CC BY
24
DOI: 10.23868/201808022
некоторые аспекты морфогенеза тканей шейки матки белых беспородных лабораторных крыс накануне и в период родов
Ю.В. Григорьева1, Г.Н. Суворова1, С.Н. Юхимец2, О.Н. Павлова3, А.А. Девяткин4, О.Н. Тулаева1, О.В. Кулакова1
1 Самарский государственный медицинский университет, Самара, Россия
2 Университет Св. Иосифа Танзании, Дар Эс Салаам, Танзания
3 Медицинский университет «Реавиз», Самара, Россия
4 Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана, Казань, Россия
TissUE morphogenesis features of THE laboratory rats cERvix A DAY BEFoRE AND IN LABoR
Y.V. Grigoryeva1, G.N. Suvorova1, S.N. Iukhimets2, O.N. Pavlova3, A.A. Devyatkin4, O.N. Tulayeva1, O.V. Kulakova1
1 Samara State Medical University, Samara, Russia
2 St. Joseph University in Tanzania, Dar es Salaam, Tanzania
3 Medical University "ReaviZ', Samara, Russia
4 N.E. Bauman Kazan State Academy of Veterinary Medicine, Kazan, Russia
e-mail: [email protected]
В шейке матки крыс накануне родов и в процессе родов наблюдается ряд морфологических изменений, позволяющих обеспечить своевременное раскрытие цервикального канала для беспрепятственного изгнания плода. Знание процессов морфогенеза шейки матки во время родов, благодаря которым реализуются все механизмы функционирования данного органа, важно для разработки максимально эффективных методов управления родовым процессом. Цель исследования: изучение структурных преобразований, происходящих в шейке матки накануне родов и в период родов, на примере биологической модели — белой беспородной крысы. В работе были использованы общегистологические методы (окраска гематоксилином и эозином по Массону), иммуногистохимия с набором антител к коллагену III типа, а также электронная трансмиссионная микроскопия. В результате исследования было установлено, что коллаген III типа, будучи одним из составных структурных компонентов в шейке матки крыс, определяет ее механические особенности и играет ведущую роль в процессах морфогенеза, и, вероятно, способствует сохранению структуры цервикса при раскрытии маточного зева в родах, т. е. препятствует возникновению разрывов. Секреция компонентов внеклеточного матрикса, в том числе и коллагена, осуществляется лейомиоцитами цервикса путем клазмацитоза.
ключевые слова: цервикс, гладкие миоциты (лейомиоци-ты), клазмацитоз, коллаген, III тип коллагена, «созревание» шейки матки.
Среди разрабатываемых в современной морфологии многочисленных направлений фундаментального и прикладного характера значительное место отводится изучению адаптации и реактивности тканей, наблюдаемых в органах при беременности, во время родов и в ходе послеродовой инволюции [1-3].
Наиболее ярко процессы физиологической адаптации проявляются в матке при беременности и родах. Известно, что механизмы адаптационно-приспособительного характера в миометрии при беременности реализуются посредствам гипертрофии и гиперплазии миоцитов [1-3]. Однако в шейке матки накануне родов и в родах наблюдается ряд морфологических преобразований, позволяющих ей обеспечить раскрытие цервикального канала для беспрепятственного изгнания плода из полости матки. Эти изменения в практическом акушерстве принято называть
The series of the morphological changes allowing providing timely disclosure of the cervical channel for a free foetus expulsion from the uterus cavity are observed in cervix a day before and during labour. The processes of morphogenesis in the cervix during delivery, with all realised functioning mechanisms in this organ, is essential for the development of the most effective methods of patrimonial process management. Therefore, the purpose of our research was studying of structural transformations in cervix a day before and in labour. We used the laboratory rat as a biological model. We applied several histological methods: light microscopy (stained with hematoxilin and eosin, by Masson), immunohisto-chemistry with a set of antibodies to type III collagen, and an electron transmission microscopy. We established that the basic supporting protein in the cervix is collagen III type; this type defines its mechanical features and leads key role in morphogenesis processes. The particular role in the cervix during parturition assigned to the type III collagen, which probably promotes to preserve cervix structures during parturition and prevents the emergence of disruptures. Intercellular substance components secretion, including collagen, is carried out by clasmacytosis in cervix leyomyocytes.
Keywords: cervix, smooth myocytes (leyomyocytes), clasmacytosis, collagen, III type of collagen, "maturing" cervix.
