CC BY
49
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Коллектив авторов, 1992 УДК 616-018-006.04:576:535:576.314
Ю.А. Ровенский, Е.В. Комиссарова, Л.З. Тополь, Ф.Л. Киселев
Морфологический маркер начальной стадии неопластической трансформации фибробластов в культуре
НИИ канцерогенеза
Согласно современным представлениям, неопластическая трансформация клеток в культуре, спонтанная или индуцированная химическими канцерогенами, онкоген-ными вирусами или трансфекцией клонированных онкогенов, включает в себя как минимум две стадии: иммор-тализацию и собственно трансформацию [13]. В начальной стадии трансформации клетки первичной культуры приобретают способность к размножению в течение неограниченного числа пассажей, культура становится клеточной линией. Иммортализованные клетки могут неопределенно долго сохранять морфологические характеристики и ряд других свойств исходных нормальных культур, поэтому такие линии иногда называют минимально трансформированными. В последующем иммортализованные культуры могут претерпевать характерные морфологические изменения, а также приобретать ряд других признаков трансформации (онкогенность и др.), что свидетельствует о превращении этих культур в клеточные линии с выраженной трансформацией [1 ].
Иммортализованные культуры, сохраняющие большинство признаков нормальных первичных культур, в последние годы привлекают внимание исследователей в качестве моделей для изучения методом трансфекции трансформирующего действия активированных онкогенов в опухолевых клетках человека и животных [2, 4, 8,12, 16 ].
Возникает, однако, вопрос: действительно ли начальная стадия трансформации клеток — иммортали-зация — никак не проявляет себя морфологически?
Для выяснения этого мы исследовали иммортализованные клетки не только в условиях их монослойного роста, но также и в суспендированном состоянии — после искусственного открепления от субстрата. Находясь во взвеси, клетки приобретают сферическую фор-
ORIGINAL PAPERS
EXPERIMENTAL INVESTIGATIONS
Yu. A. Rovensky, E.V. Komissarova, L.Z. Topol, F.L. Kiseljov
Morphological Marker of Initial Stage of Neoplastic Transformation in Fibroblastic Cultures
Research Institute of Carcinogenesis
According to the present conception the neoplastic cell transformation in culture, both spontaneous and induced by chemical carcinogens, oncogenic viruses or transfection of cloned oncogenes, consists at least of two stages, i.e. immortalization and transformation proper [13]. At the initial stage of the transformation cells of the primary culture acquire the ability of reproduction for an unlimited number of passages, the culture becomes a cell line. The immortalized cells can preserve morphological and some other features of the primary normal cultures, that is why such lines are sometimes referred to as cell lines of minimal transformation. The immortalized cells can further undergo characteristic morphological changes, as well as obtain other features of transformation, e.g. oncogenicity, which is evidence of the culture conversion into a cell line of full transformation [1 ].
Over the last years the interest of the investigators has been focussed on immortalized cultures that preserve most features of the normal primary cultures and can be used as models for study of the transforming action of activated oncogenes in human and animal tumor cells using transfection techniques [2, 4, 8-12, 16 ].
However, a question arises, whether the initial stage of the cell transformation, i.e. immortalization, does not really have any morpholigical manifestations?
In order to answer this question we investigated immortalized cells both in monolayer cultures and in suspension state after artificial detachment of the cells from the substrate. In suspension the cells became spherical, their surface had a complicated relief. By scanning electron microscopy (SEM) we studied peculiarities of the cell surface relief in cell suspensions derived from various monolayer cultures: primary, immortalized and morphologically transformed rat fibroblasts.
