CC BY
38
© М. Г. Матвієнко, А. С. Пустовалов, Н. О. Бузинська, М. Е. Дзержинський УДК 591. 47:612. 6
М. Г. Матвієнко, А. С. Пустовалов, Н. О. Бузинська, М. Е. Дзержинський
МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ ЗМІНИ В ТЕСТИКУЛАХ ЩУРІВ 24-МІСЯЧНОГО ВІКУ ПІД ВПЛИВОМ КІССПЕПТИНА НА ФОНІ БЛОКАДИ ТА АКТИВАЦІЇ АЛЬФА-АДРЕНОРЕЦЕПТОРІВ I ПРИ ВВЕДЕННІ МЕЛАТОНІНА
Київський національний університет імені Тараса Шевченка (м. Київ)
Дана робота є фрагментом наукової теми № 11 БФ№ 036-01, № держ. реєстрації 011111004648.
Вступ. Дослідження ефектів кісспептина та його антагоніста у віковому аспекті представляється новітнім, оскільки дія цих пептидів вивчена лише на молодому організмі. Інтерес до кісспептина пов’язаний, у першу чергу, з його здатністю до відновлення статевої функції в осіб репродуктивного віку. Описані результати лікування жінок з аменореєю (відсутністю овуляцій), які не були здатні до запліднення через низький рівень статевих гормонів. Причиною цьому є порушення взаємодії кісспептина з його рецепторами призводять до неможливості овуляції [11]. Введення кісспептина пацієнткам призвело до 48-кратного зростання рівня ЛГ і 16-кратного зростання рівня ФСГ. Після чого жінки відновили здатність до запліднення. В подібних ситуаціях використовують пряму гормональну стимуляцію яєчників, яка може викликати різні побічні ефекти [5]. Натомість кісспептин дозволяє м’яко активувати репродуктивну систему, даючи можливість нормально працювати регулюючим і захисним механізмам організму [6, 12]. Цей гормон впливає на нейроендокринні центри як у жіночому, так і в чоловічому організмі Кісспептин стимулює гіпоталамо-гіпофі-зарно-гонадну вісь, змінюючи активність статевих залоз, через активацію вивільнення відповідних гормонів, зокрема, гіпоталамічного гонадоліберину. Го-надоліберин, у свою чергу, активує вивільнення ФСГ і ЛГ. ФСГ активує сперматогенез, впливаючи на клітинами Сертолі. ЛГ здійснює вплив на клітини Лей-діга, які виробляють тестостерон. Отже, головним чином від цих двох гормонів залежить нормальне протікання сперматогенезу. На репродуктивну функцію в значній мірі впливає альфа-адренергічна система головного мозку, яка представлена нора-дренергічними нейронами головним чином в області блакитної плями, гіпокампа і в більшій частині кори [7, 8]. Описані ефекти введення кісспептина та його антагоніста (пептида 234) на щурах одно-місячного та трьохмісячного віку [3]. З недавніх досліджень стало відомо, що в щурів препубертатного віку відбувається активація функції тестикул після введення кісспептина. Натомість, ін’єкції антагоніста кісспептинових рецепторів спричинили інактивацію гонад [1]. Подібні результати були отримані й на трьохмісячних щурах [4]. А особливості взаємодії
альфа-адренергічної та кісспептинергічної систем у старому організмі залишається відкритим.
Метою роботи було дослідження змін діаметру тестикулярних канальців та площі поперечного перерізу ядер клітин Лейдіга, які є показниками функціональної активності репродуктивної системи, в самців щурів 24х-місячного віку під впливом кісспептина за умов активації та блокади альфа-адре-норецепторів і при введенні мелатоніна.
Об’єкт і методи дослідження. Експеримент проведений на 50 самцях щурів білих нелінійних Rattus norvegicus 24х-місячного віку. Досліджувався вплив інтрацеребрального введення кісспептина (метастин -(45-54)-амід, Sigma, США) на гонади, а також цього пептиду в комбінації з гормоном епіфізу мелатоніном (віта-мелатонін, ВАТ «Київський вітамінний завод», Україна) і альфа-адреноблокатором празозином (празозин-ратіофарм, Меркле Гмбх, Німеччина). Також досліджувався вплив інтрацеребрального введення блокатора кісспептинових рецепторів (кісспептин-234-трифлюороацетат, Sigma, США), а також його комбінованого введення в комплексі з мелатоніном та альфа-адреноміметиком ме-затоном (ТОВ «Дослідний завод «ГНЦЛС», Україна»).
