CC BY
14
34
ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 16. БИОЛОГИЯ. 2018. T. 73. № 1. С. 34-37
МИКОЛОГИЯ И АЛЬГОЛОГИЯ
УДК 582.262.24
МОРФОЛОГИЯ ПОРОВЫХ КАНАЛОВ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ У ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА EUASTRUM RALFS (DESMIDIALES)
О.В. Анисимова1*, О.В. Штаер2
1 Звенигородская биологическая станция и 2кафедра микологии и альгологии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Россия, 119234, г. Москва, ул. Ленинские горы, д. 1, стр. 12 *e-mail: [email protected]
Было проведено исследование строения клеточной стенки у 10 видов Euastrum — E. ansatum (Ehrenb.) Ralfs, E. bidentatum Näg., E. binale (Turp.) Ehrenb. ex Ralfs, E. dubium Näg., E. elegans (Breb.) Kütz. ex Ralfs, E. germanicum (Schmidle) W Krieger, E. oblongum (Grev.) Ralfs ex Ralfs, E.pectinatum Breb. ex Breb. in Ralfs, E. validum West et G.S.West, E. ver-rucosum (Ehrenb.) ex Ralfs. Изучение ультраструктуры клеточной стенки позволило впервые установить, что поровый канал у 6 из 10 видов всегда имеет в той или иной степени извитую форму. Три представителя (E. germanicum, E. pectinatum и E. verrucosum) имели как извитые, так и прямые поровые каналы, E. ansatum — только прямые. Также был отмечен новый тип пор (Р7), характерных только для представителей рода Euastrum. Отработан простой и эффективный метод подготовки клеток десмидиевых водорослей к исследованию на просвечивающем электронном микроскопе.
Ключевые слова: Euastrum, клеточная стенка, поровый канал, десмидиевые, таксономия, просвечивающий электронный микроскоп
Плакодермные десмидиевые водоросли — это группа одноклеточных представителей класса Соп-jugatophyceae, которые характеризуются симметричной формой клеток и специфической орнаментацией клеточной стенки. Особенностью этих водорослей является наличие пор, пронизывающих клеточную стенку. Образование и строение клеточных покровов изучали многие исследователи, начиная еще с конца XIX века, однако появление в XX веке сканирующего (СЭМ) и просвечивающего (трансмиссионного, ТЭМ) электронных микроскопов позволило детально изучить ультраструктуру покровов клеток. Электронно-микроскопические исследования клеточной стенки десмидиевых водорослей показали, что она образована тремя слоями [1, 2]. Наружный слой оболочки, за счет присутствия в нем пектиновых веществ, формирует слизистый чехол. Два внутренних слоя образованы фибриллами целлюлозы [3]. У представителей семейства Бе8ш1ё1а-сеае в процессе деления первичная целлюлозная клеточная стенка сбрасывается сразу после формирования вторичной, пронизанной поровыми каналами [4]. К настоящему времени накоплен большой массив данных относительно строения и морфогенеза клеточной стенки и порового аппарата в семействе Бе8ш1ё1асеае, однако исследования проводили только на нескольких представителях родов: одноклеточных — М1сган1ег1а5 [1, 5], Cosmarium [6, 7], Р1еыго1аепшт [3], Оосагйшт [8], Б1аиган1гит [9], и нитчатых колониальных — БатЬтпа, Desmidium, НуаШНеса, Spondylosium, Sphaerozosma [10].
Детальное изучение порового аппарата десми-диевых водорослей с помощью СЭМ позволило описать 6 типов пор: Р1 — двухуровневая поровая система "центральная слизевая пора"; Р2 — поро-вое отверстие открывается в круглом поровом поле; Р3 — схожие с Р2, но поровое поле более глубокое и узкое; Р4 — поровое отверстие открывается на уровне клеточной стенки, без специальных углублений; Р5 — поры, расположенные рядом с бородавками, открываются либо в их основании, либо на вершине; Рб — отверстие поры окружено валиком из клеточной стенки [11]. На примере 23 видов из 8 родов авторы показали, что наибольшее разнообразие поровых аппаратов встречается в родах Euastrum (Р1—Р5) и Cosmarium (Р2—Р4); в родах Staurastrum, Micrasterias, Tetmemorus, Pleurotaenium и Хап-thidium встречаются преимущественно поры Р4, а поры Рб обнаружены только в роде Desmidium.
