CC BY
42
УДК: 616.5-001.17-089.844:622-057.2
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАНЕВОГО ПРОЦЕССА В ОЖОГОВЫХ РАНАХ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ КУЛЬТУРЫ
АЛЛОФИБРОБЛАСТОВ
В.В. Солошенко
Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи им. И. И. Джанелидзе,
Санкт-Петербург, Россия
Институт неотложной и восстановительной хирургии им. В.К. Гусака, Донецк, Украина
В работе представлено морфологическое исследование ожоговых ран у 14 обожженных шахтеров. В лечении пострадавших использовалась трансплантация культуры аллофибробла-стов для стимуляции репаративных процессов в ожоговой ране после иссечения некротического струпа. Пострадавшие в результате взрывов метано-угольной смеси находились на лечении в Донецком ожоговом центре в период с 2009 по 2012 год. Общая площадь поражения у данных пострадавших составляла 59,29±5,26% поверхности тела, в том числе глубокого — 14,07±4,51%. Ожоговые раны характеризовались мозаичностью поражения, наблюдалось чередование участков поверхностных и глубоких дермальных ожогов. В биопсийном материале из ожоговых с помощью морфометрии определяли площадь участков с новообразованным эпителием на 7 и 14 сутки после трансплантации культуры аллофибробластов. Установлено, что на участках ожоговых ран, где использовалась культура аллофибробластов, средняя площадь пласта новообразованного эпителия составила 6,24±0,26 мм2, в то время как на контрольных участках средняя площадь новообразованного пласта эпителия равна 3,66±0,17 мм2. Различия между цифровыми значениями площади новообразованного эпителия достоверны при p<0,05 (Mann-Whitney U Test). Применение культуры аллофибробластов в 1,7 раза ускорило процесс образования эпителиального пласта на участках кожи с сохранившимся регенераторным потенциалом в сравнении с контрольными участками ожоговых ран, где клеточные технологии не применялись.
Ключевые слова: ожог, аллофибробласты, хирургическое лечение, морфологическое исследование.
Введение
В современной комбустиологии все активнее используются клеточные технологии [1-4]. Традиционный хирургический подход к лечению обожженных с обширной площадью дермаль-ного ожога (более 30%), по мнению авторов, практически исчерпал резервы для своего дальнейшего развития. В связи с этим в поисках возможностей совершенствования методов лечения ран и повышения их клинической эффективности на первое место выходят методы, направленные на разработку биотехнологических раневых покрытий с использованием культуры аллофибробластов [5]. Наибольшее развитие трансплантация аллофибробластов нашла в лечении пограничных и глубоких ожогов [6]. Трансплантированные аллогенные фибробласты оказывают позитивное влияние на цитологическую кар-
тину ожоговой раны, что выражается в смене, воспалительного типа цитограммы на воспалительно-регенераторный [7].
При ожогах пламенем взрыва метано-угольной смеси в ограниченном шахтном пространстве практически всегда происходит обширное мозаичное термическое поражение кожи, с формированием первичного некротического струпа под которым чередуются участки поверхностного и глубокого ожога. Поэтому радикальные методы ранней некрэк-томии нерационально применять из-за возможности удаления жизнеспособных участков кожи с сохраненным регенераторным потенциалом эпителизации. Для разработки показаний по применению культуры аллофибробла-стов мы изучили морфологию ожоговой раны как при использовании клеточной культуры
так и при стандартных способах ведения ожоговых ран.
Цель исследования: морфологически изучить влияние культуры аллофибробластов на течение раневого процесса в ожоговой ране у пострадавших при взрывах метано-угольной смеси.
Материалы и методы исследования
Для выполнения поставленной задачи нами отобрано 14 больных, которые пострадали от взрывов метано-угольной смеси на шахтах Донбасса и имели обширные дермальные ожоги. Они находились на лечении в Донецком ожоговом центре в период с 2009 по 2012 год. Ожоговые раны характеризовались мозаич-ностью поражения, наблюдалось чередование ожогов пламенем ША и ШБ степени. В лечении данных пострадавших использовалась культура фетальных аллофибробластов на коллагеновом носителе, приготовленная к моменту оперативного вмешательства в лаборатории клеточного и тканевого культивирования Института неотложной и восстановительной хирургии им. В. К. Гусака.
Общая площадь поражения у данных пострадавших составляла 59,29±5,26% поверхности тела, в том числе глубокого — 14,07±4,51%. Трансплантацию клеточной культуры проводили в условиях операционной после выполнения тангенциальной некрэктомии на участках ожоговых ран с пограничными дермальными ожогами или так называемым «мозаичным поражением кожи».
