Морфофункциональная реакция т-лимфобластов линии Jurkat на покрытие из оксидов титана Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

морфофункциональная реакция т-лимфобластов

линии JURKAT на покрытие из оксидов титана

И.А. Хлусов 12, Л.С. Литвинова 3, В.В. Шуплецова 3, Н.А. Сохоневич 3, О.Г. Хазиахматова 3, МЮ. Хлусова 1, Ю.П. Шаркеев 4, В.Ф. Пичугин 2

1 Сибирский государственный медицинский университет, Томск, Россия

2 Томский политехнический университет, Томск, Россия

3 Балтийский федеральный университет им. И. Канта, Калининград, Россия

4 Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, Томск, Россия

Morphofunctional reaction of T-lymphoblasts of Jurkat line on the titanium oxides coating

IA. Khlusov12, L.S. Litvinova 3, V.V. Shupletsova 3, NA. Sokhonevich 3, O.G. Khaziakhmatova 3, M.Yu. Khlusova 1, Yu.P. Sharkeev 4, V.F. Pichugin 2

1 Siberian State Medical University, Tomsk, Russia

2 Tomsk Polytechnic University, Tomsk, Russia

31. Kant Baltic Federal University, Kaliningrad, Russia

4 Institute of Strength Physics and Materials Science of SB RAS, Tomsk, Russia

В исследовании in vitro были использованы лейкозные Т-лимфобластоподобные клетки человека (далее Jurkat Т-клетки), активно применяемые для моделирования in vitro реакций Т-лимфоцитов .

Изучена морфофункциональная реакция Jurkat Т-клеток на 24-часовой контакт с титановыми подложками (12x12x1 мм3), несущими двустороннее покрытие из оксидов титана (TiO, TiO2), сформированное микродуговым методом в водном растворе 20% ортофосфорной кислоты . 27—98% иммортализированных клеток в контрольной культуре (без добавления образцов) имели CD3+/CD4+/CD71+/CD45RA+ иммунофенотип и секретировали IL-2, IL-4, IL-8, IL-10 и TNFa, но не IL-1b и IL-6 . Другие маркеры клеточной активации, дифференцировки, созревания и смерти (CD8, CD16, cD56, cD25, cD95) обнаруживались у 0-2,5% клеточной популяции

Добавление объемных образцов с оксидным покрытием статистически значимо снижало на Jurkat Т-клетках презентацию мембранных маркеров CD3,CD4,CD8 и CD95, уменьшало секрецию IL-4 и TNFa . Структурная (уменьшение экспрессии антигенов) и функциональная (снижение секреции цитокинов) инактивация Jurkat Т-клеток не была связана с генерацией внутриклеточных активных форм кислорода (АФК), не опосредовалась TiO2 наночастицами (диаметр 14±8 нм; доза 1 мг/л или 10 мг/л), которые способны высвобождаться при биодеградации образцов Корреляционный анализ по Спирмену показал ингибирующее действие шероховатости оксидной поверхности в интервале Ra = 2,2—3,7 мкм на число жизнеспособных Jurkat Т-клеток (rs = -0,95; n = 9; p<0,0001), преимущественно, за счет увеличения в клеточной популяции доли некротических форм В свою очередь, с увеличением индекса шероховатости Ra линейно возрастала (r = 0,6; p<0,000001, n = 60) амплитуда отрицательного электростатического потенциала оксидной поверхности

Шероховатость оксидного покрытия индуцирует его поверхностный потенциал, который, предположительно, способствует морфофункциональной супрессии опухолевых иммунокомпетентных клеток через электростатические/ биологические механизмы, не связанные с генерацией внутриклеточных АФК .

Ключевые слова: мембранные маркеры, цитокины, активные формы кислорода, апоптоз, некроз, in vitro, титановые подложки, TiO2 наночастицы .

Human leukemic T-lymphoblastoid cells (hereinafter Jurkat T-cells) which was applied actively for modeling of T-lymphocytes reaction have been used in vitro

We have examined morphofunctional response of Jurkat T-cells to 24-h in vitro contact with titanium substrates (12x12x1 mm3) covered by titanium oxide (TiO, TiO2) bilateral coating that was prepared by microarc method from an aqueous solution of 20 mass % orthophosphoric acid . 27— 98% of immortalized cells in control culture (without an addition of the specimens) had CD3+CD4+CD71+CD45RA+ immunophenotype and secreted IL-2, IL-4, IL-8, IL-10 and TNFa, but not IL-1b and IL-6 . Other markers of cell activation, differentiation, maturation and death (cD8, cD16, cD56, CD25, CD95) were found at 0 - 2 . 5% of the cell population .

