CC BY
107
№ 2 - 2014 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки
УДК 615.322:615.277.3]-092
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА
ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ И АНТИМЕТАСТАТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ АКОНИТА ДЖУНГАРСКОГО В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
А. П. Надеев, А. ЮАлексеев. С. В. Позднякова. Д. Н. Трошин, Д. М. Первойкин
ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава
России (г. Новосибирск)
Целью исследования было изучение противоопухолевой и антиметастатической эффективности экстракта Аконита джунгарского на примере перевиваемой опухоли Walker 256. У животных 3-й группы с применением циклофосфана и Аконита джунгарского объем первичной опухоли в динамике наблюдения к 28-м суткам уменьшился в 84,6 раз, объемная плотность метастатических очагов в легких на 28-е сутки была меньшей в сравнении с животными 2-й группы (циклофосфан) в 2 раза соответственно. Совместное применение циклофосфана и Аконита джунгарского при карциносаркоме Walker 256 показало выраженный противоопухолевый и антиметастатический эффекты по сравнению с применением только циклофосфана.
Ключевые слова: карциносаркома Walker 256, Аконит джунгарский, противоопухолевая активность, антиметастатический эффект.
Надеев Александр Петрович — доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 225-07-37, e-mail: [email protected]
Алексеев Андрей Юрьевич — клинический интерн кафедры патологической анатомии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», e-mail: [email protected]
Позднякова Светлана Васильевна — доктор биологических наук, профессор кафедры фармакологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 236-09-02
Трошин Дмитрий Николаевич — студент 6-го курса педиатрического факультета ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», e-mail: [email protected]
Первойкин Дмитрий Михайлович — студент 3-го курса лечебного факультета ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», e-mail:
Введение. В 2008 году в РФ впервые были выявлены онкологические заболевания более чем у 500 тыс. человек [3], а летальность от злокачественных новообразований достигла 14,7 % и заняла второе место после сердечно-сосудистых заболеваний [4]. Одним из «лидеров» злокачественных опухолей у женщин является рак молочной железы, рост заболеваемости которого приобрел характер эпидемии, в Российской Федерации темп прироста заболеваемости за последние 10 лет составил 18,5 % [1]. Химиотерапия злокачественных новообразований является самостоятельным и перспективным направлением онкологии, роль которой с каждым годом возрастает. Однако в последнее время отмечается возрастание проблемы химиорезистентности злокачественных опухолей, поэтому поиск новых лекарственных противоопухолевых средств является актуальной задачей современной медицины, в частности, онкологии. Перспективным растением для исследования является представитель рода Асош'Штсемейства Ranunculaceae Аконит джунгарский (А. soongaricum Stapf.).
Перевиваемая опухоль карциносаркома Walker 256 относится к опухолям молочной железы и является смешанной опухолью, так как состоит из саркоматозного и эпителиоидного компонентов, характеризуется инвазивным ростом. Стромальный компонент состоит из саркоматозных клеток (клетки 1-го типа, «темные») разной формы и размеров, с гиперхромными ядрами. Паренхиматозный компонент представлен эпителиоидными клетками (клетки 2-го типа, «светлые»), которые отличаются менее выраженным полиморфизмом, с гипохромными ядрами, митозами. Иммуногистохимический анализ показал, что клетки карциносаркомы Walker 256 несут маркеры стволовых и/или гемопоэтических клеток и имеют моноцитарное происхождение. Разные типы клеток карциносаркомы Walker 256 обладают различной чувствительностью к ряду химиотерапевтических препаратов, в этой связи ее используют в качестве модели эффективности противоопухолевой терапии [10].
В этой связи целью исследования было изучение противоопухолевой и антиметастатической эффективности экстракта А. soongaricum на примере перевиваемой опухоли Walker 256.
