CC BY
3125 Schwarz D., Pazen D., Gosz K., Schwarz S., Nünning M., Gostian A.-O. Beutner D. Acoustic Properties of Collagenous Matrices of Xenogenic Origin for Tympanic Membrane Reconstruction. Otology & Neurotology. 2016; 37 (6):692-697.
26 Mota C., Danti S., D'Alessandro D., Trombi L., Ricci C., Puppi D. et al. Multiscale fabrication of biomimetic scaffolds for tympanic membrane tissue engineering. Biofabrication. 2015; 7 (2):15-19.
27 Saliba I., Woods O. Hyaluronic acid fat graft myringoplasty: a minimally invasive technique. Laryngoscope. 2011; 121 (3):75-80.
28 Santa Maria P. L., Redmond S. L., Atlas M. D., Ghasse mi far R. The role of epidermal growth factor in the healing tympanic membrane fol-lowing perforation in rats. Journal of Molecular Histology. 2010; 41 (6):309-314.
29 Santa Maria Pl, Gottieb P, Santa Maria C, Kim S, Puria S, Yang Yp. Functional Outcomes of Heparin-Binding Epidermal Growth Factor-Like Growth Factor for Regeneration of Chronic Tympanic Membrane Perforations in Mice. Tissue Eng Part A. 2017 May; 23 (9-10):436-444
30 Kakigi A., Uchida A., Nishimura M., Takeda T., Takeda S., Nakatani H. Expression of fibroblast growth factor receptors 1-4 in human chronic tympanic membrane perforation. J Otorhinolaryngol Relat Spec. 2010; 71:67-70.
31 Kanemaru S.-I., Umeda H., Kitani Y., Nakamura T., Hirano S., Ito J. Regenerative treatment for tympanic membrane perforation. Otol Neurotol. 2011; 32 (12):18-23.
32 Крюков А.И., Царапкин Г.Ю., Туровский А.Б. Оригинальный способ определения формы и фиксации сеп-тальных стентов // Вестник оториноларингологии. - 2008. - № 3. - С. 42-45.
Рукопись получена: 11 ноября 2019 г. Принята к публикации: 22 ноября 2019 г.
УДК 691.175.5/.8 + 616.711
НАНОРАЗМЕРНЫЙ ЦИТОАКТИВНЫЙ МАТЕРИАЛ «ЛИТАР» И МЕЖПОЗВОНКОВАЯ ДИСКОВАЯ ГРЫЖА
© 2019 С.Д. Литвинов, И.И. Марков, В.С. Попов, А.В. Иващенко
Частное учреждение образовательная организация высшего образования «Медицинский университет «Реавиз», Самара
Эффективным материалом для восполнения дефектов тканей человеческого организма является нанораз-мерный композитный цитоактивный материал «ЛитАр». В статье представлено исследование направленной тканевой регенерации в реконструктивных операциях на позвоночном столбе с помощью композита «ЛитАр». Установлено, что применение материала «ЛитАр» по истечении более чем года исследования не оказало патологического воздействия на костную ткань смежных позвонков и позволило констатировать полное восстановление хрящевой ткани межпозвонкового диска L4-L5. Выявлено, что твердотканый компонент позвонков L4-L5 соответствовал D4 типу костной ткани и равнялся 265,4 HU. Рентгенологическая плотность ткани изучаемых позвонков соответствовала интактной костной ткани. Данные плотности межпозвонкового диска ровнялись 145,5 HU и соответствовали интактной хрящевой ткани, что свидетельствует о высокой эффективности материала «ЛитАр».
Ключевые слова: материал «ЛитАр», костная ткань, тканевая регенерация.
По данным литературы [1, 2] эффективным материалом для восполнения дефектов тканей человеческого организма является наноразмерный композитный цитоактивный материал «ЛитАр», запускающий регенерацию тканей в различных анатомических областях.