Кісспептин вводився протягом трьох діб до взяття матеріалу інтрацеребрально у лівий шлуночок мозку на стереотаксичному приладі за допомогою спеціально переобладнаного шприця у дозі 3мкг/100г ваги тіла один раз на добу. Блокатор кісспептинових рецепторів вводився протягом трьох діб до взяття матеріалу інтрацеребрально у лівий шлуночок мозку на стереотаксичному приладі за допомогою спеціально переобладнаного шприця у дозі 3мкг/100г ваги тіла один раз на добу. Мелатонін давався перорально протягом 10 діб до взяття матеріалу у дозі 100мкг/100г ваги тіла один раз на добу. Празозин тварини отримували перорально протягом 10 діб до взяття матеріалу у дозі 100мкг/100г ваги тіла один раз на добу. Мезатон вводився парентерально протягом 10 діб до взяття матеріалу у дозі 100мкг/100г ваги тіла один раз на добу.
Експериментальний матеріал оброблявся за стандартною гістологічною методикою. На мікротомі виготовлялися препарати гонад товщиною 5 мкм, які фарбували гематоксиліном та еозином. На гістологічних препаратах за допомогою мікроскопа Olympus BX51 і системи аналізу зображень Olympus DP-Soft 3. 2 вимірювали площу поперечного
перерізу ядер клітин Лейдіга при збільшенні Х400 та діаметр тестикулярних канальців при збільшенні Х100. Отримані виміри аналізувалися за допомогою методів варіаційної статистики. Вірогідність різниці між морфометричними показниками контрольних та піддослідних груп щурів оцінювали за t-критерієм Стьюдента. Достовірною вважали різницю між контрольними та піддослідними серіями при р<0,05. Статистична обробка даних здійснювалася за допомогою програмного забезпечення SEWSS STATIS-TICA 7. 0. for Windows.
Результати досліджень та їх обговорення. У старих щурів контрольної групи (ФР) площа перерізу ядер клітин Лейдіга складає 12,16±0,22 мкм2. Після введення блокатора рецепторів кісспептина в тварин (ФР+Бл) спостерігалося достовірне зменшення даного морфометричного показника до 10,72±0,22 мкм2, порівняно з контрольною групою. Діаметр тестикулярних канальців також достовірно менший у групі тварин ФР+Бл (176,92±1,71 мкм), на відміну від показників контрольної групи щурів (215,15±1,55 мкм) (табл.). Дія антагоніста рецепторів кісспептина проявляється в зменшенні досліджуваних параметрів тестикул, отже це демонструє зниження репродуктивної функції щурів. Подібні результати були отримані й на молодих щурах [2]. Тестикули щурів після введення кісспептина (ФР+Кіс) не показали достовірних змін за площею перерізу ядер клітин Лейдіга (12,4±0,23 мкм2), порівняно з контрольною групою (12,16±0,22 мкм2). Діаметр тестикулярних канальців також достовірно не змінився в групі ФР+Кіс (214,10±2,00 мкм), при порівнянні з контрольними показниками (215,15±1,55 мкм). У старих щурів введення кісспептина не вплинуло на зміну морфометричних параметрів гонад, тому не можна констатувати будь-яку зміну репродуктивної функції в даній групі тварин.
Після введення мелатоніна (Мел) у щурів достовірно зменшилася площа перерізу ядер клітин Лейдіга (9,28±0,17 мкм2), порівняно з контрольною групою (12,16±0,22 мкм2). Діаметр тестикулярних канальців у групі Мел також зазнав достовірного зменшення (187,12±1,36 мкм), на відміну від показників контрольної групи (215,15±1,55 мкм) (табл.). В результаті введення мелатоніна обидва морфоме-тричних параметри гонад зазнали достовірних змін у бік зменшення, порівняно з контролем. Це свідчить про зниження функціональної активності тестикул досліджуваних тварин., що не суперечить результатам інших дослідників [9]. У групі щурів, яким вводили мелатонін у поєднанні з антагоністом рецепторів кісспептина (Мел+Бл) достовірно змінився лише один параметр: площа перерізу ядер клітин Лейдіга зросла (10,72±0,18 мкм2), порівняно з групою щурів, які отримували тільки мелатонін (9,28±0,17 мкм2). Діаметр тестикулярних канальців у групі Мел+Бл чисельно зріс (188,81±1,11 мкм), у порівнянні з групою 188,81±1,11Мел (187,12±1,36 мкм), але ці зміни статистично недостовірні. Ін’єкції блокатора рецепторів кісспептина на фоні мелатоніна відзначилися в збільшенні одного досліджуваного параметра
- площі перерізу ядер клітин Лейдіга, але не діаметру тестикулярних канальців. Тому це свідчить про деяке зростання репродуктивної функції даної групи тварин. В експерименті на одномісячних тваринах спостерігалося зниження обох морфометричних показників активності гонад [1]. Мелатонін у комплексі з кісспептином (Мел+Кіс) спричинив зростання обох досліджуваних морфометричних параметрів гонад. Площа перерізу ядер клітин Лейдіга достовірно зросла у тварин групи Мел+Кіс (11,85±0,19 мкм2), в порівнянні з тваринами, які вживали лише мелатонін (9,28±0,17 мкм2). Діаметр тестикулярних канальців також достовірно збільшився в групі тварин Мел+Кіс (200,26±1,33 мкм), на відміну від групи Мел (187,12± 1,36 мкм). Зростання площі перерізу ядер клітин Лейдіга та діаметру тестикуляриних ка-нальців у гонадах щурів при введенні кісспептина разом з мелатоніном може бути інтерпретоване як активація функціональної активності гонад. Пептид 234 в інших дослідженнях також сприяв зниженню секреторної активності гонад [10].