Ни в одной из публикаций не описано, как поровый канал пронизывает вторичную клеточную стенку десмидиевых водорослей. Из обильного иллюстративного материала, имеющегося в публикациях, можно заключить, что у всех таксонов канал является прямым цилиндрическим и только у Staurastrum luetkemuelleri Donat at ЯиИпег [9] можно наблюдать извитой канал. Таким образом, насколько форма порового канала может варьировать у разных таксонов десмидиевых водорослей, остается не ясным.
Материалы и методы
Материалом для исследования послужили культуры 10 видов Euastrum, выделенные нами из болот Московской области — E. bidentatum Näg., E. binale (Turp.) Ehrenb. ex Ralfs, E. germanicum (Schmidle) W Krieger, E. validum West et G.S. West, E. verruco-sum (Ehrenb.) ex Ralfs, а также водоемов Карелии — E. ansatum (Ehrenb.) Ralfs, E. dubium Näg., E. elegans (Breb.) Kütz. ex Ralfs, E. oblongum (Grev.) Ralfs ex Ralfs, E. pectinatum Breb. ex Breb. in Ralfs. Водоросли выращивали на питательной среде WH [12] с соблюдением следующих условий: фотопериод (свет/ темнота, ч) 14/10, искусственное освещение светодиодными лампами (холодный белый) 5400 Лк, температура +12°С. Через 2 мес. культивирования водоросли были зафиксированы и подготовлены к исследованию с помощью ТЭМ (JEOL JEM-100B и JEOL JEM-1011, Япония). Фиксацию проводили 2,5%-ным формальдегидом в течение 1 ч при комнатной температуре, в качестве буфера использовали питательную среду WH (рН 7,0). Постфиксацию проводили 3%-ным раствором перманганата калия (1 ч). Обезвоживали материал в возрастающей концентрации этилового спирта (30%, 50%, 70%, 90%, 96%) по 10 мин. с последующим переносом в 100%-ный ацетон. В смеси смолы эпон и ацетона (1:1) материал выдерживали 24 ч, после чего переносили в смолу с катализатором и выдерживали 24 ч при температуре 37°С и 48 ч при температуре 60 °С. Серии срезов толщиной 80—120 нм были получены на ультрамикротоме Ultratom-3 (LKB, Швеция), помещены на медные бленды и контрастированы цитратом свинца в течение 8 мин. (по Рейнольдсу). Такой метод подготовки материала позволяет хорошо сохранить клеточную стенку и в
минимальной степени нарушить содержание самой клетки.
Результаты и обсуждение
В результате исследования было показано, что форма порового канала у 6 из 10 изученных видов всегда имеет в той или иной степени извитую форму. У двух таксонов встречаются прямые и извитые, а у одного — только прямые каналы (таблица). Наиболее часто встречающийся поровый канал Р4 у разных видов всегда извит и имеет равномерную толщину на всем протяжении (рисунок, А, Б). Поровый канал Р5 всегда связан с бородавками (рисунок, В, Г), располагается в их основании или на вершине и также извит. У всех видов, несущих бородавки, такие поры присутствуют.
Предыдущее наше исследование [13] показало, что для рода Euastrum характерно наличие специфических ямок (скробикул, —на поверхности клеточной стенки. При этом расположение и форма скробикул и пор всегда взаимосвязаны. Сопоставляя наши данные с классификацией пор, предложенной ранее [11], мы пришли к выводу, что тип пор Р2 необходимо переопределить. Так, поры типа 7 (Р7) представляют собой сочетание одного из вариантов поры Р2, описанной ранее, и скробикулы 82: поровый канал пронизывает утолщение клеточной стенки, которое окружено розеткой из нескольких (2—4) углублений-сегментов (рисунок, Д, Е). Такое строение поры встречается только у представителей рода Euastrum, поэтому его следует отличать от Р2. Форма порового канала рассмотрена нами на примере двух видов — Е. атаШт и Е. оЫон^т, у которых скробикулы 82 покрывают всю поверхность за исключением вершин лопастей и вздутий.
