CC BY
166
Создание новых форм доставки биологически активных веществ (БАВ) -актуальная проблема современной фармакологии. Существующие способы введения лекарственных веществ подразделяют на энтеральные и парентеральные. Самый простой, распространенный и удобный для пациента - пероральный. Однако при нем снижается биодоступность препаратов, склонных к деградации в желудочнокишечном тракте, следовательно, необходимо использовать более высокие дозы, что повышает токсичность лекарств для организма. К другим недостаткам пероральных
форм относятся низкая растворимость лекарственных средств в биологических жидкостях, невозможность направленной доставки к тканям-мишеням без побочного действия на здоровые ткани, неспособность веществ к проникновению через эпителий желудочно-кишечного тракта. Для решения этих проблем действующее вещество может быть заключено в полимерную матрицу. Использование биополимерных нано- и микроконтейнеров для капсулиро-вания БАВ позволит получать лекарственные формы с контролируемым временем поступления в организм, улучшенной растворимостью в биологических жидкостях, высокой
стойкостью при хранении.
В качестве структурных компонентов нано- и микроконтейнеров могут быть использованы природные полимеры (полисахариды, белки) и липиды, являющиеся биосовместимыми, нетоксичными и ненакапливающимися в организме.
Включение лекарственных веществ в нано- и микроконтейнеры позволяет качественно менять их фармакокинетику и механизм доставки к клеткам. Наиболее успешный пример -препараты на основе липосом, содержащих противоопухолевые вещества: доксорубицин -Doxil, Caelyx, Myocet, дауно-рубицин - DaunoXome [1], для которых доказано существенное увеличение времени циркуляции лекарственного вещества в крови и целевая доставка к опухолевым клеткам. Следует отметить, что впервые в качестве перспективных парентеральных переносчиков лекарств липосомы описали А. Бэнгхэм и Р. Хорн в 1960-е гг., а на практике они стали использоваться уже в 1970-е гг. [2]. В связи с успешным созданием и применением липо-сомальных систем транспорта лекарственных веществ возникает интерес также и к разработке биосовместимых частиц на основе природных и синтетических полимеров в качестве носителей лекарств [1]. В 2005 г. начат выпуск «Абраксана» -новой лекарственной формы химиотерапевтического препарата «Паклитаксел», токсичность которого значительно снижена за счет включения действующего вещества в альбуминовые наночастицы (~130 нм) [2].
Биополимерные микрокапсулы. Использование в качестве носителей БАВ полиэлектролитных микрокапсул
позволяет защитить действующее вещество от окисления, увеличить его биодоступность и пролонгировать высвобождение [3, 4]. Среди противолейкоз-ных препаратов нового поколения широко известен «Гливек», или иматиниба метансульфонат (ИМ). Существует лекарственная форма ИМ для перорального введения - таблетки. Как и большинство противоопухолевых веществ, ИМ из-за высокой токсичности имеет побочные эффекты: нейтропению, анорексию, миалгию, отеки, сердечную недостаточность. Поэтому разработка новой лекарственной формы ИМ, например для парентерального введения и/или обеспечения пролонгированного высвобождения, весьма актуальна.
Биополимерные микрокапсулы могут быть получены методом послойного осаждения [5]. Этот процесс включает несколько стадий: синтез ядра-матрицы, формирование мультислойного покрытия на нем и растворение ядра-матрицы (рис. 1).
Разработан способ синтеза сферических микрочастиц карбоната кальция с диаметром 4-5 мкм, содержащих от 2,0 до 7,0 масс.% пектина, имеющих удельную поверхность до 20 м2/г и пригодных для использования в качестве матриц при получении микрокапсул [6] (рис. 2). Показано, что на сферических микрочастицах CaCO3 можно сформировать мультислойную (n = 4-8) оболочку путем чередующейся адсорбции белка протамина сульфата и пектинов (в том числе нанокомпозита «Пектин-Ag» [7]). При растворении микрочастиц CaCO3, содержащих пектин, 0,1 н соляной кислотой получены микрокапсулы (4-5 мкм), содержащие
во внутреннем объеме пектиновый гель, на основе прота-мина и пектинов с различной степенью этерификации и ами-дирования, в том числе на базе синтезированного нанокомпозита «Пектин-Ag» (рис. 3).
Эффективность включения ИМ в полученные микрокапсулы составляет 85,0±6,0% и существенно не зависит от типа используемого в составе капсульной оболочки полианиона (пектин или пектин-Ag). Массовая доля ИМ в капсулах достигает 50,0±5,0 масс.%.