От исследования мы ожидали два результата — ускорения эпителизации при поверхностных дермальных ожогах или более быстрого формирования грануляционной ткани для подготовки раны к последующей операции: аутопластике расщепленным аутодермо-трансплантатом при глубоких ожогах. Эти два явления регенерации прослеживались на одной ожоговой ране из-за мозаичности поражения по глубине.
Первичное формирование ожогового струпа в ожоговых ранах предполагало выполнение некрэктомии. По клиническим признакам раневая поверхность при первично сформированном дермальном струпе в первые 2-3 суток после травмы не позволяла четко дифференцировать поверхностные от глубоких дермаль-ных поражений. Поэтому первая некрэктомия выполнялась не ранее 7 суток после травмы,
на данных участках мозаичного поражения производилась тангенциально, толщина иссекаемого некротического струпа составляла менее 1 мм. Для выполнения некрэктомии на фиксированную глубину использовали дисковые дерматомы.
Состояние ожоговой раневой поверхности у 14 пострадавших мы исследовали морфологически трижды в процессе лечения. Для исследования мы брали два визуально одинаковых участка ожоговой раны, расположенных на контрлатеральных сегментах верхних конечностей, идентичность по глубине поражения подтверждена с помощью лазерной допплеровской флоуметрии (один участок обозначался как контрольный). Все участки ран были расположены в средней трети по передне-латеральной поверхности плеча на контрлатеральных конечностях с целью унифицирования исследования.
Первое исследование было выполнено после выполнения тангенциальной некрэктомии на 7 сутки после ожога. На исследуемый участок выполнялась трансплантация культуры фетальных аллофибробластов после проведения гемостаза в ране. Для лечения контрольного участка ожоговой раны использовали водорастворимые мази и сетчатые гидрофобные покрытия или пленочные покрытия для предотвращения высыхания раневой поверхности после некрэктомии и для того чтобы создать влажную раневую среду, подобную исследуемому участку, где использовалась культура ал-логенных фибробластов.
Второй раз через 7 суток (14 сутки после травмы) повторно выполняли биопсию из ожоговых ран во время выполнении дальнейших оперативных вмешательств у данных пациентов. Одновременно повторно выполнялась трансплантация культивированных алло-фибробластов на раневую поверхность исследуемого участка.
Третий раз исследование ожоговых ран выполняли через 7 суток, то есть на 14 сутки от начала лечения с помощью клеточных технологий (21 сутки после травмы). Дата выполнения биопсии совпадала с выполнением оперативного вмешательства на других частях тела, связанных с удалением погибших тканей и восстановлением целостности кожного покрова. Для временного закрытия ран на других частях тела также использовалась куль-
тура фетальных аллофибробластов. Среднее количество трансплантаций у обожженных составило 2,71+0,67 на одного больного.
Все биопсии были проведены после подписания информированного согласия пациентов. Морфологический материал брали во время оперативного вмешательства под общей анестезией. Площадь иссекаемых участков была незначительной и не влияла на состояние больного. После завершения исследования на эти участки выполнялась свободная ауто-дермотрансплантация во время проведения последующих оперативных вмешательств, направленных на ликвидацию ожоговых ран.
Для морфологического исследования иссекали во время некрэктомии участки раневой поверхности, размером 0,5 на 0,5 см. Препараты фиксировали в 10% растворе формалина с рН 7,6, затем образцы доставляли в лабораторию фундаментальных исследований Института неотложной и восстановительной хирургии им. В. К. Гусака, где биоптаты кожи заливали парафином по стандартной методике. В биоптате были представлены все слои раны. Из парафиновых блоков изготовляли серийные гистологические срезы толщиной 5+1 мкм, которые окрашивали гематоксилин эозином. Изучение препаратов проводили в проходящем свете на исследовательском микроскопе Olympus AX 70 Provis (Япония) с цифровой видеокамерой Olympus DP 50, соединенной с персональным компьютером. Микрофотографирование препаратов было выполнено с использованием лицензионной программы анализа изображения AnalySIS Pro 3.2 (Soft Imaging) (Германия). С помощью данной программы определяли морфометри-чески площадь формирующегося эпителиального пласта на контрольном и исследуемом участке. Сравнивалась площадь участков с новообразованным эпителием в мм2 на 7 и 14 сутки после применения культуры аллофибро-бластов. Для этого рассчитывали групповые показатели суммарной статистики — среднюю арифметическую величину и ошибку средней. Так как выборки были малыми — 14 пострадавших, для выявления различий между средними значениями площади новообразованного эпителия на контрольном и исследуемом участке, использовали U-критерий Манна-Уитни для независимых переменных. Различия признавались значимыми при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Морфологическое исследование биоптатов, взятых из исследуемого и контрольного участка во время первой некрэтомии 7 сутки после травмы, подтвердило, что биоптаты из между собой морфологически не отличаются. Во всех образцах присутствовала жировая клетчатка, разделенная дозревающей гранулирующей тканью, диффузная умеренная лимфогистиоплаз-моцитарная инфильтрация, распространенные очаги некроза на различных участках дермы, пропитанные фибрином с нейтрофильной инфильтрацией, фибриноидный некроз стенок сосудов, заполненных тромботическими массами.
