CC BY
27
УДК 543.544:546.13:612.1
О.М. Журба А.Н. Алексеенко С.Ф. Шаяхметов 2
НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЛОРЭТАНОЛА В КРОВИ
1 Ангарский филиал Восточно-Сибирского научного центра экологии человека СО РАМН - Научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека (Ангарск) 2 ГБОУДПО «Иркутская государственная академия последипломного образования» (Иркутск)
Разработана методика определения массовой концентрации хлорэтанола в крови в диапазоне 0,05—10 мкг/см3. Методика основана на извлечении хлорэтанола диэтиловым эфиром с помощью жидкостно-жидкостной микроэкстракции и последующим хроматографированием на капиллярной колонке «Polyethylene Glycol Teiephtalate» с использованием электронно-захватного детектирования. Относительная погрешность методики не превышает 30 %.
Ключевые слова: хлорэтанол в крови, жидкостно-жидкостная микроэкстракция, капиллярная газо-жидкостная хроматография
SOME ASPECTS OF DETERMINATION OF CHLOROETHANOL IN THE BLOOD
О.И. Zhurba А.ГЧ. Alexeyenko S.F. Shayakhmetov 2
1 Angarsk Branch of East Siberian Scientific Center of Human Ecology SB RAMS - Scientific Institute
of Occupational Medicine and Human Ecology, Angarsk 2 Irkutsk State Academy of Postrgaduate Education, Irkutsk
A procedure for the determination of the mass concentration of chloroethanol in blood in the range of 0.05— 10 pg/cm3 has been developed. The procedure is based on the liquid-liquid microextraction of chloroethanol by diethyl ester following by the chromatographic analysis with capillary column «Polyethylene Glycol TP» and microelectron-capture detection. Relative error of the procedure is less than 30 %. Key words: chloroethanol in blood, liquid-liquid microextraction, capillary gas-liquid chromatography
Для медицины труда особенно важный аспект проблемы — недостаточность сведений о закономерностях формирования профессиональных нейроинтоксикаций в отдаленном периоде на химических предприятиях [1]. Особенностью интоксикации нейротропными ядами является отсутствие полного восстановления здоровья, несмотря на прекращение контакта с токсическими веществами. На ОАО «Саянскхимпласт» современное и крупнотоннажное производство — это производство винилхлорида (ВХ) и поливинилхлорида
ЭЧ СО РАМН былипроведены исследования на данном предприятии [3]. Исходя из технологического регламента, основными химическими соединениями, загрязняющими воздух рабочей зоны в производстве ВХ и ПВХ, являются винилхлорид, 1,2-дихлорэтан (ДХЭ), хлороводородиполивинилх-лорид. ВХ и ДХЭ в воздухе присутствуют в виде паров, всасываются через желудочно-кишечный тракт, дыхательные пути, кожные покровы, проявляют психотропное и нейротоксическое действие
Одним из современных методов оценки воздействия органических веществ на организм человека является биомониторинг [5, 9, 10, 13, 15]. Для этого необходимо не только контролировать содержание веществ в воздухе рабочей зоны, но и содержание веществ и их метаболитов в биологических средах организма человека (кровь, моча).
Основными метаболитами винилхлорида и 1,2-дихлорэтана являются монохлоруксусная
кислота и продукт ее детоксикации — тиодигли-колевая кислота. Монохлоруксусная кислота в организме теплокровных животных, отравленных 1,2-дихлорэтаном и винилхлоридом, может образовываться только из хлорэтанола. Это косвенно подтверждается и тем, что в моче мышей, отравленных хлорэтанолом, также обнаруживаются монохлоруксусная кислота и тиодигликолевая кислота [4]. Следовательно, есть основания полагать, что одним из основных промежуточных метаболитов винилхлорида и 1,2-дихлорэтана в организме теплокровных является хлорэтанол, который в дальнейшем метаболизируется до монохлоруксусной кислоты. Необходимо контролировать содержание хлорэтанола в крови при отравлении винилхлоридом и 1,2-дихлорэтаном, который представляет собой промежуточный метаболит этих веществ.