Під дією мезатона (Мез) досліджувані показники гонад достовірно збільшилися. Площа перерізу ядер клітин Лейдіга щурів групи Мез становить 18,05±0,27 мкм2, порівняно з контрольною групою (12,16±0,22 мкм2). Діаметр тестикулярних канальців також достовірно зріс у тварин після введення ме-затона (272,13±2,58 мкм), на відміну від показників контрольної групи (215,15± 1,55 мкм) (табл.). Відповідно мезатон чинить активуючу дію на гонади старих щурів. В експерименті на 3х-місячних щурах спостерігалися такі ж ефекти впливу мезатона [4]. Мезатон у поєднанні з блокатором (Мез+Бл) рецепторів кісспептина спричинив зміни в активності гонад щурів. Площа перерізу ядер клітин Лейдіга щурів групи Мез+Бл достовірно зменшилася (11,39±0,17 мкм2), на відміну від групи щурів, яким вводили один мезатон (Мез) (18,05±0,27 мкм2). Діаметр тестикулярних канальців також достовірно знизився у щурів групи Мез+Бл (214,68±1,65 мкм), порівняно з групою Мез (272,13±2,58 мкм) (табл.). Дані результати показують, що блокатор рецепторів кісспептина здатен нівелювати активуючий вплив мезатона на функціональну активність гонад, знижуючи досліджувані показники майже до контрольного рівня. Це збігається з результатами досліджень на одномісячних щурах [2].
Тестикули щурів, які отримували празозин (Пр), не проявили жодних достовірних змін за досліджуваними параметрами. Так, площа перерізу ядер клітин Лейдіга тварин групи Пр становить 12,58±0,19 мкм2, що незначно відрізняється від контрольних показників (12,16±0,22 мкм2). Діаметр тестикулярних канальців у групі Пр 216,09±1,96 мкм також достовірно не відрізняється від показників контрольної групи (215,15±1,55 мкм) (табл.). Введення празозина не здійснило жодного впливу на показники функціональної активності гонад старих щурів. Це значно відрізняються від результатів, отриманих на одномісячних щурах [3]. Празозин у поєднанні з кісспептином (Пр+Кіс) також не спричинив суттєвих
змін активності гонад. Площа перерізу ядер клітин Лейдіга тварин групи Пр+Кіс 12,75±0,22 мкм2 достовірно не відрізняється від показників групи Пр (12,58±0,19 мкм2). При фіксації діаметра тестикулярних канальців у групі Пр+Кіс 215,71 ±2, 10 мкм також не спостережено достовірних змін, порівняно з групою Пр (216,09±1,96) (табл.). Комбіноване введення празозина з кісспептином не дозволило зафіксувати змін у досліджуваних параметрах тес-тикул, які б характеризували стан репродуктивної активності щурів.
Таблиця
Площа поперечного перерізу ядер клітин Лейдіга та діаметр тестикулярних канальців
Параметр Група Площа перерізу ядер клітин Лейдіга, мкм2, M±m Діаметр тестикулярних канальців, мкм, M+m
Фізіологічний розчин 12,16+0,22 215,15+1,55
Фізіологічний розчин+блокатор 10,72+0,22* 176,92+1,71*
Фізіологічний розчин+кісспептин 12,4+0,23 214,10+2,00
Мелатонін 9,28+0,17* 187,12+1,36*
Mелатонін+блокатор 10,72+0,18л 188,81+1,11
Mелатонін+кісспептин 11,85+0,19# 200,26 + 1,33#
Mезатон 18,05+0,27* 272,13+2,58*
Mезатон+блокатор 11,39+0,17л 214,68+1,65л
Празозин 12,58+0,19 216,09 + 1,96
Празозин+кісспептин 12,75+0,22 215,71+2,10
Примітка: - р<0,05, порівняно з групою ФР; з відповідною групою без кісспептина; л -відповідною групою без блокатора.