При исследовании биоптатов из ожоговых ран, взятых через 7 суток после трансплантации культуры аллофибробластов на исследуемый участок (14 суток после травмы), в биопсийном материале обнаружены отличия. На исследуемом участке, появилась грануляционная ткань, покрытая небольшими островками тонкого эпидермиса, одновременно присутствовали небольшие очаги гнойного воспаления, как это изображено на рис. 1. На контрольных участках, где местное лечение проводилось с использованием водорастворимых мазей и гидрофобных сетчатых покрытий, морфологическая картина характеризовалась покрытой язвами (морфологический термин, для обозначения кратерообразного дефекта) дермой с гнойным воспалением, наиболее выраженным вокруг придатков кожи (рис. 2). Причем сохранившиеся придатки кожи в данной ситуации должны были быть источником восстановления эпидермиса в ране.
Рис. 1. Биоптат ожоговой раны. Исследуемый участок,
7 суток после некрэктомии. Грануляционная ткань, покрытая небольшими островками тонкого эпидермиса, небольшие очаги гнойного воспаления Окраска гематоксилином и эозином, ув. 30.
Рис. 2. Биоптат ожоговой раны. Контрольный участок 7 суток после некрэктомии. Дерма с гнойным воспалением, наиболее выраженным вокруг придатков кожи. Окраска гематоксилином и эозином, ув. 75.
Наиболее выраженные отличия в морфологической картине обнаружены при исследовании биоптатов из контрольного и исследуемого участка ожоговых ран на 21-е сутки после травмы (14 суток лечения с использованием культуры аллофибробластов). В препарате, полученном из исследуемого участка ожоговой раны, отмечено обильное разрастание грануляционной ткани разной степени зрелости, много фибробластов, характеризующихся базофильной цитоплазмой, местами сохраняется инфильтрация нейтрофилами, много участков сформированного эпидермиса в виде толстого слоя, изображено на рис. 3.
Рис. 3. Биоптат ожоговой раны. Исследуемый участок ожоговой раны на 21 сутки после травмы (13 сутки лечения с использованием культуры аллофибробластов. Участок сформированного эпидермиса в виде толстого слоя. Обильное разрастание грануляционной ткани. Окраска гематоксилином и эозином, ув. 37,5.
В то же время на контрольных участках ожоговой раны инфильтрация нейтрофилами была более выражена, грануляционная ткань представлена тонким слоем, эпидермис присутствует в виде небольших отдельных островков, визуализирующихся в верхней части рис. 4. Данный факт более медленного формирования пласта эпителия на участках пограничного ожога позволил объективизировать исследование и получить цифровые характеристики отличий течения раневого процесса на исследуемом участке, куда была трансплантирована культура аллофибробластов и на контрольном, где применялись водорастворимые мази согласно фазе воспаления.
Рис. 4. Биоптат ожоговой раны. Контрольный участок ожоговой раны на 21 сутки после травмы (13 сутки после некрэктомии). Выраженная инфильтрация нейтрофилами, грануляционная ткань представлена тонким слоем, эпидермис присутствует в виде небольших отдельных островков. Окраска гематоксилином и эозином, ув. 75.
При морфометрическом исследовании биопсийного материала определена средняя площадь участков с новообразованным эпителием в на исследуемом и контрольном участке ожоговых ран. Получено, что на участках где использовалась культура аллофибробластов средняя площадь пласта новообразованного эпителия составила 6,24±0,26 мм2, в то время как на контрольных участках средняя площадь новообразованного пласта была равна 3,66±0,17 мм2. Различия между цифровыми значениями площади новообразованного эпителия достоверны при p<0,05 (Mann-Whitney U Test). Данные цифры свидетельствуют о том, что на участках ожоговых ран, где применялась культу-
ра аллофиброластов, формирование эпителия происходит в среднем в 1,7 раза быстрее, чем при традиционных методах местного лечения пограничных дермальных ожогов мазевыми повязками.