Среди литературных данных по определению хлорэтанола в биосредах описана лишь одна методика газохроматографического определения хлорэтанола в крови крыс, основной принцип которой заключается в жидкостной экстракции хлорэтанола диэтиловым эфиром с дальнейшей многократной очисткой экстракта. Анализ одной пробы длится 1,5 часа. Предел обнаружения составляет 0,1 мкг/см3 [4]. Пробоподготовка в указанной методике очень длительная и трудоемкая, разделение компонентов смеси неудовлетворительное, что и послужило постановке цели настоящей работы — разработка более простой, экспрессной, чувствительной методики определения хлорэтанола в крови с использо-
ванием современных методов пробоподготовки и газовой хроматографии: жидкостно-жидкостной микроэкстракции и капиллярной газо-жидкостной
МЕТОДИКА
Работу выполняли на газовом хроматографе Agilent 7890А с микроэлектронно-захватным детектором, снабженным автоинжектором Agilent 7683, позволяющим регулировать погружения иглы хроматографического шприца в виалу.
Использовали следующие реактивы: хлорэтанол с содержанием основного вещества 98 % фирмы Flu-ka, хлорид натрия, эфир диэтиловый марки ч.д.а.
Анализ проводили следующим образом. В сте-
помещали 0,36 г хлорида натрия, 1 см3 пробы, 0,5 см3 диэтилового эфира, закрывали ее пластмассовой завинчивающейся пробкой с тефлонированной мембраной (септой), интенсивно встряхивали на мульти-вортексе в течение 5 мин., затем ставили ее в центрифугу и центрифугировали при 3000 об./ мин в течение 10 мин. После центрифугирования виалу помещали в автоинжектор, который отбирал 5 мкл верхнего органического эфирного слоя
на определенной глубине и вводил в испаритель
фирования приведены в таблице 1.
Управление работой хроматографа и автоинжектора, а также запись и обработка хромато-граммы осуществлялись с помощью программы GC ChemStation.
Для проведения количественного расчета кон-
ровки по стандартным растворам в сыворотке крови. Градуировочная характеристика, выражающая зависимость площади хроматографического пика от концентрации (мкг/см3), установлена по 5 сериям стандартных растворов хлорэтанола в сыворотке крови. Стандартные растворы готовили методом разбавления исходного водного раствора хлорэтанола с концентрацией 116 мкг/см3 сывороткой крови.
РЕЗУЛЬТАТЫ
При выборе условий хроматографирования были опробованы капиллярные колонки разной полярности (НР-5 — (5% Phenyl)-methylpolysilox-ane, HP-FFAP — Polyethylene Glycol Terephtalate); различные температурные режимы (изотермический и с программированием температуры),
Таблица 1
Условия газохроматографического разделения
Условия Значения
Колонка HP-FFAP Polyethylene Glycol TP 50 м х 320 мкм, толщина фазы - 0,5 мкм
Газ-носитель Азот особой чистоты, скорость потока через колонку 2 см3/мин
Температурный режим Программирование, 90 °С с выдержкой 1 мин, подъем со скоростью 5 °С/мин до 130 °С с выдержкой 1 мин
Режим ввода 160 °С, импульсный ввод 40 p.s.i. 0,75 мин; деление потока - 1 : 5
Режим детектора 350 °С, скорость поддува азота 60 см3/мин
Рис. 1. Совмещенные хроматограммы растворов хлорэтанола в диэтиловом эфире с концентрациями в диапазоне 0,1202-12,02 мкг/см3.