# - р<0,05, порівняно р<0,05, порівняно з
Висновки. Таким чином, у 24-місячних тварин альфа-адренергічна система знаходиться в неактивному стані, але може бути активованою введенням мезатона. Натомість, кісспептинергічна система в цьому віці знаходиться в стані високої активності. Тому, введення додаткових порцій кісспептина не призводить до помітного ефекту, а блокада рецепторів кісспептина викликає зменшення активності тестикул. Мелатонін суттєво пригнічує статеву функцію, і вона не може бути відновленою введенням кіс-спептина чи його блокатора. Але ефект мелатоніна частково скасовується при введенні як кісспептина, так і його блокатора. Можливим поясненням цього може бути зменшення вивільнення кісспептина під впливом мелатоніна. Тоді як додаткове введення екзогенного пептиду частково повертає досліджувані параметри до контрольних значень. Часткове скасування дії мелатоніна під впливом блокатора кіс-спептина може бути пояснене у випадку, якщо синтез ендогенного мелатоніна в щурів у віці 24 місяці знаходиться в частковій залежності від пептиду. Тоді в результаті блокади кісспептинових рецепторів має суттєво знизитись рівень ендогенного мелатоніна, і гонадогальмівний ефект буде наслідком лише екзогенно введеної порції мелатоніна.
Перспективи подальших досліджень. Дана робота може мати своє продовження в експериментах на інших видах тварин, а згодом і на людині з використанням відповідних доз препаратів, що дасть можливість розробити методики корекції порушень репродуктивної системи та, можливо, нові засоби оральної контрацепції.
Список літератури:
Матвієнко М. Г. Морфофункціональні зміни в тестикулах щурів препубертатного віку під впливом кісспетина на фоні блокади та активації альфа-адренорецепторів і при введенні мелатоніна / М. Г. Матвієнко, А. С. Пустовалов, Н. О. Бу-зинська, М. Е. Дзержинський // Вісник Луганського національного університету імені Тараса Шевченка. - 2012. - Т. 1, № 17. - С. 101-109.
Матвієнко М. Г. Вплив кісспептина на функціональну активність тестикул нестатевозрілих щурів за умов блокади та активації альфа-адренорецепторів і при введенні мелатоніна / М. Г. Матвієнко, А. С. Пустовалов, М. Е. Дзержинський // Матеріали III Міжнародної науково-практичної конференції, присвяченої 25-річчю біологічного факультету «Сучасні проблеми біології, екології та хімії» - Запоріжжя, 2012. - С. 235-236.
Пустовалов А. С. Зміни функціональної активності тестикул нестатевозрілих щурів при ін’єкціях кісспетина на тлі блокади та активації альфа-адренорецепторів і при введенні мелатоніна / А. С. Пустовалов, М. Г. Матвієнко, Н. О. Бузинсь-ка, М. Е. Дзержинський // Матеріали X Міжрегіональної наукової конференції «Актуальні питання біології та медицини» - Луганськ, 2012. - С. 63-64.
Dzerzhinsky M. Morphofunctional changes in rat testes under kisspeptin influence against blockade and activation of alpha-adrenergic receptors and melatonin administration / M. Dzerzhinsky, A. Pustovalov, M. Matvienko // Reproduction in domestic animals. -2012. - Vol. 47, № 2. - Р 20.
Jiang Y KiSS1 suppresses metastasis in human ovarian cancer via inhibition of protein kinase C alpha / Y Jiang , M. Berk , L. S. Singh [et al.] // Clin. Exp. Metastasis. -2005. - Vol. 5, № 22. - Р. 369-376.
Lapatto R. Kiss1-/- Mice Exhibit More Variable Hypogonadism than Gpr54-/- Mice / R. Lapatto, J. C. Pallais [et al.] // Endocrinology. - 2007. - Vol. 148, № 10. - Р 4927-4936.
Mayerhofer A. Catecholamines stimulate testicular steroidogenesis in vitro in the Siberian hamster, Phodopus sungorus / A. Mayerhofer, A. Bartke, T. Began // Biology of reproduction. - 1993. - Vol. 48, № 4. - Р 883-888.
