CC BY
19
A. В. Смирнов 1'6, А. А. Замлелов 1, И. Н. Тюренков 2,
B. И. Стаценко \3, Л. И. Александрова 4, Р. П. Самусев 4, В. С. Замараев
ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» МЗ РФ,
1 кафедра патологической анатомии,
2 кафедра фармакологии и фармации Института НМФО,
3 кафедра клинической фармакологии и интенсивной терапии,
4 кафедра анатомии человека,
5 кафедра микробиологии;
6 ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр»
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ INOS В ГИППОКАМПЕ И ЗУБЧАТОЙ ИЗВИЛИНЕ КРЫС
ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
УДК 616-091.8
Проведен качественный анализ экспрессии биомаркера iNOS в гиппокампе и зубчатой извилине крыс при моделировании хронической алкогольной интоксикации. В гиппокампе и зубчатой извилине алкоголизированных крыс определялась интенсивная экспрессия iNOS, что свидетельствует о роли N0 в процессах нейротоксичности посредством активации нитроксидергической системы в головном мозге крыс.
Ключевые слова: алкоголь, крыса, гиппокамп, зубчатая извилина, iNOS,
повреждение, алкогольная интоксикация.
A. V. Smirnov, A. A. Zamlelov, I. N. Tyurenkov,
V. I. Statsenko \, L. I. Alexandrova, R. P. Samusev, V. S. Zamaraev
MORPHOLOGICAL FEATURES OF INOS EXPRESSION IN THE HIPPOCAMPUS AND DENTATE GYRUS OF RATS IN MODELING OF CHRONIC ALCOHOL INTOXICATION
A qualitative analysis of the expression of the iNOS biomarker in the hippocampus and dentate gyrus of rats was performed when modeling chronic alcohol intoxication. Intense iNOS expression was detected in the hippocampus and dentate gyrus of alcoholized rats, which indicates the role of NO in neurotoxicity processes through activation of the ni-troxidergic system in the rat brain.
Key words: alcohol, rat, hippocampus, dentate gyrus, iNOS, injury, alcohol intoxication.
В настоящее время остается актуальной проблема распространения хронической алкогольной зависимости среди молодого взрослого населения в Российской Федерации и других странах, что также способствует росту психиатрической коморбидной патологии, в том числе других аддиктивных состояний, соматических заболеваний [2]. Известно, среди органов-мишеней алкоголь индуцированного повреждения особое место занимает головной мозг, что связано с постоянно растущим числом инсультов, внезапной смертью [3]. Патогенез алкогольного поражения головного мозга является сложным и до конца не изученным, связан как с воздействием этанола и продуктов его метаболизма на мозговое кровообращение, так и с поражением нейронов различных отделов ЦНС, реализацией механизмов отека и набухания головного мозга [6]. В механизмах
повреждения головного мозга этанолом и его метаболитами важную роль играет система оксида азота. Имеются данные об алкоголь-индуци-рованной гиперпродукции N0 и ее цитотоксиче-ских форм, что приводит к формированию нитро-зирующего стресса [1, 7].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Охарактеризовать морфологические особенности экспрессии iN0S в гиппокампе и зубчатой извилине крыс при экспериментальном моделировании хронической алкогольной интоксикации.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование производилось на белых лабораторных крысах самцах 6-месячного возраста исходной массой 220-240 г. Содержание животных соответствовало правилам лабора-
торной практики (GLP) и приказу МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики», были учтены требования комиссии Российского национального комитета по биоэтике при Российской академии наук. Хронический алкоголизм моделировался на крысах путем замены питьевой воды 5%-м этиловым спиртом, подслащенным сахарозой (5 г сахара на 100 мл 5%-го раствора этанола) в течение 20 недель. Группа контроля получала воду. Животные подвергались эвтаназии путем дека-питации под наркозом с целью забора головного мозга, фиксировали образцы головного мозга в 10%-м забуференном формалине.