два вида детекторов (пламенно-ионизационный и микроэлектронно-захватный). В результате опробования установлено, что оптимальное разделение осуществляется на капиллярной колонке HP-FFAP — Polyethylene Glycol Terephtalate в режиме программирования температуры. Лучшая чувствительность и селективность достигается при электронно-захватном детектировании, чем при пламенно-ионизационном детектировании (0,05 и
хлорэтанола приготовлены три стандартных раствора хлорэтанола в диэтиловом эфире в диапазоне 0,12 — 12,02 мкг/см3, проведен хроматографический анализ данных растворов и записаны хроматограм-мы, представленные на рисунке 1, затем рассчитаны хроматографические параметры (табл. 2).
Жидкостно-жидкостная экстракция является одним из традиционных методов разделения и концентрирования [7]. Ее часто используют в сочетании с дальнейшим упариванием растворителя, что в свою очередь приводит к увеличению продолжительности анализа, использованию больших объемов экстрагентов высокой чистоты, чаще всего дорогостоящих и токсичных, кроме того, возрастает вероятность потери определяемых веществ. Преимуществами жидкостно-жидкостной микроэкстракции (ЖЖМЭ) являются малые объемы экс-трагентаот50мклдо 1 мл, экономия растворителей, миниатюризация воплощения процесса, совмещение отдельных стадий процесса, экспрессность.
Для совмещения отдельных стадий анализа (внесение пробы, реактивов и экстрагента, встряхивание на мульти-вортексе, центрифугирование, отбор и ввод аликвотной части экстракта в хроматограф) , экономного расхода экстрагента и использования автоинжектора при вводе пробы в хроматограф нами была выбрана емкость — стандартная хроматографическая виала на 2 см3, снабженная закручивающейся крышкой с септой. С учетом объема виалы эмпирически выбраны объемы жидкой фазы (пробы) и органической фазы (экстрагента), которые составили 1 и 0,5 мл соответственно. В качестве экстрагента использовался диэтиловый эфир, который хорошо извлекает неполярные и полярные соединения. Для выбора оптимальных условий ЖЖМЭ проведен анализ стандартного раствора хлорэтанола при разных количествах хлорида натрия, который способствует уменьшению растворимости хлорэтанола в водной фазе, при
различной продолжительности экстракции (встряхивании на мульти-вортексе). Было установлено, что максимальная площадь пика достигается при количестве хлористого натрия 0,36 г, что близко к его предельной растворимости в водной фазе, и времени встряхивания 5 мин (рис. 2,3). Для лучшего разделения фаз после экстракции и для очистки экстракта использовали центрифугирование при 5000 об./мин в течение 7 мин.
о,з од 0,5 qg ,о;7= о,а 0,9 -.1 1,1 1,2
количество N.iCI, г
Рис. 2. Зависимость площади хроматографического пика от количества NaCI.
площлдь Milk.,1 О,J ■
0 1. 2 ;Д; 4 5В .7= Д; 9 10;
время, мин
Рис. 3. Зависимость площади хроматографического пика от времени экстракции.
Оценены следующие метрологические характеристики: повторяемость, внутрилаборатор-ная прецизионность, правильность и точность [8, 11]. Повторяемость и внутрилабораторная прецизионность, характеризующие случайную составляющую погрешности, а также границы неисключенной систематической погрешности и относительной погрешности представлены в таблице 3. Результаты оценки исключенной систематической погрешности, проведенные с использованием аттестованных смесей хлорэтанола в крови, представлены в таблице 4. Сопоставление рассчитанных значений {расч с табличным показало, что расхождение носит случайный характер, т.е. исключенная систематическая погрешность незначима. Относительная погрешность (точность) определения хлорэтанола в диапазоне концентраций 0,05 — 10 мкг/см3 составляет 23 % и не превышает допустимую погрешность 30 %.
