CC BY
102
Зарипова А.А.
Учреждение Российской академии наук Ботанический сад-институт Уфимского научного центра РАН, г Уфа
НАЧАЛЬНЫЕ ЭТАПЫ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПИОНА УКЛОНЯЮЩЕГОСЯ БОКОВЫМИ ПОЧКАМИ
Выявлена высокая морфофизиологическая активность боковых почек пиона уклоняющегося в культуре in vitro, зависящая от места их расположения на побеге, эндогенного содержания фитогормонов и срока их изоляции. В качестве эксплантов для разработки клонального размножения рекомендуется использовать боковые почки.
Ключевые слова: культура тканей и органов растений, клональное микроразмножение, пион уклоняющийся.
В основе клонального микроразмножения лежит использование уникальной способности растительных клеток реализовать присущую им тотипотентность под влиянием экспериментальных воздействий и дать начало целому растительному организму. Используя в качестве объекта боковые почки, зародыши, молодые ткани, можно клонировать растения, т.е. получать растения, генетически идентичные исходному.
Актуальным направлением в настоящее время является сохранение и воспроизводство редких видов растений. Пион уклоняющийся, марьин корень (Paeonia anómala L., семейство Paeoniaceae), в Башкортостане чрезвычайно редок [5], включен в Красную книгу Республики Башкортостан [3], отнесен к I категории - виду, находящемуся под угрозой исчезновения. Общее число учтенных особей во всех известных популяциях не превышает 500-600 экз. [6].
Разработка технологии ускоренного размножения, основанная на изучении потенциальных возможностей культивируемых in vitro тканей P. anómala., является актуальной для решения проблемы сохранения ценных и редких генотипов и в то же время - расширения сырьевой базы.
Цель исследования состояла в выявлении особенностей морфогенеза P. anómala в культуре in vitro и разработке начальных этапов клонального микроразмножения вида.
В качестве эксплантов в культуре in vitro использовали боковые почки, изолированные с побега в период его внутрипочечного ростаР. anomala.
В работе были использованы метод культуры in vitro органов, тканей и клеток [2, 1]; метод иммуноферментного анализа [4].
На первом этапе клонального микроразмножения необходимо получить стерильную, хорошо растущую культуру. Большое значение
имеет выбор стерилизующего раствора и способа дезинфекции, от которых зависит инфи-цированность эксплантов, их физиологическое состояние и уровень жизнеспособности. В связи с тем, что P. anomala является геофитом, получение стерильного материала при изолировании боковых почек для микроклонального размножения вида при введении в культуру in vitro требовало специальной разработки.
Установлено, что наиболее эффективным приемом стерилизации почек P anomala являлось применение 0,1%-ного раствора диацида (экспозиция 20 мин.) с предварительной обработкой их 70%-ным раствором этанола (1 мин.) и 3%-ной перекиси водорода (5 мин.). По разработанной схеме ступенчатой стерилизации получен достаточно высокий процент стерильного материала: максимальное число жизнеспособных почек (78%), минимальное число инфицированных (12%) и некротированных почек (10%).
Изолирование боковых почек в августе позволило достичь максимальной жизнеспособности (75% для резервных почек и 81% для боковых почек возобновления) и минимальной ин-фицированности боковых почек (10 и 14% соответственно). Доля жизнеспособных спящих почек была очень низкой во все сроки изоляции (5-7%) (табл. 1).
Морфофизиологическая активность, по-видимому, связана с физиологическим состоянием исходного растения в период изолирования экс-планта, с изменением биохимических ритмов метаболизма веществ, в том числе и содержанием фитогормонов при прохождении растением периодов роста и покоя. Учитывая большое значение баланса эндогенных гормонов в определении тотипотентности [1] , естественно предположить, что компетентность клеток к регенерации
Таблица 1. Влияние сроков изоляции боковых почек Paeonia anómala L. на показатели их инфицированности и жизнеспособности в культуре in vitro
Боковые почки Доля эксплантов, %
е нфицированных жизнеспособных í екротированных
Срок изоляции*
март май т с в а октябрь март май т с в а октябрь март май август октябрь
Резервные 32 62 10 37 49 23 75 20 19 15 15 43
Возобновления 54 74 14 49 36 12 81 13 10 14 5 38
Спящие 62 59 34 71 6 5 7 7 32 36 59 22
Примечание: * Срок изоляции и фаза развития растения: в марте - до начала отрастания побегов, в мае - в период активного роста побегов, в августе - в период окончания формирования почек возобновления, в октябре - при переходе к периоду покоя. Жизнеспособные и некротированные экспланты относили к неинфицированным.