The addition of bulk specimens with oxide coating reduced statistically CD3, CD4, CD8 u CD95 membrane markers presentation on Jurkat T-cells and decreased IL-4 and TNFa secretion . Structural (antigens expression) and functional (cytokines secretion) Jurkat T-cells inactivation was not connected with the generation of intracellular reactive oxygen species (ROS), and was not mediated by TiO2 nanoparticles (diameter of 14±8 nm; doses of 1 mg/L or 10 mg/L) which can be released under samples biodegradation . Spearman's correlation analysis showed the inhibiting action of the oxide surface roughness in the range of Ra = 2,2—3,7 ^m on the number of viable Jurkat T-cells (rs = -0 . 95; n = 9; p<0 . 0001) due to an elevating portion of necrotic forms in the cellular population, mainly In turn, magnitude of negative electrostatic potential of the oxide surface rose linearly (r = 0 . 6; p<0 . 000001, n = 60) with increase in the Ra roughness index

The roughness of the oxide coating induces its surface voltage that seems to promote morphofunctional suppression of tumor immune cells by electrostatic/biological mechanisms are not connected with intracellular ROS generation

Keywords: membrane markers, cytokines, reactive oxygen species, apoptosis, necrosis, in vitro, titanium substrates, TiO2 nanoparticles

Введение

Оценка иммунотоксичности биоматериалов и медицинских изделий является одним из важнейших шагов в определении их биологической совместимости . Она включает определение структурно-функци-

е-таП: khlusov63@mail . ги

ональных изменений одного или более компонентов иммунной системы, например, маркеров клеточных мембран и цитокинового профиля Т-лимфоцитов [1].

Быстро пролиферирующая Jurkat линия лей-козных Т-лимфобластоподобных клеток человека

(далее Jurkat Т-клетки) часто используется для моделирования in vitro реакций Т-лимфоцитов крови в норме [2], при остром Т-лимфобластном лейкозе и лимфомах [3]. Различные исследователи применяют Jurkat Т-клетки для изучения иммунных и цито-токсических реакций на биоматериалы [4], ионы [5] и наночастицы [6], способные выделяться при биодеградации эндопротезов и запускать IV тип иммунопатологических реакций

Ранее мы установили возможность прямого влияния поверхности тонких кальцийфосфатных покрытий, нанесенных на титан методом высокочастотного магнетронного распыления, на созревание и диф-ференцировку Jurkat Т-клеток in vitro [7]. Титан — биосовместимый металл, широко применяющийся в различных направлениях биомедицины, обладающий биоинертными свойствами [8], обусловленными, преимущественно, формированием поверхностной пленки оксидов титана [9].

В последнее время появляются работы, свидетельствующие о физико-химических характеристиках титановой поверхности, выходящих за рамки концепции биоинертности [10]. В 1964 году A . Curtis и M . Varde предположили важнейшую роль топографии естественных и искусственных матриксов в детерминации клеточного поведения, включая подвижность и морфофункциональные свойства клеток [11]. Однако до сих пор не выяснены физические процессы, лежащие в основе многочисленных данных in vitro и in vivo, подтверждающих их гипотезу .

В связи с этим, целью исследования явилось изучение реакции Т-клеток линии Jurkat на краткосрочный контакт in vitro с модельными подложками, несущими шероховатое покрытие из оксидов титана .

Материал и методы

В эксперименте in vitro применяли образцы размером 12x12x1 мм3, несущие двустороннее покрытие из оксидов титана . Покрытие формировали на подложке из коммерчески доступного чистого титана (99,58 Ti; 0,12 O; 0,18 Fe; 0,07 C; 0,04 N; 0,01 H весовых %) методом микродугового оксидирования в анодном режиме в водном растворе 20% ортофос-форной кислоты [12].

Шероховатость покрытия определяли с помощью профилометра-296 (Россия) согласно ГОСТ 2789-73 по индексу Ra, который рассчитывается как среднее арифметическое 10 измерений отклонений профиля поверхности в пределах базовой длины измерения 1,5 мм . Толщина покрытий, измеренная на 5 образцах-свидетелях до и после нанесения покрытия (ГОСТ 9 . 302-88 ЕСЗКС) с помощью микрометра МК-25 (Россия), составила в среднем 9 мкм .

