CC BY
78
Мутагенность стоков Оренбургского ГХК и растворов солей тяжелых металлов в тестах на дрозофиле
Р.Ф. Гарипова, к.биол.н., доцент, Оренбургский ГАУ
Эколого-генетическая оценка загрязнителей окружающей среды включает использование специально разработанных чувствительных тест-систем. Традиционным тест-объектом для выявления способности веществ вызывать повреждения в генетическом аппарате клеток служит дрозофила Drosophila melanogaster [1,2]. На этом объекте можно изучить мутагенность вещества
по отношению к соматическим и генеративным клеткам. Полученные данные можно экстраполировать на объекты животного происхождения, оказавшиеся в зоне влияния мутагена.
Нами исследована мутагенность сточных вод Оренбургского газохимического комплекса (ОГХК) и модельных растворов, составленных, исходя из реальной концентрации мутагенов — солей тяжелых металлов в стоках предприятия, а также их концентраций в водной вытяжке почв,
загрязненных при орошении стоками. Проведена оценка мутагенности сточных вод ОГХК в тесте на соматический мозаицизм на крыловых маркерах и в тесте на индукцию сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций (СПРЛМ).
Методика. В качестве тест-систем, определяющих частоту соматических мутаций и рекомбинаций у дрозофилы, использовали гомозиготных самок линии mwh ju и гетерозиготные самцов линии ДР (103) SE14; Аг/ТМ1, Мегі Sbd2. Исследования проводили по методике Lmdsley Gгell [3]. Самцов и самок вышеуказанных линий при скрещивании высаживали на корм, в который предварительно добавлялся 1 мл исследуемого вещества. В первом поколении получили мух с генотипом mwh/flг, фенотипически отличающихся от мух с генотипом mwh/ТМ1. Последние имели на крыльях вырезки. Для анализа мозаичных пятен использовали гетерозиготы, не имеющие вырезки на крыльях. Мух помещали на 2 часа в 75%-ный раствор уксусной кислоты, а затем в 70%-ный спирт, где они сохранялись до изготовления временных препаратов. Соматические мутации и кроссинговер учитывали по выявлению одиночных (mwh, Аг) и двойных (mwh/flг) пятен, фенотипически проявляющихся в изменении формы и числа щетинок. Одиночные пятна проявляются в результате деле-ции, нерасхождения хромосом или митотического кроссинговера при утрате одного из компонентов двойного пятна. Анализировалось 100—150 препаратов в каждом варианте при увеличении микроскопа 15x40. Оценка степени мутагенности вещества в тесте на соматический мозаицизм: значение превосходит фон на 10—50% — слабый мутагенный эффект (1 балл); на 50—100% — средний (2 балла); более чем на 100% (3 балла).
Тест на сцепленные с полом рецессивные летальные мутации проводили с использова-
нием линий Д-32 и Меллер-5 по классической схеме [4]. Исследуемое вещество (1 мл) после холодной стерилизации вносили в корм 4—5-суточных самцов дикой линии. Затем самцов скрещивали с виргинными самками М-5, от каждого тестируемого самца брали потомство самок для следующего скрещивания.
Если в Х-хромосоме сперматозоидов возникает рецессивная летальная мутация, то в культурах вместо двух классов самцов (Д-35, М-5) должны обнаруживаться только самцы М-5, а самцы дикого типа, гемизиготные по летальной мутации, не должны развиваться. Оценка степени мутагенности вещества в тесте на СПРЛМ: значение СПРЛМ составляет 1-5% — слабый мутагенный эффект (1 балл); 5—10% — средний (2 балла); более 10% - сильный (3 балла).
Пробу сточной воды перед внесением в корм пропускали через миллипоровый фильтр (МПИроге HAWP, d = 0,45 мкм). Исследуемые вещества вносили в корм при температуре 37— 40 °С перед застыванием среды. В модельных экспериментах использовали соли тяжелых металлов в следующих концентрациях (мг/л) (модель-1):
1. Медь углекислая — 5; 0,5**; 0,05*
2. Никель углекислый — 7; 0,7**; 0,07*
3. Двухлористое олово — 3; 0,3**; 0,03*
*Условное содержание соли в сточной воде,
поступающей в ёмкость сезонного регулирования (ЕСР); ** — в водной вытяжке загрязненных почв.