Moger W. H. Beta-adrenergic agonist induced androgen production during primary culture of mouse Leydig cells / W. H. Mo-ger, P. R. Murphy // Arch. Androl. - 1983. - Vol. 1, № 10. - Р 135-142.
Navarro V. M. Developmental and Hormonally Regulated Messenger Ribonucleic Acid Expression of KiSS-1 and Its Putative Receptor, GPR54, in Rat Hypothalamus and Potent Luteinizing Hormone-Releasing Activity of KiSS-1 Peptide / V. M. Navarro, J. M. Castellano [et al.] // Endocrinology. - 2004. - Vol. 145, № . 10. - Р 4565-4574.
10. Pineda R. Critical roles of kisspeptins in female puberty and preovulatory gonadotropin surges as revealed by a novel antagonist / R. Pineda, D. Garcia-Galiano [et al.] // Endocrinology. - 2010. - Vol. 2, 151. - P. 722-730.
11. Roseweir A. K. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation /
A. K. Roseweir, A. S. Kauffman [et al.] // J. Neurosci. - 2009. - Vol. 12, № 25. - P. 3920-3929.
12. Seminara S. B. The GPR54 gene as a regulator of puberty / S. B. Seminara, S. Messager, E. E. Chatzidaki [et al.] // N. Engl.
J. Med. -2003. - Vol. 23, № 349. - P. 1614 -1627.
УДК 591. 47:612. 6
МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ ЗМІНИ В ТЕСТИКУЛАХ ЩУРІВ 24-МІСЯЧНОГО ВІКУ ПІД ВПЛИВОМ КІССПЕПТИНА НА ФОНІ БЛОКАДИ ТА АКТИВАЦІЇ АЛЬФА-АДРЕНОРЕЦЕПТОРІВ І ПРИ ВВЕДЕННІ МЕЛАТОНІНА
Матвієнко М. Г., Пустовалов А. С., Бузинська Н. О., Дзержинський М. Е.
Резюме. Показано, що в 24-місячних щурів альфа-адренергічна система може бути суттєво активована введенням мезатона, але не кісспептином. Водночас блокада кісспептинергічної системи спричиняє зменшення активності тестикул. Аналогічний ефект спостерігається при введенні мелатоніна. Ін’єкції кісспепти-на, так само як і петида 234 (блокатора рецепторів кісспептина), частково усувають гонадогальмівний ефект мелатоніна.
Ключові слова: кісспептин, альфа-адренорецептори, мезатон, празозин, мелатонін.
УДК 591. 47:612. 6
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ТЕСТИКУЛАХ КРЫС 24-МЕСЯЧНОГО ВОЗРАСТА ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ КИССПЕПТИНА НА ФОНЕ БЛОКАДЫ И АКТИВАЦИИ АЛЬФА-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ И ПРИ ВВЕДЕНИИ МЕЛАТОНИНА
Матвиенко М. Г., Пустовалов А. С., Бузинская Н. А., Дзержинский Н. Э.
Резюме. Показано, что у 24-месячных крыс альфа-адренергическая система может быть существенно активированна введением мезатона, но не кисспептином. В то же время блокада кисспептинергической системы способствует снижению активности тестикул. Аналогичный эффект наблюдается при введении мелатонина. Инъекции кисспептина, так же как и пептида 234 (блокатора рецепторов кисспептина), частично отменяют гонадотормозящий эффект мелатонина.
Ключевые слова: кисспептин, альфа-адренорецепторы, мезатон, празозин, мелатонин.
UDC 591. 47:612. 6
Morphofunctional Changes In 24-Month Rat Testes Under Kisspeptin Influence Against Blockade And Activation Of Alpha-Adrenergic Receptors And Melatonin Administration
Matvienko M. G., Pustovalov A. S., Buzynska N. O., Dzerzhinsky M. E.
Summary. Alpha-adrenergic system of 24-month-old rats was shown to be significantly activating by introduction of mezaton, but not kisspeptin. At the same time the blockade of kisspeptinergic system reduces the activity of the testicles. The similar effect was observed after introduction of melatonin. The injections of kisspeptin, as well as peptide 234 (kisspeptin receptors blocker), partially overturned the gonadal inhibitory effect of melatonin.
Key words: kisspeptin, alpha-adrenergic receptors, mezaton, prazosin, melatonin.
Стаття надійшла 28.08.2012 р.
Рецензент - проф. Дубінін С. I.