По стандартной методике изготавливали парафиновые блоки и срезы толщиной 5 мкм. Им-муногистохимическое исследование проводили непрямым пероксидазно-антипероксидазным методом с использованием поликлональных антител к iNOS (1:100) согласно протоколу производителя, с использованием полимерной системы (Thermo Scientific, Fremont, CA). В качестве хромогена использовали DAB (диаминобензидин). Оценку изменения уровня экспрессии определяли путём оценки интенсивности реакции в соответствии с 4-балльной адаптированной шкалой Allred (0 - отсутствие реакции, 1 - слабая интенсивность, 2 - умеренная интенсивность, 3 - выраженная интенсивность).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При микроскопическом исследовании гип-покампа и зубчатой извилины интактных и алк-
голизированных животных определялась следующая характеристика: экспрессия iNOS отмечается в гиппокампе и зубчатой извилине и характеризуется неравномерным характером. В зоне СА1 гиппокампа обеих групп животных экспрессия биомаркера имеет слабую степень выраженности (рис. 1, 2).
Достаточная визуализация экспрессии имеется в зонах СА2, СА3, СА4 гиппокампа (рис. 3, 4) и в зубчатой извилине (hilus). В зонах гиппо-кампа СА2 и СА3 интактных и алкоголизирован-ных животных экспрессия в большей степени выраженности в stratum radiatum и в меньшей степени выраженности в pyramidal layer. В pyramidal layer иммунопозитивнный материал определяется в межклеточном пространстве и цитоплазме нейронов. В зоне гиппокампа СА4 интактных и алкоголизированных животных экспрессия биомаркера в пирамидном слое имеет диффузный характер и также наблюдается в цитоплазме нейронов. Интенсивность экспрессии iNOS в гиппокампе: интактная группа СА1 - балл 0; СА2, СА3, СА4 - балл 1 (см. табл.). Интенсивность экспрессии iNOS в гиппокампе: алкоголи-зированная группа СА1 - балл 0, СА2, СА3, СА4 - балл 2. В зубчатой извилине экспрессия визуализируется преимущественно в полиморфном слое (hilus), незначительно экспресси-руется в цитоплазме нейронов слоя гранулярных клеток (GCL) и молекулярного слоя (ML) как у интактных, так у алкоголизированных животных (рис. 5, 6). Интенсивность экспрессии iNOS в баллах: интактная группа - балл 1; алкоголи-зированная группа - балл 2.
Рис. 1. Зона СА1 гиппокампа интактных крыс в возрасте 11 месяцев. Экспрессия iNOS имеет слабую степень выраженности - 0 баллов. Иммуногистохимическое исследование, антитела против iNOS, докраска гематоксилином. Ув. *400
Рис. 2. Зона СА1 гиппокампа алкоголизированных крыс в возрасте 11 месяцев. Экспрессия iNOS имеет слабую степень выраженности - 0 баллов. Иммуногистохимическое исследование, антитела против iNOS, докраска гематоксилином. Ув. ><400
Рис. 3. Зона СА3 гиппокампа интактных крыс в возрасте 11 месяцев. Экспрессия iNOS преимущественно локализуется в stratum radiatum, меньше в pyramidal layer, степень выраженности - 1 балл. Иммуногистохимическое исследование, антитела против iNOS,
докраска гематоксилином. Ув. ><600
Рис. 4. Зона СА3 гиппокампа алкоголизированных крыс в возрасте 11 месяцев. Экспрессия iNOS преимущественно локализуется в stratum radiatum и в меньшей степени в pyramidal layer, степень выраженности - 2 балла. Иммуногистохимическое исследование, антитела против iNOS,
докраска гематоксилином. Ув. ><400
Интенсивность экспрессии биомаркера iNOS в гиппокампе интактных крыс и при моделировании хронической алкогольной интоксикации