му и сложный рельеф клеточной поверхности. С помощью растровой электронной микроскопии (РЭМ) изучили особенности рельефа поверхности клеток в суспензиях, полученных из различных монослойных культур: первичных, иммортализованных и морфологически трансформированных фибробластов крысы. Материалы и методы. В работе были использованы следующие клеточные культуры: 1) REF — первичная культура эмбириональных фибробластов крысы линии Fisher, в опытах использовали клетки 3-4 пассажей; 2) REF(LT) — клеточная линия, полученная из REF в результате трансфекции клонированным геном большого Т-антигена вируса полиомы [2]; 3) REF(LT) ras — клеточная линия, полученная в результате трансфекции клеток REF(LT) активированным онкогеном c-Ha-ras [4]; 4) REF-1 — клеточная линия, полученная из REF после трансфекции клонированным геном ELA области аденовируса обезьян SA7 [8]; 5) REF-2Ej — клеточная линия, полученная из опухоли, развившейся у бестимусной мыши в результате трансплантации клеток REF-1, дважды трансфицированных онкогеном Ej-ras человека [9]. Клетки культивировали на покровных стеклах, а также в культуральных чашках ("Falcon") в течение 24-48 ч. Для культивирования клеток REF и REF-1 использовали среду ДМЭМ с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, для других клеточных линий — с 5% сыворотки. Культуры на покровных стеклах фиксировали в 2% растворе глутаро-вого альдегида на 0,1 М натрий-какодилатном буфере с добавлением
0,1 М сахарозы. Культуры в чашках использовали для получения клеточных суспензий: клетки снимали со дна чашек смесью 0,25% раствора трипсина с 0,02% раствором ЭДТА, отмывали и фиксировали в растворе глутарового альдегида с сахарозой. Фиксированные во взвеси клетки готовили к РЭМ по описанным ранее методам [5, 6]. При РЭМ суспендированных клеток определяли процентное содержание клеток с различными типами рельефа поверхности [15].
Результаты. Клетки в монослойных культурах. Клетки REF имеют фибробластоподобную форму, распластаны и значительно уплощены, обладают развитой ламеллярной цитоплазмой; поверхность клеток лишена каких-либо морфологических образований и выглядит сглаженной (рис. 1, а). Клетки формируют упорядоченный монослой.
Клетки линий REF(LT) и REF-1 обладают морфологической структурой и характером роста, сходными с описанными выше у клеток — REF (рис. 1, в, с). Данные РЭМ совпадают с ранее полученными результатами световой микроскопии [2, 8 ].
Клетки линий REF(LT)ras и REF-2Ej представляют собой морфологически смешанные популяции: наряду с уплощенными фибробластоподобными клетками со сглаженной поверхностью значительная часть клеток сильно поджата, имеет полусферическую, треугольную или веретеновидную форму с сильно редуцированной ламеляр-ной цитоплазмой (рис. 1, d). Поверхность таких малоуп-лощенных клеток обычно обладает сложным рельефом. Клетки часто подползают друг под друга своими телами или отростками. Эта картина соответствует ранее полученным данным световой микроскопии [3, 9 ].
Клетки в суспензиях. Находясь во взвеси, клетки приобретают сферическую форму. Рельеф их поверхности при этом становится весьма многообразным.
Materials and Methods. The following cell cultures were used in the study: 1) REF, a primaiy culture of embryo fibroblasts of Fisher rats, 3-4 passage cells were used in the experiments; 2) REF(LT), a cell line derived from REF by transfection of a cloned gene of the polyoma virus large T-antigen [2]; 3) REF(LT)ns, a cell line resilting from transfection of c-Ha-ras activated oncogene into REF(LT) cells [4]; 4) REF-1, a cell line obtained by transfect ion of the cloned simian adenovirus A7 El A gene into REF sells [8]; 5) REF-2Ej, a cell line derived from a tumor developing in an at-hymic mouse by transplantation of REF-1 cells twice transfected with the Ej-ras human oncogene [9].
The cells were cultured on cover-slips and in Falcon cultural dishes for 24-48 h. We used DMEM with 10% of fetal calf serum for REF and REF-l cells, and DMEM with 5% of the serum for other cell lines. The cultures on cover-slips were fixed with 2% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodyiate buffer supplemented with 0.1 M sucrose. The cultures in dishes were used to prepare cell suspensions: the cell were detached from the dish bottoms with a mixture of 0.25% trypsin solution and 0.02% EDTA solution, washed and fixed with 2% glutaraldehyde with sucrose. The cells fixed in suspension were prepared for SEM by techniques described elsewhere [5, 6].
By SEM of the suspended cells we determined the percentage of cells with different types of surface relief [15].
Results. Cells in Monolayer Culture. The REF cells are of a fibroblast-like shape, spread extensively on the glass and considerably flattened, have a developed lamellar cytoplasm; the cell surface is smooth and free from any morphological peculiarities (fig.l, a). The cells form a regular monolayer.
The cells of the REF(LT) and REF=*\ lines have morphological and growth patterns similar to those of the REF cells (fig.l, b, c). The SEM data are in agreement with previous light microscopy findings [2, 8 ].
The REF(LT) ras and REF=2Ej cells are morphologically mixed populations: together with flattened fibro-blast-lake cells with a smooth surface there are a considerable number of cells of a hemispheric, triangle or spindle shape with a significantly reduced lamellar cytoplasm (fig. 1, d). The surface of these slightly flattened cells has a complex relief. The cell bodies and processes are often creeping under each other. This pattern is in agreement with previous data of light microscopy [3, 9 ].