Материалы и методы. Исследование проводилось на 46-ти крысах-самцах Wistar, которые были разделены на 3 группы. Животным всех трех экспериментальных групп была перевита опухоль в левую заднюю лапку из расчета 0,8-1,0 х 106 клеток в 0,2 мл физиологического раствора. Животным 1-й группы (контроль) на 8-е сутки развития опухоли внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в объеме 0,2 мл на крысу, далее животные получали внутрижелудочно дистиллированную воду в объеме 0,5 мл на крысу до конца эксперимента. Животным 2-й группы (циклофосфан) на 8-е сутки эксперимента внутрибрюшинно вводили циклофосфан в дозе 60 мг/кг, и в дальнейшем животные получали внутрижелудочно дистиллированную воду в объеме 0,5 мл на крысу до конца эксперимента. Животным 3-й группы (циклофосфан + Аконит) на 8-е сутки внутрибрюшинно был введен циклофосфан в дозе 60 мг/кг. Далее животным вводили внутрижелудочно экстракт Аконита джунгарского, растворенного в 0,1 % крахмальной слизи, в дозе 50 мг (LD25) до 15-х суток эксперимента, далее дозу экстракта уменьшили до 25 мг на крысу. Образовавшийся опухолевый узел у животных 1-й (контрольной) группы забирали на 8-е, 15-е сутки ввиду быстрого роста опухоли, у животных 2-й и 3-й групп образцы опухоли забирали на 21-е и 28-е сутки после трансплантации клеток
опухоли. Исследовали образцы первичного опухолевого узла, легкие, которые фиксировали в 10 % нейтральном формалине, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, заливали в парафин, готовили срезы толщиной 5 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином [6]. В первичном опухолевом узле штангенциркулем измеряли три диаметра, объем опухоли рассчитывался по формуле Шрека для эллипсоидов — a х b х c хп/6 см3, где a, b и c — максимальные диаметры опухолевого узла. В легких подсчитывали с помощью окулярной сетки объемную плотность (Vv) метастатических очагов опухоли Walker 256.
Достоверность различий средних величин при нормальном распределении оценивали с помощью t-критерия Стьюдента и считали статистически значимыми при p < 0,05 [2].
Результаты исследования и их обсуждение. На 8-е сутки после трансплантации объем первичной опухоли Walker 256 у животных исследованных групп не отличался, что свидетельствовало о формировании опухоли. У животных 1-й группы (контрольная группа) опухоль Walker 256 на 15-е сутки после трансплантации формировала солидные пласты и тяжи клеток, которые инвазировали мышечную ткань, росли вдоль кровеносных сосудов (рис. 1), вызывали нарушение кровоснабжения скелетных мышц, приводя к образованию обширных участков некроза с перифокальной инфильтрацией нейтрофилами и макрофагами, отмечали наличие апоптотических телец. У животных этой группы объем первичного опухолевого узла (табл. 1) к 15-м суткам в сравнении с величиной аналогичного показателя на 8-м сутки увеличился в 3,2 раза. У животных 2-й группы (опухоль + циклофосфан) опухолевая ткань была представлена преимущественно «светлыми» клетками, местами обнаруживали многоядерные клетки, небольшие очаги некрозов. Объем первичной опухоли у животных 2-й группы в сравнении с величиной аналогичного показателя у животных 1-й (контрольной) группы на 15-е сутки был меньше в 51 раз, и в динамике наблюдения объем опухоли уменьшился к 28-м суткам в 10 раз. У животных 3-й группы с совместным применением Аконита джунгарского и циклофосфана объем первичной опухоли в сравнении с величиной аналогичного показателя у животных 1-й (контрольной) на 15-е сутки был меньше в 83 раза, и в динамике наблюдения уменьшился в 84,6 раз. Объем первичной опухоли у животных 2-й группы на 28-е сутки после трансплантации опухолевых клеток был больше в 23 раза в сравнении с величиной аналогичного показателя у животных 3-й группы.
Рис. 1. Карциносаркома Walker 256. Саркоматозный компонент, представленный «светлыми» клетками. Окраска гематоксилином и эозином. Увел. 200
Таблица 1
Объем (см3) первичной опухоли Walker 256при использовании Аконита
джунгарского (M ± m)
Группы исследования Периоды наблюдения
8-е сутки 15-е сутки 21-е сутки 28-е сутки
1-я (контрольная) группа 6,04 ± 1,46 21,68 ± 5,05 — —
2-я группа (опухоль + циклофосфан) 4,27 ± 0,88* — 0,42 ± 0,41* 0,93 ± 1,28*
3-я группа (опухоль + циклофосфан + Аконит джунгарский) 3,39 ± 0,93* — 0,26 ± 0,21* 0,04 ± 0,04*а
Примечание: * — статистически значимые различия средних величин в сравнении с величиной аналогичного показателя у животных 1-й контрольной группы; а — с животными 2-й группы (р < 0,05)
'f :
ч •/
Гш
V tf
Дн
'A
Л
a
sr
'О
J
* ■
ЛП. • 1
tr
■
+*- i 4».'