Это связано с тем, что в состав материала входят кристаллы гидроксофосфата кальция (или гидроксилапатита, или гидроксидапатита), которые по размерам аналогичны таковым кристаллам в организме [3]. Из работы [4] известно, что наноразмерные кристаллы апатита могут проникать внутрь клетки. В ней рН = 3,5 (поэтому ДНК - в скрученном состоянии), когда происходит гидролиз кристаллов гидроксофосфата кальция в клетке, то рН может менять значения и становиться больше 7, что приводит к раскрытию ДНК, а это обеспечивает регенерацию ткани в дефектном участке на генетическом уровне, поэтому в месте введения «ЛитАр» появляется тот тип ткани, который требует нормальное анатомическое строение в данном отделе организма. И осуществляется это благодаря мало дифференцированным плю-рипотентным (мезенхимальным) стволовым клеткам.
Механизм посттравматической клеточной регенерации - однотипен, единственное отличие - это микроокружение.
Материал «ЛитАр» привлекает стволовые клетки организма. Эти клетки формируют провизорный (первичный) регенерат, на основе которого идёт первичная регенерация.
Иммуно-дефецитные (вторичные) клетки не препятствуют регенерации, т.к. у иммунной системы есть другая функция - ПИЩЕВОЙ КОНВЕЙЕР.
Хрящ восстановливается быстрее, чем кость, т.к. он есть первый этап восстановления ткани.
Для рассмотрения этого процесса обратим внимание на строение материала «ЛитАр» и характер его превращения (морфологию превращения) в организме.
Клеточные технологии занимают всё большую часть пространства информационного поля. Известно, что они представляют собой совокупность методов, включающих в себя различные варианты клеточной трансплантации, тканевой инженерии, генотерапии и цитокино-вой терапии [5]. Несмотря на то, что казалось бы, задача воспроизведения остеогенеза in vitro как модели естественного процесса и основы получения остеогенных клеточных элементов, задача в основном решённая [6, 7], однако, остаются проблемы, которые сводят всю эту «ре-шённость» к полной нерешённости: регенерация любого типа ткани (в её дефектном участке) остаётся проблемой проблем. Даётся огромное количество всевозможных объяснений: почему в реальной ситуации не всегда (а в основном - мало когда) удаётся запустить регенерацию с полноценным эффективным завершением. Единственное, что удалось выяснить на сегодняшний день: виновниками регенераторного процесса являются стволовые клетки. В силу того, что направить их деятельность в нужное русло мало когда удаётся, человечество решило «взять не умением, а числом», и был предложен способ умножения числа клеток, обеспечивающих регенерацию, в приспособлениях типа термостата, с тем, чтобы в последующем эту массу увеличенных в несколько десятков раз клеток обратно ввести в организм. А в нём-то они и сделают своё благое дело. Вот тут-то хвалёные клеточные технологии и дают сбой: возвращённые в организм клетки (умноженные в термостате) престают быть «своими» и начинают выращивать (создавать) новый организм в том биологическом объекте, откуда их благополучно извлекли, надеясь, что по возвращении клетки «узнают родные стены». Все эти аллегорические экзерсисы могут быть разбиты нашими морфологами, но факт остаётся фактом: регенерация на сегодняшний день не является тем абсолютно управляемым процессом, который требует медицинская практика. Далеко не всегда, а точнее почти никогда не
удаётся «уговорить» стволовые клетки (плюрипотентные, малодифференцированные) обеспечить требуемую регенерацию дефектного участка ткани без их извлечения из организма.
Рис. 1. Схема строения материала «ЛитАр»: Рис. 2. Кристаллы гидроксофосфата кальция
А - волокна биополимера (коллагена или альгината в материале (масштаб 100 нм., ув. х 150000)
кальция), Б - кристаллы гидроксофосфата кальция (гидроксоапатита) в материале на волокнах биополимера
Рис. 3. А - морфология материала «ЛитАр», ув.*8; Б - морфология материала «ЛитАр», ув. *40;
1 - волокна биополимера (коллагена), 2 - наноразмерные кристаллы гидроксоапатита (апатита кальция)
Поэтому кажется более перспективным развитие научного направления по регенерации тканей, путём введения некоего вещества, стимулирующего клеточную деятельность организма. Это направление развивается благодаря развитию исследований в области инжиниринга тканей человеческого организма. Инжиниринг тканей - это конструирование и создание в лаборатории живых функциональных компонентов, которые могут быть использованы для регенерации неправильно функционирующих тканей. Более упрощенно инжиниринг можно представить как выращивание фрагментов тканей человеческого организма in vitro с последующей имплантацией их. В связи с этим бурно развивается клеточная индустрия, т.к. формирование фрагмента требуемой ткани без участия клеток невозможно. Идентификация стволовых клеток и возможность их забора у пациента, высевание их на каркасы необходимой архитектуры in vitro позволяет расширить круг регенерируемых тканей.