Зоны гиппокампа Интенсивность экспрессии iNOS Интенсивность экспрессии iNOS у алкоголизи-
у интактных животных в баллах рованных животных в баллах
СА1 0 0
СА2 1 2
СА3 1 2
СА4 1 2
Рис. 5. Зубчатая извилина интактных крыс возрастом 11 месяцев. Экспрессия iNOS преимущественно локализуется в stratum radiatum и в меньшей степени в pyramidal layer, степень выраженности - 1 балл. Иммуногистохимическое исследование, антитела против iNOS, докраска гематоксилином. Ув. ><400
Рис. 6. Зубчатая извилина алкоголизированных крыс возрастом 11 месяцев. Экспрессия iNOS преимущественно локализуется в stratum radiatum и в меньшей степени в pyramidal layer, степень выраженности - 2 балла. Иммуногистохимическое исследование, антитела против iNOS, докраска гематоксилином. Ув. ><500
Согласно литературным данным экспрессия биомаркера iNOS наблюдается у крыс в нормальном стареющем мозге [4]. Экспрессия биомаркера iNOS определяется в нейронах, нейропиле (преимущественно в клетках микро-глии вблизи синаптических элементов) [5]. В нашем исследовании при хронической алкоголизации наиболее выраженная экспрессия биомаркера iNOS наблюдалась в гиппокампе СА3 и зубчатой извилине (stratum radiatum), в других зонах гиппокампа отмечена более интенсивная экспрессия биомаркера iNOS по сравнению с интактной группой животных, что свидетельствует об увеличении уровня iNOS как в нейронах, так и в глиальных клетках гиппокам-па и зубчатой извилины.
Подобные морфофункциональные изменения могут способствовать увеличению продукции NO и пероксинитритов, а также других свободно радикальных форм, которые принимают участие в реализации NOS-зависимых механизмах нейротоксичности [7].
ЛИТЕРАТУРА_
1. Нитрозирующий стресс и апоптоз нейронов СА1-зоны гиппокампа в условиях моделирования хронической алкогольной интоксикации: нейропротективные эффекты тиоцетама / И. Ф. Беленичев [и др] // Вестник новых меди-
цинских технологий. - 2014. - Т. 21, № 3. -С. 86 - 89. - Текст : непосредственный.
2. Alcohol use disorder relapse factors: A systematic review / W. Sliedrecht [et al.] // Psychiatry Res. -2019. - Vol. 278. - P. 97 - 115. - Direct text.
3. Association of alcohol in brain injury, headaches, and stroke with brain-tissue and serum levels of ionized magnesium: a review of recent findings and mechanisms of action / B. M. Altura [et al.] // Alcohol. - 1999. - Vol. 19 (2). - P. 119 - 130. - Direct text.
4. Brain iNOS: current understanding and clinical implications / J. Licinio [et al.] // Molecular Medicine Today. - 1999. - Vol. 5 (5). - P. 225 - 232. - Direct text.
5. Chronic Isolation Stress Affects Subsequent Crowding Stress-Induced Brain Nitric Oxide Synthase (NOS) Isoforms and Hypothalamic-Pituitary-Adrenal (HPA) Axis Responses / A. Gqdek-Michalska [et al.] // Neurotoxicity Research. - 2019. - Vol. 36. -P. 523 - 539. - Direct text.
6. Effect of alcohol on diffuse axonal injury in rat brainstem: diffusion tensor imaging and aquaporin-4 expression study / L. Kong [et al.] // Biomed Res Int. - 2013. - P. 798261. - Direct text.
7. El-Mas, M. M. Metabolism and Effects: Nitric Oxide and its Interaction / M. M. El-Mas, A. A. Abdel-Rahman // Alcohol. - 2013. - Vol. 47 (4). - Р. 339 - 346. - Direct text.
8. Increased iNOS and Nitrosative Stress in Dopa-minergic Neurons of MDMA-Exposed Rats / S. Schiavone [et al.] // Int. J. Mol. Sci. - 2019. -Vol. 20 (5). - P 1242. - Direct text.