«созреванием» шейки матки, где степень ее зрелости отражает готовность организма к родам [4, 5]. Отсутствие на момент начала родовой деятельности ряда морфологических признаков «зрелости» шейки матки (размягчения, укорачивания и сглаживания губ, раскрытия маточного зева) достоверно напрямую коррелируют с частотой развития аномалий родовой деятельности [2, 4-6].
Однако накопленные к настоящему времени сведения не позволяют однозначно ответить на многие вопросы, касающиеся не только динамики раскрытия шейки матки и течения родов, но и особенностей адаптационного морфогенеза специализированных структур шейки матки. В этой связи, считаем актуальным проведение морфологического исследования шейки матки накануне родов и в ходе родов, белой беспородной крысы.
Материал и методы
Дизайн исследования
Модельным объектом исследования являлись белые беспородные лабораторные крысы в возрасте 6-7 мес., весом 190-210 г., ранее нерожавшие (n=12). Крыс с датированным сроком беременности получали по стандартной методике, описанной ранее Э. Зуссманом (1977) [7]. Первым днем беременности животных считали день обнаружения сперматозоидов во влагалищных мазках. Материал для исследования (шейка матки крыс), получали после вскрытия беременных самок накануне родов (20 и 21 сут. беременности) и в период родов (после рождения 1 -2 крысят). Контролем служила шейка матки белых беспородных крыс в возрасте 6-7 мес., ранее нерожавших. Крыс умерщвляли смертельной дозой эфирного наркоза. Экспериментальных животных делили на 4 группы (n=3 в каждой группе) в зависимости от срока беременности: контроль (группа А), 20 сут. беременности (группа В), 21 сут. беременности (группа С) и период родов (группа D).
Исследование выполнено в соответствии с правилами лабораторной практики в Российской Федерации: приказ Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г.; приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.; закон «О защите животных от жестокого обращения» гл. V, ст. 104679-ГД от 01.12.1999 г. На проведение исследования получено разрешение комитета по биоэтике при СамГМУ (протокол № 176 от 03.08.2016 г.).
Гистохимический анализ
Материал фиксировали в забуференном формалине, проводку осуществляли в гистологическом процессоре замкнутого типа с вакуумом Leica ASP 300 (Германия). Материал заливали в парафин "Histomix" фирмы BioOptica (Россия). Фронтальные, сагиттальные и поперечные срезы толщиной 4 мкм готовили на роторном микротоме. Готовые срезы помещали на предметные стекла только со специальным фабричным адгезивным покрытием (poly-L-lyzin), ООО ТД jLs Chemical (Россия) и окрашивали гематоксилином и эозином по Массону. Срезы просматривали под световым микроскопом Leica (Германия).
Иммуногистохимический анализ
Коллаген III типа на гистологических препаратах выявляли методом иммуногистохимии с помощью мышиных антител Anti-Collagen III, Clone HWD1.1, AM167-5M (BioGenex, США). Для иммуногистохимической реакции обязательно проводили тепловую демаскировку антигенных детерминант на водяной бане в течение 40 мин. с использованием раствора Dako TRS (Target Retrieval Solution, 10х концентрат, лот 10119736, Дания). При постановке пероксидазного блока применяли раствор Peroxidase-Blocking Solution, Dako REALTM (Дания). Иммуногистохимическую реакцию выполняли с одноша-говой системой визуализации BioGenex (QD 630-XAK) Super Sensitive one-step Polymer - HRP Kit/DAB (США). Результаты оценивали после постановки положительного и отрицательного контролей.
Метод щелочной диссоциации тканей
Для получения изолированных клеток-лейоми-оцитов (миоцитов) использовали метод щелочной диссоциации тканей по В.Я. Бродскому (1983) [8]. Кусочки шейки матки фиксировали в холодном 10 % нейтральном формалине на фосфатном буфере (рН-7,0), промывали проточной водой, измельчали и переносили в 50 % раствор КОН на 12 ч. Далее материал
помещали в холодную дистиллированную воду и выдерживали 1 сут. при температуре +4 °С. После 2 ч. экспозиции при комнатной температуре, воду меняли на свежую, с помощью магнитной мешалки получали взвесь изолированных клеток, готовили мазки и окрашивали их гематоксилином и эозином.
Гистоморфометрия
Структуру внеклеточного матрикса соединительной ткани на гистологических срезах шейки матки анализировали морфометрическим методом с помощью наложения открытой точечной тестовой системы по рекомендациям А.А. Глаголева (1941) [9].
Измерение линейных размеров лейомиоцитов проводили в двух взаимно перпендикулярных направлениях на изолированных клетках и вычисляли объем гладких миоцитов, используя метод, предложенный Я.Е. Хесиным (1967) [10].