Исследования морфологии и элементного состава поверхности образцов осуществляли с использованием сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) Quanta 200 ESEM FEG со встроенным EDX-анализатором (EDS analysis system Genesis 4000, S-UTW-Si(Li)detector) . Согласно EDX-спектрам, покрытия состоят из титана (44 ат%) и кислорода (56 ат%) . Рентгенофазовый анализ (РФА) покрытий (рентгеновский дифрактометр Shimadzu XRD-7000, Япония) показал оксиды титана TiO2(anatase) TiO, TiO2(rutil). Преобладающей фазой являлся диоксид титана (TiO2), что было использовано для обозначения поверхности образцов как TiO2 покрытие. Оптическую микроскопию покрытий в отраженном свете

проводили на металлографическом микроскопе Olympus GX-71 с цифровой камерой Olympus DP 70 (Япония).

Для исследования электрических параметров покрытий использовался малогабаритный прибор с цифровым индикатором и автономным питанием от аккумуляторов, разработанный Э . А . Гостищевым в НИИ интроскопии Национального исследовательского Томского политехнического университета . В основу прибора заложен усовершенствованный метод М . Егучи (2011) (метод подъёмного электрода), позволяющий проводить измерения на расстоянии 0,5 мм над поверхностью [13]. Величина потенциала поля на поверхности образцов выражалась как среднее измерений с 5 точек поверхности с площадью 20 мм2 .

Наночастицы диоксида титана

Использовали нанопорошок диоксида титана TiO2, приготовленный в Институте сильноточной электроники СО РАН (г . Томск) методом электрического взрыва проводников Трансмиссионная электронная микроскопия (JEM-200CX, Япония) показала моноцентрическую гистограмму распределения частиц кубической формы, имеющих средний диаметр 14 нм при среднеквадратичном отклонении 8 нм . Нанодисперсии готовили непосредственно перед смешиванием с клетками при помощи ультразвуковой обработки (Elmasonic S10, Германия) взвеси на-ночастиц в изотоническом растворе хлорида натрия в течение 5 мин Добавляли в клеточную взвесь в конечной концентрации 10 предельно допустимых концентраций (ПДК, 1 мг/л) или 100 ПДК (10 мг/л) по титану, перемешивали путем пипетирования

Культура клеток

Для оценки in vitro молекулярных аспектов биосовместимости TiO2 покрытия или TiO2 наночастиц использовали иммортализированную клеточную линию Jurkat 5332 лейкозных Т-лимфобластоподобных клеток человека (Российская коллекция клеточных культур позвоночных Института цитологии РАН, Санкт-Петербург), стандартизированную до 1х10в жизнеспособных мононуклеаров на 1 мл питательной среды Подсчёт концентрации и жизнеспособности клеток до культивирования проводили с помощью автоматического счётчика клеток Countess™ Automated Cell Counter (Invitrogen, США) с использованием 0,4% раствора трипанового синего (Invitrogen, США) Доля жизнеспособных клеток составила 98% .

Клетки линии Jurkat ресуспендировали в полной питательной среде, состоящей из 90% RPMI-1640 (Sigma, США), 10% инактивированной (56°С в течение 30 мин ) сыворотки крови эмбрионов коров (Sigma, США) и 0,3 мг/мл L-глутамина (Sigma, США) . В лунки 24-луночного планшета (Orange Scientific, Бельгия; площадь лунки 1,86 см2) помещали по 1 подложке с TiO2 покрытием или взвесь TiO2 нано-частиц, культивировали в течение 24 ч при температуре 37°С и 5% СО2 Контролем служила клеточная взвесь без объемных или наноразмерных образцов

После инкубации клеточную взвесь центрифугировали при 500 g в течение 15 мин Клеточный осадок использовали для оценки апоптоза, некроза, активных форм кислорода, презентации мембранных

антигенов, а надосадочную жидкость (супернатан-ты) — для определения концентрации цитокинов .

Определение активных форм кислорода

и клеточной смерти

Внутриклеточную концентрацию активных форм кислорода (АФК) и долю погибших клеток (рис . 1) определяли на проточном цитофлуориметре FACSCanto™ II (BD, США) . Продукцию АФК (гейт P2) в клетках оценивали с помощью красителя с заблокированной флуоресценцией — дихлорфлуоресцеина диацетата (Sigma Aldrich, США) .

Процентное соотношение живых и погибших (апоптотических и некротических) клеток и общее количество клеток в пробе определяли методом проточной цитофлуориметрии на приборе Guava EasyCytePlus (Millipore, США) с использованием реагента и программы Guava Via Count (Millipore, США).