В настоящее время внимание исследователей сосредоточено на разработке каркасов для инкубирования клеточной массы перед помещением в область дефекта.
В качестве каркасов можно использовать как биоинертные материалы (оксид алюминия, оксид циркония, металлы и сплавы, полиэтилен), рассасывающие (полигликоливая и полимолочная кислоты, коллаген, альгинат кальция-натрия, фосфаты кальция), так и биоактивные (гидроксилапатит, фторгидроксилапатит, керамика на основе среднего фосфата кальция).
Иногда высказывается [8] ошибочное мнение, что «каркасы должны иметь структуру, которая действует как шаблон, или матрица для роста ткани в трёх измерениях и стимулирует новый рост в форме, заданной каркасом. Очевидно, что конструкцией шаблона является структура, копирующая структуру ткани организма-хозяина». Это умозрительное и ничем не подтверждённое заключение отчасти является не только неправильным, но и вредным, т.к. тормозит развитие научного поиска в перспективном направлении. Роль каркаса может быть совсем иной. В одном авторы сходятся несомненно: каркасы, с культивированными на них клетками in vitro (ещё они называются «конструктами»), после имплантации должны способствовать росту кровеносных сосудов, т.е. обеспечивать ангиогенез.
Однако, если в ткани «хозяина» остается искусственный материал, то регенерации тканей до их первоначальных состояний и функций не происходит. Из этого следует, что идеальные каркасы должны быть рассасывающимися с тем, чтобы в конечном счёте не имелось никаких следов их присутствия.
Нахождение инородного тела в организме-хозяине не исключает присоединение к нему инфекции в срок до 5 лет [9]. Таким образом, наиболее эффективным с позиций инфицирования будет материал, каркас которого существует в зоне регенерации минимально возможное время.
Считается [8], что механические свойства конструкта, получаемого посредством инжиниринга тканей, должны соответствовать механическим свойствам ткани организма хозяина. По мнению авторов [8], это очевидно из опыта полной замены бедра. К сожалению, данный пример не является убедительным, т.к. в случае замены бедра никакой регенерации тканей не происходит. С другой стороны, с точки зрения авторов [10], невозможно создать имплан-тат, который бы имел одновременно и высокие прочностные характеристики (наподобие костных) и малое время биотрансформации (быструю биодеградацию), чтобы исключить возможность инфицирования. Условия регенераторного процесса заставляют выбрать: либо прочностные свойства, но длительную биодеградацию имплантата, либо отсутствие прочностных свойств, но быстрая биотрансформация материала в здоровую полноценную ткань. В связи со сказанным, кажется перспективным разработка материала (имплантата), который без привлечения (или культивирования) клеток (в режиме in vitro), мог бы, благодаря своему химическому составу, стимулировать клеточную деятельность самого организма. То есть, запускать регенераторный механизм, апеллируя к малодифференцированным клеткам самого организма-хозяина.
В работе [11] показана возможность композита «ЛитАр», не содержащего в своем составе никакой клеточной массы, индуцировать ангиогенез. «ЛитАр» состоит из полимерной органической основы (белковой (коллагеновой) или полисахаридной (альгинатной)), которая имитирует матрицу костной ткани, часто называемую непонятным словом «матрикс», а так-
же солевого компонента, который представлен гидроксо- или гидроксофтор-апатитом (содержание фторид-иона не превышает, нормы, рекомендованные ВОЗ).
По разработанной и запатентованной нами технологии кристаллы соли нанометрических размеров формируются (выращиваются) на полимерных волокнах в ходе приготовления материала. Композит «ЛитАр» получается пористым на 70 %, что обеспечивает его быструю васкуляризацию.