Трансмиссионная электронная микроскопия
Материал фиксировали в глутаровом альдегиде (BASF, Германия), заливали в эпон-аралдитовую смесь и контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца (EMS, США). Для определения прицельного участка исследования сначала готовили полутонкие срезы толщиной 1-2 мкм, а затем ультратонкие срезы толщиной 200-500 нм. Срезы просматривали на электронном микроскопе JEOL JEM-1400 PLUS (Япония).
Статистический анализ
Статистическую обработку данных проводили в программе IBM SPSS Statistics v24, осуществляли проверку данных на соответствие закону нормального распределения. Для описания выборочной совокупности данных использовали медиану и 5, 25, 75, 95 процентили. Для определения статистической значимости различий между значениями показателей в группах данных применяли U-критерий Манна-Уитни при уровне статистической значимости p<0,05. Для преодоления ошибки множественных значений применяли поправку Бонферрони.
Результаты и обсуждение
Согласно классическому представлению о строении средней оболочки шейки матки плацентарных животных, она состоит из гладкой мышечной ткани, которая обладает определенной специфичностью, высокой пластичностью и характеризуется гормональной зависимостью. Помимо гладкой мышечной ткани, в средней оболочке шейки матки имеется волокнистая соединительная ткань, окружающая лейомиоциты (миоциты).
В нашем исследовании показано, что накануне родов и в момент родов в строении всех тканей средней оболочки цервикса происходят изменения.
Лейомиоциты шейки матки при беременности подвергаются гипертрофии: объем клеток увеличивается с 1862,87 мкм3 в контрольной группе до 7870,34 мкм3 к 21 сут. беременности. На электронной микроскопии видно, что гипертрофия клеток происходит за счет увеличения в них сократительных миофи-ламентов, которые к 20 сут. беременности занимают практически весь объем цитоплазмы клетки (рис. 1 ). В литературе имеются данные о том, что при самопроизвольных родах, по сравнению со стимулированными родами, между гипертрофированными миоцитами увеличивается количество контактов [11]. Увеличение числа контактов отражает тоническое напряжение миометрия и его готовность к интенсивной сократительной деятельности [12]. Однако эти изменения характерны в большей
степени не для шейки матки, а для других ее отделов, в которых процесса «созревания» не наблюдается [11, 12].
В шейке матки, накануне родов и в родах, несмотря на наличие гипертрофии лейомиоцитов, наблюдается разъединение межклеточных контактов (рис 2). Это сопровождается изменениями в строении периферической части цитоплазмы клеток, где сократительные миофила-менты разрушаются, а на их месте развиваются цистерны гранулярной ЭПС и накапливаются рибосомы (рис. 3). Кроме этого, в ядрах преобладает эухроматин и появляются ядрышки, что говорит о повышении функциональной активности клеток. Чем ближе к родам, тем больше становится извилистость мембраны лейомиоцитов, появляются различной величины выпячивания плазмолеммы.
В базовой литературе такой процесс получил название клазмацитоз, который расценивается как патология проницаемости клеточной мембраны — «минус-мембрана». Однако, он свойственен и нормальным клеткам: классический пример — образование тромбоцитов, описанное J.G. Wright (1906) [13].
Установлено, что клазмацитоз встречается в мио-цитах матки в ходе послеродовой инволюции, но здесь он рассматривается как один из вероятных механизмов элиминации структур миометрия, обеспечивающих уменьшение его массы без ущерба для численности гладких миоцитов и угрозы развития воспаления [3].
В ряде научных работ авторы ассоциируют с клаз-мацитозом транспорт веществ, считая его одним из путей секреции коллагена у активно синтезирующих фибробластов [14, 15]. Данный путь секреции реализуется в условиях экстренного синтеза, где из цистерн гранулярной ЭПС синтезированный материал, минуя пластинчатый комплекс, через транспортные вакуоли, поступает в межклеточную среду. Таким образом, клазмацитоз предлагается рассматривать с точки зрения физиологического процесса, происходящего в железах с апокринным типом секреции.
Мы полагаем, что формирование множественных ци-топлазматических выпячиваний у миоцитов (как темных, так и светлых) во время родов, есть не что иное, как один из механизмов секреции компонентов внеклеточного матрикса. Несмотря на то, что размеры выпячиваний значительно варьируют, содержимое преимущественно представлено гранулированным материалом и участками расширенных цистерн грЭПС (рис. 3).