Cells in Suspension. The cells in suspension have a spherical shape. There is a variety of cell surface reliefs observed. However, these reliefs can be grouped into several morphological types determined by the pattern of structures predominating in the given surface relief: there are usually different surface relief types in a cell suspension of the same population (fig. 2).
The data about percentages of cells with a certain relief in suspensions derived from various monolayer stuctures are presented in the table. Cells with a blebbed relief predominate in the REF population (see fig. 2, a), their relative content is more than 5 times as great as that of microvillous cells (see fig. 2, b).
Cells with a microvillous relief prevail in the other populations, their percentage is much greater than that of
Это многообразие можно, однако, свести к нескольким морфологическим типам, определяемым характером структур, превалирующих в данном рельефе: среди суспендированных клеток одной и той же популяции обычно встречаются разные типы рельефа (рис. 2).
Данные об относительном содержании клеток с определенным типом рельефа поверхности в суспензиях, полученных из различных монослойных культур, приведены в таблице. В популяции REF клетки с пузырчатым рельефом составляют большинство (см. рис. 2, а), причем их относительное содержание бсшее чем в 5 раз превышает содержание клеток с микроворсинчатым типом рельефа (см. рис. 2, Ъ).
В остальных популяциях преобладают клетки с микроворсинчатым рельефом, их относительное содержанием значительно превалирует над содержанием клеток с пузырчатым рельефом. Так, в популяциях REF-1 и REF(LT) клетки с микроворсинчатым рельефом встречаются соответственно почти в 5 и 7 раз чаще, чем клетки с пузырчатым рельефом. Особенно высоким это соотношение оказывается в популяциях REF(LT)ras (более чем в 13 раз) и REF-2Ej (почти в 18 раз).
Обсуждение. Ранее нами было обнаружено, что в клеточных суспензиях, полученных из первичных культур фибробластов и из различных фибробластических линий с выраженной трансформацией (по морфологическим и другим признакам), наблюдаются определенные различия в количественном соотношении клеток с пузырчатым и микроворсинчатым типами рельефа поверхности. В суспензиях нормальных фибробластов клетки с пузырчатым рельефом, как правило, преобладают над клетками с микроворсинчатым рельефом; для суспензий сильно трансформированных фибробластов характерным является обратное соотношение [14]. В данной работе указанные закономерности подтверждаются при сравнительном анализе суспендированных клеток, полученных из первичных культур фибробластов REF и из двух морфологически трансформированных туморогенных линий: REF-2Ej и REF(LT)ras.
Особый интерес представляют собой иммортализован-ные культуры REF (LT) и REF-1. Как было показано, морфологически клетки этих линий в условиях монослойного роста не отличаются от нормальных фибробластов REF. Структура актинового цитоскелета и развитие фибронек-тиновой сети клеток линии REF(LT) были сходны с наблюдаемыми в фибробластах REF [3 ]. Клетки обеих им-мортализованных культур не туморогенны и, подобно нормальным фибробластам, обладают высокой субстратной зависимостью размножения и топоингибицией [2, 8 ].
Таким образом, за исключением иммортализации, а также при некотором снижении потребности в сывороточных ростовых факторах, выявленном у клеток линии REF (LT) [2 ], иммортализованные культуры в условиях монослойного роста фенотипически не отличаются от нормальных фибробластов. Различия, однако,
blebbed cells. Thus, in the REF** 1 and REF(LT) populations cells with a microvillous relief are about 5 and 7 times, respectively, as frequent as cells with a blebbed relief. This ratio is the greatest in the REF(LT)ras (more than 13) and REF=*2Ej (about 18) populations.
Discussion. We found out previously that cell suspensions derived from fibroblast primary cultures and from various fibroblastic lines with full transformation (by morphological or other signs), exhibited a certain difference in percentages of cells with blebbed and microvillous types of surface relief. In suspensions of normal fibroblasts cells with a blebbed relief predominated over cells with a microvillous relief, while the reverse relationship was characteristic of suspensions of fully transformed fibroblasts [14 ].
Comparison of suspended cells derived from the fibroblast primary culture REF and from the two morphologically transformed tumorigenic lines REF=2Ej and REF(LT) ras perfomed in this investigation has confirmed the regularities found previously.