Результаты тестирования. Тест на соматический мозаицизм по крыловым маркерам — Аг и mwh — заключался в учете частоты одиночных и двойных пятен, фенотипически проявляющихся в изменении формы и числа щетинок. Результаты тестирования сточных вод приведены в таблице 1 вместе с результатами модельного эксперимента. По данным тестирования выявлено, что
1. Действие сточных вод и солей N1, Си, Sn на частоту возникновения соматических мутаций и рекомбинаций у дрозофилы
2. Действие сточных вод и солей Ni, Cu, Sn на частоту СПРЛМ
6
5
'
увеличение числа пятен на крыло в опыте относительно контроля происходило за счет учащения числа нерасхождений хромосом.
Второй тест на выявление частоты сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций выявил способность вещества индуцировать небольшое число леталей (табл. 2). Следовательно, сточные воды ОГХК генетически активны по отношению к генеративным клеткам животных.
В модельном эксперименте выявили функциональную активность солей никеля, меди и олова в отдельности и в сумме трёх компонентов, в концентрациях, не превышающих содержание в сточной воде, превышающих концентрацию в 10 и 100 раз. Во всех вариантах, с превосходящими в какой-либо степени контроль увеличение числа пятен на крыло происходило за счёт одиночных пятен типа Аг, аналогично варианту со сточными водами. Лишь в сумме трёх компонентов, в дозе, в 100 раз превосходящей концентрацию в сточной воде ОГХК, обнаружены видимые изменения. Идентичность нарушений, вызываемых сточными водами и исследованными солями тяжёлых металлов, показывает, что основу генетической активности сточных вод составляют именно тяжёлые металлы.
Те же компоненты оценивались в тесте на выявление частоты сцепленных с полом рецессивных летальных мутаций. При совместном действии солей никеля, меди и олова в дозе, не превышающей концентрацию в сточной воде, выявлен небольшой процент СПРЛМ (1,6%). Никель и медь в дозах, превосходящих концентрацию в сточной воде в 10 раз, также индуцируют СПРЛМ, при этом соль никеля проявляет большую активность, чем соль меди. По результатам модельного эксперимента выявлено, что никель и медь являются элементами, несущими основу генетической активности сточных вод ОГХК.
Заключение. По результатам двух тестов на дрозофиле, сточные воды ОГХК характеризуют-
ся как мутагены малой интенсивности, оказывающие слабый эффект геномных и генных мутаций на объекты животного происхождения. Мутагенная активность сточных вод основана на взаимодействии ряда компонентов. В частности, наблюдали аддитивный эффект никеля и меди при формировании цитогенетического нарушения в животной клетке.
Роль олова отразилась лишь в формировании общего токсичного фона, на основе которого происходят мутации. В модельном эксперименте установлена мутагенность растворов никеля углекислого в дозе 0,7 мг/л и меди углекислой — 0,5 мг/л по отношению к гаметам животных объектов. При одновременном присутствии в растворах эти соли способны индуцировать генные мутации в меньших концентрациях.
Данные приведённых модельных экспериментов можно использовать для прогнозирования опасности солей тяжёлых металлов при поступлении их с пищей в организм животных. Экстраполяция полученных данных на природные популяции позволяет прогнозировать эффекты гено- и цитотоксикации, прежде всего, по отношению к представителям почвенной фауны. Следствием такого воздействия может быть нарушение плодородия почв. Кроме того, можно ожидать появления новых форм насекомых, в том числе вредителей, проявляющих устойчивость к тяжёлым металлам.
Литература
1. Бочков, Н.П. Наследственность человека и мутагены внешней среды: монография /Н.П. Бочков, А.Н. Чеботарев. М.: Медицина, 1989. 268 с.
2. Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ // Программы ООН по окружающей среде М.: Медицина, 1989. С. 3-12.
3. Lindsley D.L., Grell E.H. Genetic variations of Drosophila melanogaster. Washington DC. Carnegie Jnsti tute of Washington. 1968. 472 p.
4. Орлова, М.Н. Генетический анализ: монография / М.Н. Орлова. М.: МГУ, 1991. 318 с.