Выводы
Культура фетальных аллофибробластов значительно ускоряет процессы формирования, созревания и структурирования грануляционной ткани, ускоряет формирование эпителиального пласта. Лечение ожоговой раны с помощью культуры аллофибробла-стов позволяет в 1,7 раза быстрее добиться полноценной эпителизации на участках поверхностного дермального ожога. При наличии участков глубокого ожога трансплантация культуры аллофибробластов позволяет подготовить ожоговую рану к аутодермотрансплан-тации за счет более быстрого перехода от фазы экссудации к полноценной пролиферации в сравнении с рутинными методами лечения ожоговой раны.
Литература
1. Nedelec B. Differential effect of burn injury on fibroblasts from wounds and normal skin/B. Nedelec, А. De Oliveira, M. Saint-Cyr, D. Garrel // Plast Reconstr Surg. -2007. - Vol. 119. - No. 7. - Р. 2101-2109.
2. Böttcher-Haberzeth S. Tissue engineering of skin/S. Böttcher-Haberzeth, T. Bieder-
mann, E. Reichmann // Burns. — 2010. -Vol. 36. — No. 4. — Р. 450-460.
3. Paeura M. Improved skin wound epitheli-alization by topical delivery of soluble factors from fibroblast aggregates/M. Paeura, I. Kaartinen, S. Suomela // Burns — 2012. -V. 38. — No. 4. — Р. 541-550.
4. Matouskova E. Prevention of burn wound conversion by allogeneic keratinocytes cultured on acellular xenodermis/E. Matouskova, L. Broz, E. Pokorna // Cell and Tissue Banking. — 2002. — V. 3. — No. 1. — Р. 29-35.
5. Алексеев А.А. Комплексное лечение глубоких ожогов на основе применения хирургической некрэктомии и современных биотехнологических методов и современных биотехнологических методов // А. А. Алексеев, К. З. Сала-хиддинов, Б. К. Гаврилюк, Ю. И. Тюрни-ков/Анналы хирургии. — 2012. — № 2. — С. 41-45.
6. Wong T.The role of fibroblasts in tissue engineering and regeneration/T. Wong, J. A. McGrath, H. Navsaria // Br. J. Dermatol. — 2007. — Vol. 156. — P. 1149-1155.
7. Расулов М. Ф. Клеточная трансплантация подавляет воспалительную реакцию и стимулирует репаративные процессы в ожоговой ране/М. Ф. Расулов, В. Т. Василенко, В. А. Зайденов // Бюл. экспе-рим. биологии и медицины. — 2006. — № 142. — Т.1. — С. 112-115.
В. В. Солошенко
Тел.: +7 (921) 308-79-85
E-mail: [email protected]
Солошенко В. В. Морфологические особенности раневого процесса в ожоговых ранах при использовании культуры аллофибробластов // Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И. И. Мечникова. — 2016. — Том 8. — № 3. — С.
MORPHOLOGICAL FEATURES OF WOUND PROCESS BURN WOUNDS WHEN
USING ALLOGENIC FIBROBLASTS
V. V. Soloshenko
Saint-Petersburg I. I. Dzhanelidze Research Institute of Emergency Medicine, St. Petersburg, Russia Institute Urgent and Recovery Surgery after V. K. Gusak, Donetsk, Ukraine
The article presents a morphological study of burn wounds in 14 burnt miners. Transplantation allogenic fibroblasts was used for stimulation of reparative processes in the burn wound after excision of necrotic eschar. Affected by explosions of methane-coal mixture were treated in the Donetsk burn center in the period from 2009 to 2012. The total area burned in victims was 59,29±5,26% body surface, including deep — 14,07±4,51%. Burn wounds were characterized by a mosaic lesions observed alternation of areas of superficial and deep dermal burns. In biopsies of burn using mor-phometry determined area sections with the newly formed epithelium at 7 and 14 days after transplantation allogenic fibroblasts. It was found that the areas of burns, where culture is used allogenic fibroblasts, the average area of the formation of the newly formed epithelium was 6,24±0,26 mm2, while in the control plots the average size of the newly formed layer of the epithelium is 3,66±0,17 mm2. The differences between digital values of the newly formed epithelium square significant at p<0,05 (Mann-Whitney U Test). Application allogenic fibroblasts 1,7 times accelerated the formation of the epithelial layer of the skin areas with preserved regenerative potential in comparison with control plots burn wounds where cellular technology is not applied.
Keywords: burn, allogenic fibroblasts, surgical treatment, a morphological study.
Author
V. V. Soloshenko
Phone: +7 (921) 308-79-85
E-mail: [email protected]
Soloshenko V. V. Morphological features of wound process burn wounds when using allogenic fibroblasts // Herald of the Northwestern State Medical University named after I. I. Mechnikov. — 2016. — V. 8. — No. 3. — P.