г
Ж» 2
й
J ' . vr JUP^ty
лгЭ' t it
- *
я
, v
•4
if
v\7 л ■
t, '.-■ч-1
J
3UL
■ as tT М/ ^ ■
t'i
k 3
S
t tfors*^ : * /
*
Wf
Рис. 2. Метастаз карциносаркомы Walker 256 в легкие. Окраска гематоксилином
и эозином. Увел. 100
Известно, что опухоль Walker 256 способна к метастазированию в лимфатические узлы и легкие, в основе которого лежит способность опухолевых клеток проникать через базальную мембрану сосудов, вызывая ее разрыхление и разрыв [8, 9]. У животных исследованных групп в легких формировались метастатические очаги, растущие, как правило, периваскулярно (рис. 2). Объемная плотность (Vv) метастатических очагов у животных 2-й (опухоль + циклофосфан) группы на 21-е и 28-е сутки была меньше в сравнении с величиной аналогичного показателя у животных 1-й (контрольной) группы на 15-е сутки в 3,9 и 5 раз соответственно (табл. 2). При применении Аконита джунгарского совместно с циклофосфаном объемная плотность метастатических очагов в легких на 21-е и 28-е сутки была меньше в сравнении с величиной аналогичного показателя у животных 1-й (контрольной группы) в 8,8 и 11 раз соответственно; а в сравнении с животными 2-й группы — в 2,2 и 2 раза соответственно.
Таблица 2
Объемная плотность (Vv) метастатических очагов опухоли Walker 256 в легких при использовании Аконита джунгарского (M ± m)
Группы исследования Периоды наблюдения
15-е сутки 21-е сутки 28-е сутки
1-я (контрольная) группа 20,69 ± 0,63 — —
2-я группа (опухоль + циклофосфан) — 5,27 ± 0,67* 4,12 ± 0,76*
3-я группа (опухоль + циклофосфан + Аконит джунгарский) — 2,35 ± 0,5*а 1,88 ± 0,65*а
Примечание: * — статистически значимые различия средних величин в сравнении с величиной аналогичного показателя у животных 1-й контрольной группы; а —
с животными 2-й группы (p < 0,05)
Известно, что эффекты химиотерапевтических препаратов, в частности циклофосфана, обусловлены цитотоксическим действием их на клетку в состоянии митоза. Одним из проявлений цитостатическиого эффекта препаратов является активация перекисного окисления липидов [7]. Так, показано, что у крыс с карциносаркомой Walker 256 при применении циклофосфана проксидантная активность и содержание продуктов перекисного окисления липидов возрастали в сравнении с контрольными животными [5]. Под влиянием цитостатических препаратов обнаруживают нарушения в липидном составе мембран клеток, повреждения структур ДНК, нарушение целостности мембран лизосом и выход лизосомальных ферментов, стимуляцию апоптоза опухолевых клеток. При этом в зоне альтерации оказываются не только опухолевые клетки, но и нормальные клетки. Выявленные в ходе исследования противоопухолевый и антиметастатический эффекты Аконита джунгарского связаны, вероятно, с содержащимися в его составе алкалоидами. Эти эффекты действия аконита на организм обусловлены комплексным влиянием суммы всех алкалоидов, основную роль среди которых играет группа аконитиновых алкалоидов (аконитин, зонгорин, мезаконитин и др.). Можно предположить, что в основе противоопухолевого эффекта Аконита джунгарского при совместном действии с циклофосфаном лежит окислительный стресс, также нельзя исключить и усиление противоопухолевого иммунитета.
Заключение. Таким образом, совместное применение циклофосфана и Аконита джунгарского при карциносаркоме Walker 256 показало выраженный противоопухолевый и антиметастатический эффекты по сравнению с применением только циклофосфана.
Список литературы
1. Анализ и пути совершенствования онкологической службы Краснодарского края (1999-2008) / В. А. Порханов, [и др.]. - Краснодар, 2009. - 252 с.
2. Гланц С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. — М. : Практика, 1998. — 459 с.
3. Давыдов М. И. Заболеваемость злокачественными новообразованиями населения России и стран СНГ в 2008 году / М. И. Давыдов, Е. М. Аксель // Вестн. РОНЦ. — 2011.
— Т. 22, № 3 (прил.). — С. 54-92.
4. Давыдов М. И. Смертность населения России и стран СЕНГ от злокачественных новообразований в 2008 году / М. И. Давыдов, Е. М. Аксель // Вестн. РОНЦ. — 2011.
— Т. 22, № 3 (прил.). — С. 93-123.
5. Ефремов А. В. Кациносаркома Walker 256. Влияние общей гипертермии
и противоопухолевых агентов / А. В. Ефремов, Е. Л. Лушникова, Е. В. Овсянко.
— Новосибирск : Сибмедиздат, 2012. — 272 с.
6. Саркисов Д. С. Микроскопическая техника / Д. С. Сракисов, Ю. Л. Перов. — М. : Медицина, 1996. — 356 с.
7. Эритроциты и злокачественные новообразования / В. В. Новицкий [и др.]. — Томск, 2000. — 288 с.
8. Increased growth rate and tumor burden of spontaneously metastatic Walker 256 cancer cells in the skeleton of bisphosphonate-treated rats / P. J. Kostinuik, F. W. Orr, K. Suyaama, G. Singh // Cancer Res. — 1993. — Vol. 53, N 22. — P. 5452-5457.