The immortalized cultures REF (LT) and REF=1 are of special interest. Cells of these lines have been shown not to differ in morphology fron the normal fibroblasts REF if grown in a monolayer. The actin cytoskeleton structure and fibronectin network of the REF (LT) cells are similar to those in the fibroblasts REF [3 ]. Cells of both immortalized cultures are not tumorigenic and exhibit high anchorage dependence and topoinhibition [2, 8 ].
So, except for immortalization (and a somewhat lower need in serum growth factors detected in the REF(LT) cells [2 ]), the immortalized cultures do not differ phenotypically from normal fibroblasts under the conditions of monolayer growth. However, the differences do manifest themselves when the cells are suspended. Our experiments have shown that percentages of cells with blebbed and microvillous surface reliefs in suspensions derived from immortalized cultures REF(LT) and REF=l differ considerably from those in the REF suspensions and are similar to the percentages in suspensions derived from the fully transformed lines REF=2Ej and REF(LT) ras.
We showed previously that the pattern of surface relief of mouse fibroblasts in suspensions derived from monolayer cultures was determined by the degree of their previous spreading on the substrate before the detachment: the most spread cells mainly acquired blebbed relief in suspension; while the less spread the cell was, the more probably the relief was microvillous in suspension. Besides, fibroblasts of different degree of spreading demonstrated marked distinctions inorganiz-ation of their actin cytoskeleton: bundles of actin microfilaments participating in the contacts of the cell and the substarate were clearly seen in well spread cells only [7, 14]. Therefore, the surface relief in suspended fibroblacts can be determined by the previous contact of
Рис. 1. РЭМ монослойных культур фибробластов.
Фибробласты первичной культуры REF (а) и иммортализованные фибробласты линий REF(LT) (Ь) и REF-1 (с) значительно уплощены, имеют сглаженную поверхность; сильно трансформированные фибробласты линии REF(LT)ras (с/) поджаты, имеют сложный рельеф. Х256 (a, d), Х500 (Ь, с) Fig. 1. SEM of fibroblastic monolayer culture.
The fibroblasts of the primary culture REF(a) and immortalized fibroblasts of the lines REF(LT) (b) and REF=I (c) are well spread, considerably flattened and have smooth surfaces; the fully transformed fibroblasts of the line REF(LT)ras (d) are poorly spread and have a complex surface relief. x256 (a, c/), x500 (b, c).
Рис. 2. РЭМ суспендированных фибробластов. Тип рельефа клеточной поверхности: а — пузырчатый, Ь — микроворсинчатый, с — складчатый, d — смешанный. Х2000 Fig. 2 SEM of suspended fibroblasts.
a, blebbed; b, microvillous; c, folded; d, mixed surface reliefs. x2000.
выявляются при переводе клеток в суспендированное состояние. Как показали наши опыты, количественное соотношение клеток с пузырчатым и микроворсинча-тым рельефами в суспензиях, полученных из имморта-лизованных культур REF(LT) и REF-1, значительно отличается от такового в клеточных суспензиях REF и приближается к наблюдаемому в суспензиях, полученных из сильно трансформированных линий REF-2Ej и REF(LT)ras. Ранее нами было показано, что характер рельефа поверхности фибробдастов, перешедших во взвешенное состояние из монослойной культуры, определяется степенью их предшествующего распластывания на субстрате: максимально распластанные клетки приобретают во взвеси преимущественно пузырчатый тип рельефа; чем слабее была распластана клетка, тем более вероятно для нее при переходе во взвесь приобрести микроворсинчатый рельеф. Кроме того, у фибробдастов с различной степенью распластывания наблюд ались выраженные различия в организации активного цитоскелета: пучки актиновых микрофи-ламентов, участвующих в контактных взаимодействиях клетки с субстратом, были выражены только у достаточно распластанных клеток [7, 14]. Таким образом, характер рельефа поверхности у фибробласта во взвеси может определяться ёго предшествующим контактным взаимодействием с субстратом в монослойной культуре. В данной работе, однако, нам не удалось выявить видимых различий в степени распластывания у нормальных (REF) и имморгализо-ванных (REF(LT) или REF-1) фибробластов; организация актинового цитоскелета у клеток REF(LT) не отличалась от наблюдаемой у нормальных фибробластов [3 ]. Тем не менее возможно, что в иммортализованных культурах имеются какие-то специфические нарушения в контактном взаимодействии клеток с субстратом и связанные с ними изменения в организации цитосклелега, что и могло отразиться на характере рельефа поверхности клеток после их перехода в суспендированное состояние. Таким образом, наши опыты показали, что характер рельефа поверхности клеток в суспензиях, полученных из фибробластических мо-нослойных культур, может служить морфологическим маркером начальной стадии неопластической трансформации — иммортализации, когда в условиях монослойного роста характерные морфологические признаки трансформации клеток еще не проявляются.