По данным биопсии, взятой у лабораторных животных (собак - биопсия бралась под ка-липсоловым наркозом, без эвтаназии животных) время биодеградации составляет 12-15 дней. Далее в области введения материала образуется мягкотканиевая структура (соединительная ткань), которая далее оссифицируется только в том случае в тот тип костной ткани (плоская кость черепа, трубчатая кость с кортикальным и губчатым слоем), который должен находится в месте дефекта в случае нормальной анатомической топографии. Если дефект заполняется «ЛитАр» в области хряща, то образуется хрящ.
Запуск регенераторного механизма с помощью имплантата осуществлялся не только у костных тканей или хряща (перегородка носа), а также тканей паренхиматозных органов (легкое, печень, почка) [12-16] и инфарктного участка миокарда с восстановлением последнего без рубца [17].
Авторы отдают себе отчет в том, что концепция создания и применения имплантацион-ного материала для восполнения дефектов тканей входит в некоторое противоречие с обще принятой точкой зрения: имитации (или стимуляции) регенерации путём применения каркасных материалов с культивированными на них в условиях in vitro необходимым типом (видом) клеточной массы.
Вопрос мог бы быть дискуссионным, если бы не наличие большого клинического опыта по применению материала «ЛитАр» для регенерации костной, хрящевой и тканей паренхиматозных органов [18].
В качестве аргументов в пользу сказанного можно привести отдельные клинические наблюдения, которые являются фрагментами результатов многолетнего применения материала «Ли-тАр» для ликвидации дефектов тканей у большого числа пациентов в следующих областях:
• хирургическая стоматология,
• ортопедия-травматология,
• гнойная хирургия,
• оториноларингология,
• торакальная хирургия,
• нейрохирургия,
• гинекология,
• урология,
• камбустиология,
• офтальмология.
Исследования на лабораторных животных показали, что материал «ЛитАр» может быть использован для восполнения дефектов межпозвокового диска (дисковой грыжи).
На рисунке 4 приведена морфология диска после замещения дефекта материалом «Ли-тАр» у лабораторного животного.
В
Рис. 4. А - участок пульпозного ядра через 30 суток после введения «ЛитАр»: 1 - активные хондробласты, 2 - молодые хондробласты, формирующие хрящ. Ув. ><400, окраска Ван Гизон; Б - фрагмент пульпозного ядра в зоне введения «ЛитАр» через 45 суток: 1 - активные хондроциты, 2 - пассивные (участок дегенерации). Ув. ><200, окраска Ван Гизон; В - хондроциты: 1 - двуядернае, 2 - одноядерные) пульпозного ядра через 90 дней после введения цитоактивного наноразмерного композитного материала «ЛитАр»
Эти обстоятельства позволили нам использовать «ЛитАр» для восполнения дефекта хряща в вертебрологии, после удаления межпозвонковой дисковой грыжи.
Рис. 5. На КТ межпозвонковая дисковая грыжа: А - фронтальная и Б - горизонтальная проекции
Все операции по удалению грыжи межпозвонковых дисков и введению материала «ЛитАр» проводили по следующей методике: в положении пациента на боку под интратрахеаль-ным наркозом проводился разрез кожи в проекции грыжи на 2 см выше межостистого промежутка длиной до 2,5 см. Острым и тупым путём обнажались дужки позвонков. После чего на 1 см от раны вводился 4 мм эндоскоп со срезом 30 град. Под эндоскопическим контролем операционного поля иссекалась жёлтая связка, обнажался компримированный нервный корешок и выступающее в просвет позвоночного канала выпячивание грыжи межпозвонкового диска. Последняя после смещения корешка иссекалась. Проводился кюретаж ложа грыжи. В образованную полость диска вводился стерильный материал «ЛитАр».
Прооперировано 15 пациентов. У 12 - композит «ЛитАр» вводился в виде сухой стерильной пластины 1х1 см. У двух пациентов материал вводился в виде порошка (частицы 30-100 микрон), который смешивался с 0,9 % раствором хлорида натрия, полученная кашица вводилась в полость диска ложкой Фолькмана. У одного пациента пластину обработали рентгеноконтрастным веществом «Омнипак». Пяти больным вводили антибиотик сухим порошком, примерно, 0,5 г цефамезина. Рану зашивали наглухо с оставлением на сутки вакуумного дренажа.