Кинетику высвобождения ИМ из микрокапсул in vitro изучали при 37 °C, используя водные растворы с физиологическими значениями рН и ионной силы, моделирующие среду желудочно-кишечного тракта человека и/или изотоничные плазме крови. Показано, что при включении ИМ в микрокапсулы практически не изменяется его биодоступность.
Так, во всех исследуемых средах вне зависимости от значения рН и ионной силы суммарный выход ИМ составляет не менее 90% от включенного количества. Кроме того, введение ИМ в микрокапсулы позволяет по сравнению с нативной формой вещества обеспечить пролонгированность его высвобождения: в кислой среде (рН=2,0) и фосфатно-солевом буфере (рН=7,4) в течение 3-5 ч; в физиологическом растворе (NaCl) и щелочной среде (рН=9,0) - в течение 30 ч.
В условиях 72-часового воздействия на клетки хронической миелогенной лейкемии отмечено повышение цитостатической активности у инкапсулированного ИМ по сравнению с его нативной формой. Так, противоопухолевый эффект достигает 50% в концентрации 1,0 мкМ, а инкапсулированные
гельсодержащая капсула капсула с включенным биологически активным веществом
4
полая капсула
высвобождение
биологически
активного
вещества
формы подавляют рост опухолевых клеток на 50% в концентрации 0,75 мкМ для культуры клеток хронической миелоген-ной лейкемии К-562. Для культуры клеток Т-лимфобластной лейкемии MOLT-4 противоопухолевый эффект ИМ достигает 50% в концентрации 25,0 мкМ, а инкапсулированные формы подавляют рост опухолевых клеток на 50% в концентрации 7,0 мкМ.
Полисахаридные наночастицы. Для доставки лекарственных средств широко используются гидрогели на основе природных и синтетических полимеров [8]. Перспективны гидрогелевые хитозановые наночастицы (НЧ). Хитозан - биосовместимый, биодеградируемый полисахарид, обладающий бактериостатическими
Рис. 1.
Получение
биополимерных
микрокапсул
методом
послойного
осаждения
Рис. 2.
Микрочастицы карбоната кальция
Рис. 3. Микрокапсулы, содержащие во внутреннем объеме пектиновый гель, на основе протамина и пектинов
Рис. 4.
Наночастицы
Хит-ФК
с иматинибом метансульфонатом
Рис. 5. Липосомы
и мукоадгезивными свойствами и способный инициировать обратимое открытие плотных контактов между эпителиальными клетками, тем самым облегчая параклеточный транспорт соединений.
При создании носителей для противоопухолевых соединений пристальное внимание уделяется разработке средств целевой доставки. Их модифицируют молекулами, узнающими поверхностные рецепторы клеток-мишеней. Известно, что для раковых клеток характерна повышенная экспрессия фолатных рецепторов, работающих подобно антеннам: находясь на поверхности клетки, они распознают фолиевую кислоту, связываются с ней и поглощаются клеткой [9].
Для целевой доставки противолейкозного препарата ИМ были получены частицы на основе конъюгата хитозан-фолиевой кислоты (Хит-ФК), который синтезировали карбодиимидным методом с предварительной активацией карбоксильных групп фолиевой кислоты 1-этил-3-(3-диметиламинопро-пил)-карбодиимид гидрохлоридом. Синтезированы конъюгаты, содержащие от 0,9 до 9,9% фолиевой кислоты, и на их
основе при помощи ионотропного гелеобразования получены положительно заряженные частицы с (-потенциалом 22,4-26,9 мВ, средним диаметром в высушенном состоянии (по данным просвечивающей электронной микроскопии) 60±14 нм и гидродинамическим диаметром 1-2 мкм. Получены наночастицы Хит-ФК, содержащие ИМ до 14 масс.% (если фолиевой кислоты в конъюгате 0,9%) и до 49 масс.% (если фолиевой кислоты в конъюгате 5,5%) (рис. 4).