Литература / References
1. Васильев Ю.М., Гельфанд И.М. Взаимодействие нормальных и
неопластических клеток со средой. — М., 1981.
2. Комиссарова Е.В., Ревазова Е.С., Киселев Ф.Л. //Бюл. экспер.
биол. — 1988. — № 3. — С. 347-349.
3. Комиссарова КВ., Бершадский А.Д., Любимов А В., Ки-
селев Ф.Л. II Докл. АН СССР. — 1989. — Т. 306. — С. 985-987.
4. Комиссарова КВ., Спитковский Д. Д., Мазуренко Н.Н.,
Татосян АГ. II Молекул, генетика. — 1990. — № 2. — С. 19-22.
5. Ровенский Ю.А. II Цитология. — 1978.— Т 20. — С. 365-367.
6. Ровенский Ю.А. Растровая электронная микроскопия нормальных
и опухолевых клеток. — М., 1979.
Содержание клеток (в %) с различными типами рельефа поверхности в суспензиях, полученных из монослойных культур Percentages of cells with different types of surface reliefs in suspensions derived from monolayer cultures
Клетки Тип рельефа
П MB П+МВ С
REF 64±5,3 12±8,1 23+4,9 1+0,6
REF-1 10±2,9 47±10,3 43±11,2 0
REF(LT) 10±3,4 68±8,1 19±7,6 3±2,4
REF(LT)ras 6±4,2 82±7,8 5±0,4 7±3,5
REF-2EJ 4±1,9 73±7,0 21+6,1 2± 1,4
Cells В MV B+MV F
Relief pattern
Примечание. MB — микроворсинчатый тип рельефа, П — пузырчатый, П+МВ — смешанный: представлен пузырями и микроворсинками примерно в одинаковом соотношении, С — складчатый. /Note. MV, microvillous; В, blebbed; B+MV, mixed (about equal amount of blebbed and microvillous surface cells) and F, folded relief patterns, the cells with the substrate in the monolayer culture. In this investigation, however, we failed to find any apparent differences in spreading degree of normal (.REF) and immortalized (REFOLDor REF=l) fibroblasts; organization of the actin skeleton in the REF(LT) did not differ from that in the normal fibroblasts [3 ]. Nevertheless, it is possible that there are some subtle abnormalities in the cell-substrate contact interaction, as well as changes in the cytoskeleton organization related to these abnormalities in immortalized cultures which could take effect on cell surface relief after the cells were converted into the suspension state.
So, our experiments have shown that surface relief of cells in suspension derived from fibroblastic monolayer cultures may be a morphological marker of the initial stage of neoplastic transformation, i.e. immortalization, when characteristic morphological features of cell transformation do not manifest themselves in monolayer culture yet.
7. Ровенский Ю.A. II Цитология. — 1983. — T. 25. — C. 290-296.
8. Тополь Л.З., Таракховский A.M., Ревазова E.C., Ки-
селев Ф.Л. II Бюл. экспер. биол. — 1986. — № 2. — С. 190-192.
9. Тополь Л.З., Спитковский Д.Д., Киселев Ф.Л. II Там же. — 1988. — №3. — С. 329-332.
10. Тополь Л.З., Татосян А.Г., Блейр Д., Киселев Ф.Л. II Молекул, биол. — 1991. — Т. 25. — С. 541-551.
М. Bedell М.А., Jones КН., Laimins L.A. II J. Virol. — 1987. — Vol. 61. —P. 3635-3640.
12. Land H., Parada L.F., Weinberg R.A. //Nature. — 1983. — Vol. 304.—P. 596-601.
13. Newbold R.F., Overell R.W., ConnelJ.R. // Ibid. — 1982. — Vol. 299. — P. 633-635.
14. Rovensky Yu.A., Vasiliev Ju.M. II Int. Rev. Cytol. — 1984. — Vol. 90. — P. 273-307.
15. Samilchuk E.I., Rovensky Yu.A. // Scanning. — 1980. — Vol.3. — P. 233-237.
16. Sistonen L., Keski-Oja. J., Ulmanen I. et al. // Exp. Cell Res. — 1987. — Vol. 168. — P. 518-530.
Поступила 04.04.92. / Submitted 04.04.92.