Таблица 2 Основные хроматографические параметры
Параметр Значение
Время удерживания, мин 8,8
Ширина пика, мин 0,06
Коэффициент удерживания 2,4
Число теоретических тарелок 200000
ВЭТТ, мм 0,25
Асимметрия 0,84
Таблица 3
Метрологические характеристики газохроматографического определения хлорэтанола в крови
Метрологическая характеристика Значение
Диапазон определяемых концентраций, мкг/см3 0,05-10
Повторяемость (относительное стандартное отклонение стг), % 6
Внутрилабораторная прецизионность (относительное стандартное отклонение Стр*п), % 11
Правильность (границы неисключенной относительной систематической погрешности бс), % 5
Точность (границы относительной погрешности б0), % 23
Таблица 4
Результаты оценки правильности (исключенной систематической погрешности) с использованием аттестованных смесей хлорэтанола в крови (п = 70; Р=0,95Цтаб = 2)
№ АС
, мкг/см
м кг/с M
0,098
0,097 ± 0,007
0,03
0,39
0,370 ±0,025
1,06
0,70
0,64 ±0,04
1,85
2,00
2,16 ±0,14
1,55
2,97 4,65
9,8
2,93 ±0,20 4,7 ±0,3
9,6 ±0,6
0,30 0,20
0,49
ВЫВОДЫ
В разработанной методике сочетание метода ЖЖМЭ и капиллярной газовой хроматографии позволило органично объединить стадии извлечения, концентрирования, дозирования и хроматографи-рования. Разработанная методика газохроматографического определения хлорэтанола в крови отличается простой пробоподготовкой, использованием типового хроматографического оборудования и малой продолжительностью анализа — 26 мин, по сравнению с прежней методикой (продолжительность анализа более 1,5 часов), удовлетворительной чувствительностью и точностью.
ЛИТЕРАТУРА
лезнь — углеводородный нейротоксикоз. — Горький: Волго-Вятское кн. изд-во, 1980. — 183 с.
2. Гигиенические критерии состояния окру-
Международная программа по химической безопасности, 1990. — 80 с.
3. Дорогова В.Б. Оценка производств винилх-лорида и поливинилхлорида как источников загрязнения воздушной среды рабочих помещений и их влияние на организм работающих (обзор
Сведения об авторах
гидрин) — один из токсических метаболитов 1,2-дихлорэтана // Фармакология и токсикология. —
5. Каспаров A.A. Токсикометрия химических веществ, загрязняющих окружающую среду. — М.:Центр международных проектов ГЖНТ, 1986. — 428 с.
жидкость-жидкостной микроэкстракции: современное состояние и перспективы // Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез:
7. Основы аналитической химии / под ред.
8. Представление результатов химического анализа (рекомендации IUP АС 1994 г.) // Аналити-
10. Ревич Б.А. Биомониторинг токсичных веществ в организме человека // Гигиена и сани-
лыхЛ.И. Алгоритмы определения метрологических характеристик методик количественного химического анализа: учебное пособие. — Иркутск: Изд-во
9. Тараненко H.A. и др. Применение методов газовой и жидкостной хроматографии при изучении метаболизма органических соединений (обзор)
12. Яшин Я.И., Яшин Е.Я., Яшин А.Я. Газовая
13. Grunder F.J. Blood as a matrix for biological monitoring // Am. Industrial Hygiene Association
14. The Environmental health criteria 215. Vinyl Chloride. — Geneva: International Programme on
15. Wolfgang W. Biomonitoring BASF. — Ludwigshafen: Aktiengesellschaft Arbeitsmedizin und Gesundheitsschutz, 2005. — 15 s.
Журба Ольга Михайловна - кандидат биологических наук, и.о. заведующей лабораторией физико-химических методов исследования Ангарского филиала ВСНЦ экологии человека СО РАМН - НИИ медицины труда и экологии человека Алексеенко Антон Николаевич - младший научный сотрудник лаборатории физико-химических методов исследования Ангарского филиала ВСНЦ экологии человека СО РАМН - НИИ медицины труда и экологии человека (665827, г. Ангарск, а/я 1170; e-mail: [email protected])
Шаяхметов Салим Файзиевич - доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора по научной работе Ангарского филиала ВСНЦ экологии человека СО РАМН - НИИ медицины труда и экологии человека