Постельный режим пациенты сохраняли сутки. После чего им разрешали вставать. Выписывали на 3-4 сутки. Послеоперационный период протекал без осложнений, больные получали анальгетики, антибиотики, сосудистые, противоотёчные препараты и витамины. У всех пациентов раны заживали (первичным натяжением) хорошо, осложнений не было. В последующим проводилось рентгенологическое, КТ и МРТ исследование.
А Б
Рис. 6. А - фрагменты удалённой грыжи (Ь4 - L5); Б - подготовка материала «ЛитАр» к установке в область дефекта (иссечённой грыжи)
В
Рис. 7. А - рентгенограмма пациента К. после введения материала «ЛитАр» с рентгеноконтрастным веществом «Омнипак»; Б - рентгенограмма пациента К. через 3 дня после введения материала «ЛитАр» с рентгеноконтрастным веществом «Омнипак»; В - рентгенограмма пациента К. через 21 день после введения материала «ЛитАр» с рентгеноконтрастным веществом «Омнипак» (стрелкой обозначен введенный материал)
Рис. 8. Через два месяца после удаления дисковой грыжи Ь4-Ь5
Рис. 9. Область удаления дисковой грыжи Ь4-Ь5 с заполнением дефекта материалом «ЛитАр»
чрез 1 год и 3 мес. после операции
Нами было проведено более подробное исследование изменений плотности ткани в области замещения дефекта (грыжи) материалом «ЛитАр» путём расчёта рентгеновской плотности. Вот эти результаты.
Средиее=110.87 50-132.37 Макс=435 Мин=-147 Зона=0.1941 см2 (70 пиксель)
Рис. 10. Рентгенологическая плотность тканей в проекции Ь4-Ь5 позвонков. Пациент К. 32 года
(10 сутки наблюдения)
Участок хряща, не содержащий изучаемого композита «ЛитАр», имеет рентгеновскую плотность 109,7 Ни, данный показатель соответствует интактному межпозвоночному хрящу.
На 10 месяц исследования была получена серия КТ снимков в сагиттальной плоскости исследуемой области (рис. 11).
Б
Рис. 10. Рентгенологическая плотность тканей в проекции L4-L5 позвонков пациента К.,
32 года (10 месяц наблюдения)
Пациент К., 32 года осмотрен после операции через 10 месяцев. Жалоб нет, ходит свободно. Сохраняется легкая гипестезия в левой голени и стопе. Симптом Ласега слева 80 град. Работает по своей специальности.
При 3D рентгеновской модели патологических изменений костной ткани в области контакта с материалом «ЛитАр» на протяжении 10 месяце не отмечено. Пиковое значение оптической плотности позвонков составила: L4 = 267,8 HU; L5 = 263,0 HU. Результаты измерений указывают на то, что исследуемая костная ткань соответствует D4 типу костной ткани по С. Mish [19].
Значения оптической плотности межсуставного диска составила 145,5 HU, что соответствует мягкотканому компоненту, а именно здоровой хрящевой ткани. Анализ рентгенологической картины также позволяет констатировать факт отсутствия кровеносных сосудов в исследуемом хряще. Изучаемая хрящевая ткань отличается высокой оптической плотностью.
Заключение. Проведённое исследование подтвердило будущую перспективу применения композита «ЛитАр» при направленной тканевой регенерации в реконструктивных операциях на позвоночном столбе. Применение материала «ЛитАр» по истечении более чем года исследования не оказало патологического воздействия на костную ткань смежных позвонков и позволило констатировать полное восстановление хрящевой ткани межпозвонкового диска L4-L5.
После применения материала «ЛитАр» через более чем год исследования твердотканый компонент позвонков L4-L5 соответствовал D4 типу костной ткани и равнялся 265,4 HU. Рентгенологическая плотность ткани изучаемых позвонков соответствовала ин-тактной костной ткани. Данные плотности межпозвонкового диска ровнялись 145,5 HU и соответствовали интактной хрящевой ткани.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Литвинов С.Д. Наноразмерный композитный материал «ЛитАр» - универсальный имплантат: монография. -Самара: Книга, 2008. - 250 с.
