры ткани, одноклеточного организма или многоклеточного организма и транспортная система. Патент 2115657 РФ.
9. Милько Е. С. Диссоциация бактерий и устойчивость продуцентов//Биофизика микробных популяций. — Красноярск, 1987. С. 34.