Кинетика высвобождения ИМ из гидрогелевых частиц Хит-ФК изучена в растворах, моделирующих среды желудка и крови. Они представляют собой ионотропные гели, пространственная структурная сетка которых закреплена за счет переплетения макромолекул, а также ионных и водородных связей и гидрофобных взаимодействий, которые могут быть разрушены при изменении ионной силы и pH-среды. Следовательно, высвобождение ИМ из таких носителей может протекать как за счет диффузии его молекул из частиц, так и в результате разрушения полимерной матрицы. Показано, что включение иматиниба метансульфоната в частицы на основе конъюгата хитозана с фолиевой кислотой по сравнению с нативной формой вещества позволяет обеспечить не только его целевую доставку, но и пролонгированное высвобождение в кислой среде (рН=2,0), фосфатно-солевом буфере (рН=7,4) и физиологическом растворе (рН=5,5) до 5-6 ч.
При испытании противоопухолевой активности установлено, что включение ИМ в частицы на основе конъюгата хитозан-фолиевая кислота
в 9 раз уменьшает его концентрацию, вызывающую 50%-ное подавление роста клеток хронической лейкемии К-562, по сравнению со свободной формой.
Липосомы представляют собой замкнутые сферические частицы (везикулы), содержимое которых ограничено бислоем липидов, сходным по строению и свойствам с биологической мембраной (рис. 5) [10,
11]. Для практического применения важна их способность включать в себя и удерживать вещества различной природы. Введение БАВ в везикулы может значительно повысить их терапевтическую эффективность, поскольку действующее вещество, находящееся внутри, защищено мембраной от действия неблагоприятных факторов, и в то же время не позволяет токсичному соединению превысить допустимую концентрацию в биологических жидкостях организма. Липосома в данном случае выполняет роль контейнера, из которого препарат высвобождается постепенно, в нужных дозах и в течение требуемого времени [12].
Одно из перспективных направлений для проведения лизиса тромбов - использование липосом, нагруженных тромболитическим препаратом, например стрептокиназой, представляющей собой фибринолитический фермент, переводящий неактивный плазминоген в его активную форму -плазмин [13]. Заключение БАВ в липидную оболочку позволит решить ряд проблем: сохранить активность препарата, уменьшить его дозировку без потери эффективности, снизить число осложнений.
Липосомальную форму стрептокиназы - Лип(СТК) получали гидратацией
липидной пленки водным раствором глюкозы под действием ультразвука с последующей лиофилизацией и регидратацией раствором препарата. Размер полученных липосом составил ~60 нм, а значение дзета-потенциала -20 мВ (рис. 5). Сравнительный анализ липосом после их хранения при -20 °С в течение 1 суток,
6 и 34 недель показал, что значения гидродинамического диаметра и дзета-потенциала за весь период наблюдения практически не изменяются.
Установлено, что Лип(СТК) представляет собой смесь, состоящую из свободной (~66%) и связанной (~24%) с липосо-мами стрептокиназы (СТК). Благодаря этому становится возможным не только пролонгирование действия Лип(СТК) за счет медленного высвобождения препарата из липосом, но и проявление тромболитического эффекта свободной СТК на ранних стадиях. В экспериментах in vivo на крысах, проведенных совместно с группой профессора И. Адзерихо на базе ЦНИЛ БелМАПО, установлено, что Лип(СТК) обладает более длительным тромболитическим действием по сравнению с инъекционной формой СТК. По данным морфометрического анализа тромбированных вен, через 2 ч после введения СТК и Лип(СТК) экспериментальным животным степень восстановления свободного просвета сосуда для инъекционной формы препарата составила ~90%, а для его липосомальной формы —83%. В течение 24 ч наблюдения степень тромболизиса практически не менялась для Лип(СТК), в то время как для СТК степень просвета сосуда уменьшалась до ~41%, видимо, из-за ретромбоза.
В результате проведения предварительных экспериментов in vivo на тромбированных артериях собак установлено, что локальное введение Лип(СТК) в зону тромбоза приводит к уменьшению времени реканализации сосудов с 60 до 30 мин по сравнению со СТК и увеличению степени свободного просвета сосуда с 56 до 71%. Морфометрический анализ позволил оценить конечные результаты эффективности тромболизиса без дифференцированного анализа вклада фибринолитического компонента в общую тромболитическую активность препарата. Динамика уровня Д-димера (специфического продукта расщепления поперечносшитого фибрина) в крови отражает процесс образования и разрушения уже имеющегося тромба [14]. Предполагается, что увеличение уровня Д-димера можно использовать для определения эффективности проведенного тромболизиса [15]. Изучена динамика фибринолиза тромбированной артерии при использовании Лип(СТК) путем оценки изменения во времени концентрации Д-димеров плазмы крови собак. Установлено, что наибольшее их накопление за счет проявления тромболитического эффекта стрепто-киназой происходит в период с 45 по 90 мин после формирования тромба. Для Лип(СТК) наблюдали пролонгированный эффект в течение 180 мин, в то время как для инъекционной формы через 90 мин характерно уменьшение концентрации Д-димеров [16].