9. Dopaminergic and somatostatinergicpathways decrese serum thyrotropin in rats bearing the 256 Walker mammary carcinoma / О. Monte, S. Zyngier, E.T. Kimura [et al.] // Arq. Brasil. Endocrinol. Metabol. — 2005. — Vol. 49, N 2. — P. 253-264.
10. A Morphological and Phenotypic Analysis of Walker 256 Cells [Текст] / H. Simpinks, J. M. Lehman, J. E. Mazurkiwicz, H. D. Bruce // Cancer. Res. — 1991. — Vol. 51. — P.
1334-1338.
MORPHOLOGICAL ASSESSMENT
OF ANTINEOPLASTIC AND ANTI-METASTATIC EFFICIENCY JUNGGAR AKONIT IN EXPERIMENT
A. P. Nadeev, A. Y. Alekseev, S. V. Pozdnyakova, D. N. Troshin, D. M. Pervoykin
SBEIHPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health» (Novosibirsk c.)
Studying of antineoplasatic and anti-metastatic efficiency of extract of Junggar Akonit on the example of intertwined tumor of Walker 256 was a research objective. The volume of primary tumor in dynamics of supervision by 28th days decreased by 84,6 times at animals of the 3rd group with application of cyclophosphan and Junggar Akonit, the volume density of the metastatic centers in lungs on the 28th days was smaller in comparison with animals of the 2nd group (cyclophosphan) twice respectively. Joint application of cyclophosphan and and Junggar Akonit at Walker 256 carcinosarcoma showed the expressed antineoplastic and anti-metastatic effects in comparison with application cyclophosphan only.
Keywords: Walker 256 carcinosarcoma, Junggar Akonit, antineoplastic activity, anti-metastatic effect.
About authors:
Nadeev Alexander Petrovich — doctor of medical science, professor of pathological anatomy chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 225-07-37, e-mail: [email protected]
Alekseev Andrey Yuryevich — clinical intern of medical faculty at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», e-mail: [email protected]
Pozdnyakova Svetlana Vasilyevna — doctor of biological science, professor of pharmacology chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 236-09-02
Troshin Dmitry Nikolaevich — student of the 6th course of pediatric faculty at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», e-mail: [email protected]
Pervoykin Dmitry Mikhaylovich — student of the 3rd course of medical faculty at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», e-mail: [email protected]
List of the Literature:
1. Analysis and ways of improvement of oncological service of Krasnodar Krai (1999-2008) / V. A. Porkhanov, [etc.]. — Krasnodar, 2009. — 252 P.
2. Glants S. Medico-biological statistics / S. Glants. — M.: Practice, 1998. — 459 P.
3. Davydov M. I. Case rate of malignant new growths of the population of Russia and CIS countries in 2008 I. Davydov, E. M. Axel // Bulletin of ROSC. — 2011. — V. 22, № 3 (enc.). — P. 54-92.
4. Davydov M. I. Mortality rate of the population of Russia and CIS countries from malignant new growths in 2008 I. Davydov, E. M. Axel // Bulletin of ROSC. - 2011. - V. 22,
№ 3 (enc.). - P. 93-123.
5. Efremov A. V. Walker 256 carcinosarcoma. Influence of the general hyperthermia and antineoplastic agents / A. V. Efremov, E. L. Lushnikova, E. V. Ovsyanko. — Novosibirsk: Sibmedizdat, 2012. — 272 P.
6. Sarkisov D. S. Microscopic equipment / S. Srakisov, Y. L. Perov. — M.: Medicine, 1996. — 356 P.
7. Erythrocytes and malignant new growths / V. V. Novitsky [etc.]. — Tomsk, 2000. — 288 P.
8. Increased growth rate and tumor burden of spontaneously metastatic Walker 256 cancer cells in the skeleton of bisphosphonate-treated rats / P. J. Kostinuik, F. W. Orr, K. Suyaama, G. Singh // Cancer Res. — 1993. — Vol. 53, N 22. — P. 5452-5457.
9. Dopaminergic and somatostatinergicpathways decrese serum thyrotropin in rats bearing the 256 Walker mammary carcinoma / О. Monte, S. Zyngier, E.T. Kimura [et al.] // Arq. Brasil. Endocrinol. Metabol. — 2005. — Vol. 49, N 2. — P. 253-264.
10. A Morphological and Phenotypic Analysis of Walker 256 Cells [Текст] / H. Simpinks, J. M. Lehman, J. E. Mazurkiwicz, H. D. Bruce // Cancer. Res. — 1991. — Vol. 51. — P. 1334-1338.