в значительной степени обусловлена количеством и соотношением эндогенных гормонов. Сравнение содержания фитогормонов в экс-плантах P. anomala в годичном цикле его развития позволило учесть уровень эндогенных гормонов в почках и выбрать оптимальное время их изоляции. Высокое содержание ИУК и цитоки-нинов, низкое содержание АБК в боковых почках приходится на март и с августа по октябрь. Логично вводить в культуру in vitro боковые почки именно в эти периоды времени.
Исследования показали влияние срока изоляции эксплантов и фазы развития исходного растения на их регенерационную активность: самая низкая у почек, изолированных в мае, в период отрастания побегов, и в октябре, при переходе к покою, высокая - в августе, в период окончания формирования почек возобновления текущего года. Наибольшей регенерационной способностью обладали боковые почки возобновления и резервные боковые почки P. anomala, поэтому именно эти группы почек мы рекомендуем для микроразмножения.
С целью выявления оптимального содержания углеводов в питательной среде испытаны сахароза, глюкоза, мальтоза, сорбит, маннит в концентрации от 20 до 60 г/л. По комплексу двух показателей (длине побега и количеству листьев у эксплантов) концентрация сахарозы 40 г/л была оптимальной (рис. 1).
При увеличении концентрации сахарозы (50 и 60 г/л) наблюдалось удлинение побега, однако количество листьев не возрастало.
На начальных этапах культивирования боковых почек были испытаны среды Мурасиге и
Скуга, Уайта, Хеллера. Более высокие показатели выживаемости и темпов развития эксплантов отмечены на среде Мурасиге и Скуга с половинной концентрацией минеральных солей (рис. 2).
Концентрация сахарозы, г/л
і і Длина побега, мм ♦ Количество листьев
Рисунок 1. Влияние концентрации сахарозы на длину побега и количество листьев Paeonia anomala L. через 30 сут. культивирования in vitro
Продолжительность культивирования in vitro, сут
□Уайта
□ Хеллера
0МС
□ 1/2 МС
Рисунок 2. Влияние минерального состава питательной среды на рост побега Paeonia anomala L. в культуре in vitro
Таким образом, установлено, что степень морфофизиологической активности боковых почек пиона уклоняющегося в культуре in vitro зависит от места их расположения на побеге и срока изоляции экспланта. Определение уровня эндогенных гормонов в боковых почках Р. anomala позволяет выбрать оптимальный срок изоляции эксплантов. Для размножения in vitro
рекомендуется использовать боковые почки возобновления и резервные боковые почки, которые обладают высокой регенерационной способностью. Исследование начальных этапов культивирования вида позволит в дальнейшем разработать технологию клонального микроразмножения для решения проблемы сохранения вида.
Список использованной литературы:
1. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с.
2. Калинин В.Ф., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. М.: Наук. думка, 1980. 488 с.
3. Красная книга республики Башкортостан. Т. 1. Редкие и исчезающие виды высших сосудистых растений. Уфа, 2001. 212 с.
4. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Еркеев М.И. и др. Иммуноферментное определение содержания индолилуксусной кислоты в семенах кукурузы с использованием меченых тел // Физиол. раст. 1986. Т. 33. № 6. С. 1221-1227.
5. Кучеров Е.В., Мулдашев А.А., Галеева А.Х. Охрана редких видов растений на Южном Урале. М.: Наука, 1987. 204 с.
6. Мулдашев А.А., Галеева А.Х., Маслова Н.В. Проблемы охраны пиона уклоняющегося (Paeonia anomala L.) в республике Башкортостан // Проблемы сохранения биоразнообразия на Южном Урале. Уфа, 2004. С. 170-171.