Также во время беременности происходят изменения со стороны соединительной ткани. Объем внеклеточного матрикса становится больше, о чем свидетельствует увеличение расстояния между миоцитами, что на световом уровне дает картину развития интерстици-ального отека.
В связи с тем, что при электронной микроскопии было выявлено большое количество коллагеновых фибрилл с выраженной поперечной исчерченностью, мы провели иммуногистохимическое типирование гистологических срезов с применением моноклональных антител к коллагену III типа, и показали, что количество коллагена III типа значительно увеличивается на момент родов (рис. 4, 5). Статистический анализ данных, полученных в результате морфометрических исследований объемной доли структур внеклеточного матрикса с положительной окраской DAB к коллагену III типа (рис. 6), дает нам основание говорить о положительной корреляции между синтезом коллагена III типа и сроком беременности. Стоит отметить, что во всех экспериментальных группах результаты достоверно отличаются друг от друга (табл.). Таким образом, коллаген III типа, по-видимому, играет важную роль в морфогенезе «созревания» шейки матки в родах.
Рис. 1. Гладкие миоциты шейки матки крысы на 20 сут. беременности. Сократительные миофиламенты (указаны стрелками) занимают весь объем цитоплазмы. ТЭМ. Ув. х4000
Рис. 2. Гладкие миоциты шейки матки крысы на 21 сут. беременности. Разрушение межклеточных контактов из-за появления клазмацитоза (указано стрелкой). Центральная часть цитоплазмы клеток заполнена миофиламентами. ТЭМ. Ув. х5000
Рис. 3. Гладкий миоцит шейки матки крысы в родах. В просвете цитоплазматических выпячиваний определяются цистерны грЭПС (указано стрелкой). ТЭМ. Ув. х20 000
рис. 4. Участок шейки матки половозрелой крысы контрольной группы. 3 слоя миометрия: 1 — надсосудистый, 2 — сосудистый, 3 — подслизистый. Иммуногистохимическая реакция с антителами к коллагену III типа. Световая микроскопия. Ув. х100
рис. 5. Участок шейки матки крысы в родах. Увеличение экспрессии коллагена III типа в миометрии. 1 — надсосудистый слой, 2 — сосудистый слой, 3 — подслизистый слой. Иммуногистохимическая реакция с антителами к коллагену III типа. Световая микроскопия. Ув. х 100
рис. 6. Объемные доли структур шейки матки на гистологических срезах с положительным окрашиванием DAB к коллагену III типа, накануне и в ходе родов. Иммуногистохимическая реакция
Результаты основаны на парном критерии Манна-Уитни и двусторонних критериях в предположении равенства дисперсий. Для каждой значимой пары ключ меньшей категории появляется в категории с большим средним. Уровень значимости p для групп A, B, C: менее 0,05.
Известно, что коллаген III типа отличается более высокой степенью гидроксилирования пролина, чем другие фибриллобразующие типы коллагена, а также он содержит цистеин, благодаря чему способен образовывать дополнительные дисульфидные связи и является центром агрегации молекул в фибриллы [16]. На наш взгляд, это свойство коллагена в цервиксе матки способствует сохранению ее структуры при раскрытии маточного зева в родах, т. е. препятствует возникновению разрывов тканей.
таблица. Результаты сравнения данных объемной доли структур шейки матки на гистологических срезах с положительным окрашиванием DAB к коллагену III типа, полученных методом ИГХ, накануне и в ходе родов, по U-критерию Манна-Уитни
Группа
Контроль Б. 20сут. Б. 21сут. Роды
(A) (B) (C) (D)
Среднее 5,00 7,47 9,65 11,01
A A B A B C
Стандартная ошибка 5 5 5 5
невзвешенной частоты A A B A B C
Медиана 4,89 7,39 9,34 10,66
A A B A B C
Доля ИГХ+ Процентиль 25 4,55 6,90 A 8,13 A B 9,68 A B C
Процентиль 75 5,56 8,00 10,66 12,24
A A B A B C
Процентиль 05 4,10 5,98 7,10 8,80
A A B A B C
Процентиль 95 6,08 8,90 12,77 14,52
A A B A B C
Стоит отметить, что на сегодняшний день процесс «созревания» шейки матки расценивается как сложный каскад ферментативных реакций, направленных на разрушение коллагеновых волокон, присутствующих в шейке матки. Доказано, что темп раскрытия шейки матки в родах тем больше, чем меньше в ней коллагена, который обуславливает величину жесткости тканей [17-19]. Руководствуясь сведениями о функциональной значимости коллагенов [16], можно сказать, что величину жесткости тканей обычно определяет коллаген I типа, который в шейке матки присутствует в большем количестве, чем коллаген III типа, и именно коллаген I типа разрушается в процессе «созревания» шейки матки. Полученные нами результаты об увеличении количества коллагена III типа на момент родов, позволяют задуматься о функциональной роли различных типов коллагенов и возможной смене одного типа на другой к концу беременности.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Бахмач В.О., Чехонацкая М.Л., Яннаева Н.Е. и др. Изменения матки и шейки матки во время беременности и накануне родов (обзор). Саратовский научно-медицинский журнал 2011; 2(7): 396-400.