Таблица
Типы скробикул и пор у некоторых видов Euastrum
Таксон Тип скробикул Тйп пор Форма канала Длина клетки, мкм Толщина клеточной стенки, мкм Диаметр пор, мкм
Euastrum ansatum Sp S4 Р Р Р Р1, Р3, Р7 Прямой 65-102 0,49-0,65 0,07-0,09
E. bidentatum S1, S3 Р Р Р4, Р5 Извитой 40-65 0,55-0,85 0,07-0,09
E. binale S3 Р Р Р4, Р5 Извитой 14-36 0,30-0,40 0,05-0,09
E. dubium S3 ^ Р5 Извитой 22-38 0,30-0,40 0,05-0,09
E. elegans S3 ^ Р5 Извитой 24-38 0,37-0,77 0,05-0,09
E. germanicum - ^ Р5 Извитой или прямой 52-66 0,58-0,88 0,09-0,14
E. oblongum Sp S4 РР ^ Р7 Извитой 119-204 0,90-1,20 0,09-0,20
E. pectinatum - ^ Р5 Извитой или прямой 57-80 0,60-1,10 0,09-0,10
E. validum S3 ^ Р5 Извитой 24-30 0,20-0,60 0,02-0,07
E. verrucosum - ^ Р5 Извитой или прямой 75-118 0,80-0,90 0,09-0,13
36
О.В. Анисимова и О.В. Штаер
У E. ansatum поровый канал Р7 имеет прямую форму (рисунок, Е), в то время как у E. oblongum он извитой и не равномерен по толщине: наружу открывается отверстием большего диаметра (рисунок, Д).
Существует группа видов Euastrum, у которых скробикулы отсутствуют [13]. Исследованные нами E. germanicum и E. verrucosum имеют бородавки и поры Р4; в участках, где бородавок нет, располагаются поры Р5. Оболочка у E. pectinatum ячеистая, и поровые каналы Р4 пронизывают ее равномерно по всей поверхности без взаимосвязи с ячейками. На вершинах всех вздутий имеется одна пора, по своему строению идентичная Р5. Кроме того, у этих трех видов на вершине полярной лопасти располагается апикальное поровое поле, характерное для рода Cosmarium, что также указывает на необходимость пересмотра их таксономического положения.
Сопоставление размеров клеток с толщиной клеточной стенки и диаметром порового канала (таблица) подтверждает гипотезу [11, 14], согласно которой у более крупных клеток толщина оболочки и диаметр пор больше, чем у мелких. Так, у мелкоклеточных видов (длина клеток не более 40 мкм) E. binale, E. dubium, E. elegans, E. validum толщина клеточной стенки варьирует от 0,2 до 0,7 мкм, а диаметр пор — от 0,02 до 0,09 мкм. Виды с клетками крупных размеров (более 40 мкм длиной) — E. an-satum, E. bidentatum, E. pectinatum, E. oblongum, E. ver-rucosum, имеют в среднем более толстую клеточную стенку и широкий поровый канал (от 0,09 мкм).
Учитывая поставленные задачи — исследовать поровый аппарат клеточной стенки водорослей, мы опробовали несколько вариантов подготовки образцов к ТЭМ. Классический и универсальный метод двойной фиксации представляет собой последовательную фиксацию в 2,5%-ом глутаровом альдегиде и 1-2%-ном тетраоксиде осмия (на фосфатном буфере рН 7,2—7,4), а также отмывку в дистиллированной воде с последующим контрастированием 2%-ным уранилацетатом. Другой, несколько устаревший, метод с использованием 2,5%-ного формалина и 3%-ного водного раствора перманганата калия, приводит к некоторой деформации эндомембранных структур и органелл клетки. Для нашей работы сохранность внутренней ультраструктуры клетки желательна, но при условии сохранения структуры клеточной стенки, близкой к прижизненной, недостатками химической фиксации можно пренебречь. При сравнении результатов нескольких вариантов пробоподготовки оказалось, что устаревший метод, где вместо буфера мы использовали питательную среду WH, хорошо сохраняет структуру клетки, включая мембранные элементы. Это наиболее подходящие реагенты для работы с водорослевыми клетками (процесс предполагает поштучный отбор исследователем клеток десмидиевых водорослей на каждом этапе подготовки, вплоть до заливки в смолу эпон). Стоит отметить, что использование менее токсичных и летучих реактивов значительно упрощает работу и при этом гарантирует качественный результат (рисунок).
Исследования проведены в рамках госзадания МГУ, ч. 2 (р. 01 10), на оборудовании Центра коллективного пользования МГУ имени М.В. Ломоносова при финансовой поддержке Министерства
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Drawert H., Metzner-Kustei I. Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen an Desmidiaceen. I. Mitteilung. Zellwand- und gallelgtstrukturen bei einigen arten // Planta. 1961. Vol. 56. N 1. P. 213-228.
2. Mix M. Die Feinstruktur der Zellwände bei Mesotae-niaceae und Gonatozygaceae mit einer vergleichenden Betrachtung der verschiedenen Wandtypen der Conjugatophyceae und über deren systematischen Wert // Arch. Mikrobiol. 1972. Vol. 81. N 3. P. 197-220.