Таким образом, на основе биополимеров получены нано-и микроконтейнеры для БАВ. Показано, что включение метансульфоната иматиниба
в полиэлектролитные микрокапсулы и гидрогелевые наночастицы на основе конъюгата хитозан-фолиевой кислоты обеспечивает его пролонгированное высвобождение и повышение цитотоксического действия. Проведенное комплексное исследование липосомаль-ной формы стрептокиназы указывает на перспективность ее использования при лечении тромбозов. ЕЗ
Владимир Агабеков,
директор Института химии новых материалов НАН Беларуси, академик
Виктория Куликовская,
завлабораторией Института химии новых материалов НАН Беларуси, кандидат химических наук
Ксения Гилевская,
старший научный сотрудник Института химии новых материалов НАН Беларуси
Екатерина Дубатовка,
аспирант Института химии новых материалов НАН Беларуси
|WJhttp://innosfera.by/2017/04/micro_containers
ЛИТЕРАТУРА
1. Демина Н.Б., Скатков С.А., Тенцова А.И. Нанотехнологические аспекты современной лекарственной формы // Фармация. 2012. № 4. С. 37-41.
2. Гонсалвес Н., Хальберштадт К., Лоренсин К., Наир Л. Наноструктуры в биомедицине.- М., 2012.
3. Vergaro V., Scarlino F., Bellomo C. [et al.] Drug-loaded polyelectrolyte microcapsules for sustained targeting of cancer cells // Adv. Drug Delivery Rev. 2011. V. 63. P. 847-864.
4. Печенкин М.А., Балабушевич Н.Г., Зоров И.Н. Использование ингибиторов протеаз в составе полиэлектролитных микрочастиц для увеличения биодоступности капсулируемых белков при пероральном применении // Химико-фармацевтический журнал. 2013, № 1. С. 49-56.
5. McShane M., Lvov Y. Layer-by- Layer Electrostatic Self-Assembly // Dekker Encyclopedia of Nanoscience and Nanotechnology / New York, 2004. Vol. 4. P. 1-21
6. Гилевская К.С., Шутова Т.Г., Агабеков В.Е. Синтез пористых сфернических микрочастиц карбоната кальция в присутствии биополимеров // Материалы. Технологии. Инструмент. 2011, № 1. С. 82-85.
7. Al-Muhanna Muhanna K.A., Гилевская К.С., Куликовская В.И. Получение в водных растворах пектинов стабильных золей наночастиц серебра и их свойства // Коллоидный журнал. 2015. Т. 77, № 6. С. 683-690.
8. Валуев Л.И., Валуева Т.А., Валуев И.Л., Платэ Н.А. Полимерные системы для контролируемого выделения биологически активных соединений // Успехи биологической химии. 2003, Т. 43. С. 307-328.
9. Salazar M.D., Ratnam M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics? // Cancer Metastasis Rev. 2007. V. 26. P 141-152.
10. Грегориадис Г., Аллисон А. Липосомы в биологических системах.- М., 1983.
11. Walde P., Ichikawa S. Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications // Biomolecular Engineering. 2001. N18. Р. 143-177.
12. Тараховский Ю.С. Интеллектуальные липидные наноконтейнеры в адресной доставке лекарственных веществ.- М., 2011.
13. Greineder C.F. Advanced drug delivery systems for antithrombotic agents // Blood. 2013. Vol. 122, N9. P. 1565-1575.
14. Фурман Н.В., Пучиньян Н.Ф., Ансимова О.М., Довгалевский П.Я. Повышенный уровень D-димера в плазме крови как маркер высокого риска артериальных тромбозов // Рациональная фармакотерапия в Кардиологии. 2008, № 4. C. 80-84.
15. Арутюнов Г.П., Розанов А.В. Тенектеплаза. Первый опыт применения в Российской Федерации // Сердце. 2006. № 5. С. 284-286.
16. Дубатовка Е.И., Агабеков В.Е., Лутик И.Л. Влияние липосомальной формы стрептокиназы на образование Д-димеров // Доклады Национальной академии наук Беларуси. 2016. Т. 60, № 6. С. 54-58.
<