2. Созыкин А.А. Морфологические аспекты нормального гистогенеза и реактивных изменений гладкой мышечной ткани миометрия крыс [диссертация]. Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет»: Волгоград; 2004.
3. Shkurupiy V.A., Obedinskaya K.S., Nadeev A.P. Morphological study of the main mechanisms of myometrium involution after repeated pregnancies in mice. Bull. Exp. Biol. Med. 2011; 150(3): 378-82.
4. Савицкий А.Г., Гультяева А.О., Кузьмина Д.Н. и др. «Шеечный фактор» в патогенезе гипертонических дисфункций матки. Детская медицина Северо-Запада 2012; 3(2): 35-42.
5. Подтетенев А.Д., Братчикова Т.В., Котайш Г.А. Регуляция родовой деятельности. М.: Изд-во Российского университета дружбы народов; 2004.
6. Козонов Г.Р., Кузьминых Т.У., Толибова Г.Х. и др. Клиническое течение родов и патоморфологические особенности миометрия при дис-координации родовой деятельности. Журнал акушерства и женских болезней 2015; 4(64): 39-48.
7. Зуссман Э. Биология развития; пер. с англ. М.: Мир; 1977.
8. Бродский В.Я., Цирекидзе Н.Н., Коган М.Е. Изменение абсолютного числа клеток в сердце и печени. Количественное сохранение белков и ДНК в изолированных клетках. Цитология 1983; 3: 260-5.
Коллаген III типа, будучи одним из составных структурных компонентов в шейке матки крыс, определяет ее механические особенности и играет важную роль в процессах родового морфогенеза. При этом секреция компонентов внеклеточного матрикса, в том числе и данного типа коллагена, осуществляется лейомиоцитами шейки матки с секреторным фенотипом. Мы считаем, что клазмацитоз — это один из вариантов функционирования дефинитивной мышечной клетки. Данный процесс накануне родов и в родах является проявлением усиленного синтеза компонентов внеклеточного матрикса, в частности коллагена III типа, который приводит к увеличению объемной доли внеклеточного матрикса и изменению его качества.
Конфликт интересов
Авторы декларируют отсутствие конфликта интересов.
9. Глаголев А.А. Геометрические методы количественного анализа агрегатов под микроскопом. Львов: Госгеолиздат; 1941.
10. Хесин Я.Е. Размеры ядер и функциональное состояние клеток. М.: Медицина; 1967.
11. Ciray H.N., Guner H., Hakansson H. et al. Morphometry analysis of gap junctions in nonpregnant and term pregnant human myometrium. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 1995; 74(7): 497-504.
12. MacKenzie L.W., Cole W.C., Garfield R.E. Structural and functional studies of myometrial gap junctions. Acta Physiol. Hung. 1985; 65(4): 461-72.
13. Wright J.G. The origin and nature of the blood platelets. Boston Med. Surg. J. 1906; 154: 643-5.
14. Petkov R. Ultrastructure of the collagen fibril. I. Some features of the structure of the collagen fibril. Anat. Anz. 1978; 144(4): 301-18.
15. Серов В.В., Шехтер А.Б. Соединительная ткань (функциональная морфология и общая патология). М.: Медицина; 1981.
16. Омельяненко Н.П., Слуцкий Л.И. Соединительная ткань (гистофи-зиология и биохимия). Том I. М.: Известия; 2009.
17. Савицкий Г.А. Биомеханика раскрытия шейки матки в родах. СПб: ЭЛБИ; 1999.
18. Uldberg N., Ekman G., Malmstroni A. et al. Ripening of the human cervix related to changes in collagen, glycosaminoglycans end collagenolitic activity. Amer. J. Obstet. Gynec. 1983; 147(6): 662-6.
19. Oxlund B.S., 0rtoft G., Bruel A. et al. Cervical collagen and biome-chanical strength in non-pregnant women with a history of cervical insufficiency. Reprod. Biol. Endocrinol. 2010; 8: 92.
Поступила 21.052018