3. Drawert H., Mix M. Licht- und elektronenmikirosko-pische Untersuchungen an Desmidiaceen. II. Mitteilung Hüllgallerte und Schleimbildusig bei Micrasterias, Pleurotaenium und Hyalotheca // Planta. 1961. Vol. 56. N 3. P. 237-261.
4. Brook A.J. The biology of Desmids. Botanical Monographs, vol. 16. Oxford: Blackwell, 1981. 276 pp.
5. Oertel A., Aichinger N., Hochreiter R., Thalhamer J., Lutz-Meindl U. Analysis of mucilage secretion and excretion in Micrasterias (Chlorophyta) by means of immunoelectron microscopy and digital time lapse video microscopy // J. Phycol. 2004. Vol. 40. N 4. P. 711-720.
6. Lott J.N.A., Harris G.P., Turner Ch.D. The cell wall of Cosmarium botrytis // J. Phycol. 1972. Vol. 8. N 3. P. 232-236.
7. Cheli F., De Vecchi L. An ultrastructural and cyto-chemical study on Conjugatophycean cell wall // Caryologia. 1989. Vol. 42. N 2. P. 127-137.
8. Rott E., Holzinger A., Gesierich D., Kofler W., Sanders D. Cell morphology, ultrastructure, and calcification pattern of
образования и науки РФ. Работы, связанные с формированием коллекции культур, выполнены при поддержке Российского научного фонда (проект №14-50-00029).
Oocardium stratum, a peculiar lotic desmid // Protoplasma. 2010. Vol. 243. N 1-4. P. 39-50.
9. Andersen S., Heldal M., Knutsen G. Cell wall structure and iron distribution in the green alga Staurastrum luetkemuelleri (Desmidiaceae) // J. Phycol. 1987. Vol. 23. N 4. P. 669-672.
10. Gerrath J.F. Studies on the ultrastructure of desmids and its relation to their taxonomy. Vancouver: Univ. British Columbia, 1968. 165 pp.
11. Neuhaus G., Kiermayer O. Formation and distribution of cell wall pores in desmids // Cytomorphogenesis of plants. Cell biology monographs, vol. 8 / Ed. O. Kiermayer. Vienna: Springer, 1981. P. 215-231.
12. Schlösser U.G. Origin and function of the culture collection // Ber. Deutsch. Bot. Ges. 1982. Vol. 95. N 2. P 181-276.
13. Anissimova O.V. Architecture of cell wall of Euastrum Ralfs: new genus critheria // Moscow Univ. Biol. Sci. Bull. 2016. Vol. 71. N 3. P. 155-159.
14. Mix M. Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen an Desmidiaceen. XII. Zur Feinstruktur der Zellwände und Mikrofibrillen einiger Desmidiaceen vom Cos-marium-Typ // Arch. Mikrobiol. 1966 Vol. 55. N 2. P. 116-133.
Поступила в редакцию 06.07.2017 Принята в печать 11.12.2017
MYCOLOGY AND ALGOLOGY
MORPHOLOGY OF CELL WALL PORE CHANNELS IN GENUS EUASTRUM RALFS
(DESMIDIALES)
O.V. Anissimova1'*, O.V. Staer2
1Zvenigorod Biological Station and 2Departament of Mycology and Algology, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1—12, Moscow, 119234, Russia *e-mail: [email protected]
The study of the cell wall structure was performed for 10 species of Euastrum — E. ansatum (Ehrenb.) Ralfs, E. bidentatum Nag., E. binale (Turp.) Ehrenb. ex Ralfs, E. dubium Nag., E. elegans (Breb.) Kutz. ex Ralfs, E. germanicum (Schmidle) W Krieger, E. oblongum (Grev.) Ralfs ex Ralfs, E. pectinatum Breb. ex Breb. in Ralfs, E. validum West et G.S.West, E. verrucosum (Ehrenb.) ex Ralfs. The investigation of the cell wall ultrastructure has established, for the first time, that the pore canal in 6 of 10 species always has to some degree coiled form. Three species (E. germanicum, E. pectinatum и E. verrucosum) have both coiled and straight canals, and E. ansatum — only straight ones. Also new type of pores (P7), typical only for representatives of the genus Euastrum, was noted. Besides, simple and effective method of preparing desmidium algal cells for investigation with transmission electron microscope has been developed.
Keywords: Euastrum, cell wall, pore canal, Desmidiaceae, taxonomy, transmission electron microscopy
Сведения об авторах
Анисимова Ольга Викторовна — канд. биол. наук, вед. науч. сотр. Звенигородской биологической станции биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-27-64; e-mail: [email protected]
Штаер Оксана Васильевна — канд. биол. наук, науч. сотр. кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-27-64; e-mail: [email protected]