2 Литвинов С.Д., Леонтьев В.К., Марков И.И., Судакова Т.В. Современные тенденции в биоматериаловедении и полимер-солевой имплантат «ЛитАр» // Вестник медицинского института «Реавиз». - 2017. - № 5 (29). -С. 11-38.
3 Litvinov S.D. The cytoactive biopolyver-salt base composite material ("LitAr") with nanosized crystals // News of science and education, Sheffield (GB). - 2014. - № 13. - P. 32-50.
4 Velard F., Laurent-Maquin D., Gullaume C., Bouthors S., Jallot E., Nedelec JM., Belaaouaj A., Laquerriere P. Zinc Doped Hydroxyapatite as Immunomodulatory Biomaterial // Journal of Artificial Organs. - 2009. - Vol. 32, № 7. -P. 457.
5 Деев Р.В., Исаев А.А., Кочиш А.Ю., Тихилов Р.М. Клеточные технологии в травматологии и ортопедии: пути развития // Клеточная трансплантация и тканевая инжененрия. - 2007. - Том II, № 4. - С. 18-30.
6 Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С. Индукция костной ткани и остеогенные клетки-предшественники. - М.: Медицина, 1973. - 220 с.
7 Фриденштейн А.Я. Клонирование стромальных клеток предшественники // Методы культивированных клеток. - Л.: Наука, 1987. - С. 257-265.
8 Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей / Л. Хенч, Л. Джонс. - М.: Техносфера, 2007. -303 с.
9 Joon В. Park and Roderic S. Lakes. Biomaterials: an introduction. Plenum Press, New-York and London, 1992. -394 р.
10 Литвинов С.Д., Ершов Ю.А. Биоадекватный имплантационный материал на основе коллаген-гидроксосолевого композита // Материаловедение. - 2000. - № 7. - С. 34-38.
11 Марков И.И., Литвинов С.Д., Марков А.И. Имплантационный материал «ЛитАр» индуцирует ангиогенез // Морфологические ведомости. - 2003. - № 1-2. - С. 74-76.
12 Краснов А. Ф., Литвинов С. Д. Медицинская практика применения материала «ЛитАр»: история и реальность // Ортопедия, травматологии и протезирование (Харьков). - 2003. - № 3. - С. 136-142.
13 Литвинов С.Д., Серёгин А.С., Пуштова Т.Б., Оленникова ММ Перспективы применения материала «ЛитАр» для восстановления хрящевой перегородки носа у детей // Российская оториноларингология. - 2006. -Л 3(22). - С. 66-70.
14 Куликов А.Н., Литвинов С.Д. Варианты использования коллаген-апатитового композита «ЛитАр» при оказании помощи пострадавшим с множественной и сочетанной травмой на этапах эвакуации и в условиях многопрофильного хирургического стационара // Медицинский вестник МВД. - Москва, 2006. - Т. 22, Л 3. -С. 7-9.
15 Чучков В.М, Селякин С.П., Назаров С.Б. Применение гидрооксоапатитового композита в условиях инфек-ционно-аллергического процесса для репарации легочной ткани. Тезисы докладов V Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения - 2006». - Саранск, 2006.
16 Леонтьев В.К, Литвинов С.Д., Судакова ТВ. Имплантационные материалы для замещения дефектов костной и хрящевой ткани // Российский вестник дентальной имплантологии. - 2003. - № 2. - С. 10-19.
17 Литвинов С.Д., Марков И.И. Биотрансформация композита «ЛитАр» в дефекте миокарда. Новые технологии создания и применения биокерамики в восстановительной медицине. Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Томск: Изд. Томского политехнического университета, 2007. - С. 71-75.
18 Lit-Ar полимер-солевой материал - http://www.lit-ar.ru.
19 Тынчеров Р.Р., Калбаев А.А. Значение минеральной плотности кости при использовании временных им-плантатов // Проблемы современной науки и образования.- 2016. - № 4 (46). - С. 175-178.
Рукопись получена: 30 октября 2019 г. Принята к публикации: 11 ноября 2019 г.