Для этого исследуемые клетки в объеме 12,5 мкл переносили в иммунологический планшет, добавляли 112,5 мкл реагента Guava ViaCount (Millipore, США), тщательно ресуспендировали, инкубировали 5 мин в темном месте Анализ образцов проводили на проточном цитофлуориметре Guava EasyCytePlus (Millipore, США) с использованием программы Guava Via Count (Millipore, США) .

Оценка цитокинового профиля культуры

клеток

Для определения концентрации интерлейкинов (IL-1b, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10) и фактора некроза опухоли (TNFa) в супернатантах использовался твердофазный иммуноферментный «сэндвичевый» метод (ИФА) . Процедуру выполнения ИФА осуществляли согласно инструкциям, предлагаемым производителем тест-систем цитокинов («Вектор Бест», Россия) на автоматическом иммуноферментном анализаторе Lasurit (Dynex Technologies, США). Концентрацию цитокинов выражали в пг/мл .

Выявление иммунофенотипа клеток

Регистрацию антигенного профиля клеток проводили методом, основанным на взаимодействии специфических моноклональных антител (МКАТ) с кластерными детерминантами на клеточных мембранах в соответствии с инструкцией производителя МКАТ .

После культивирования клетки отмывали фосфатным буфером (рН = 7,2) и окрашивали в объеме 10 мкл стандартными МКАТ, меченными флуоресце-инизотиоцианатом (FITC), аллофикоцианином (АРС), фикоэритрином (PE) или перидининовым белком хлорофилла (PerCP, peridinin chlorophyll protein) (Abcam, Великобритания; e-Bioscience, США) и фиксирующимися к маркерам клеточной диффе-ренцировки (CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, CD45RO, CD45RA, CD56, CD71, CD95).

После 30 мин . инкубации с МКАТ клетки подвергали анализу на проточном цитофлуориметре MACS Quant (Miltenyi Biotec, Германия). Оценивали параметры оранжевой/зеленой/красной флуоресценции в гейте изучаемых клеток, определяли количество клеток, презентирующих изучаемые антигенные детерминанты . Результаты цитометриче-ского анализа были проанализированы с помощью программы «KALUZA Analysis Software» (Beckman coulter, США)

Статистический анализ

Результаты обрабатывали с применением программы «STATISTICA for Windows 6 . 0» (StatSoft, США). Рассчитывали параметры распределений: медиану (Ме), 25% квартиль (Q1) и 75% квартиль (Q3) . Для оценки статистической значимости различий применяли непараметрический критерий Ман-на-Уитни (U-тест) . Различия считали статистически значимыми при р<0,05 . Связь между исследуемыми показателями устанавливали методами регрессионного и корреляционного (по Спирмену) анализов

10е4

а

г-

10е4

10еЗ-;

10е2-

10е1-

ГТТ7Т-1 I I I 1И1|-1 I ) НИЦ-III! nil

10е0 10е1 10е2 ЮеЗ 10е4 Viability (РМ1)

ЮеО 10е1 10е2 ЮеЗ FSC

10«*

EasyFit Results Manual Results

Count % of Total Count % of Total

Viable 843 83,63% 755 75,50%

Dead 165 16,37% 245 24,50%

Viable Total Viable Total

Cells / mL 1,23e06 1,46e06 1,10e06 1,45e06

Cells in Org Sample O.OOeOO O.OOeOO O.OOeOO O.OOeOO

□ebris Index 1.37% 2,15%

Рис. 1.

Количество жизнеспособных и погибших клеток in vitro. Стандартный протокол оценки клеточной смерти с использованием реагента GuavaViacount

Результаты исследования

Согласно полученным результатам, в двумерной (2D) культуре на пластике Jurkat линия Т-лимфобластоподобных клеток человека экс-прессировала широкий спектр мембранных маркеров (табл . 1). 95 % клеточной культуры являлись CD45RA+ наивными (не активированными антигеном) иммортализированными T-клетками . Основная доля клеток (27—98%) в 24-часовой культуре имела иммунофенотип CD3+/CD4+/CD71+/CD45RA+ . Другие маркеры клеточной дифференцировки, созревания и смерти (CD8, CD16, CD56, CD25, CD95) обнаруживались в интервале 0—2,5 % иммуноком-петентных клеток (табл . 1) .

Изучение цитокинового профиля Jurkat клеток показало секрецию IL-2, IL-4, IL-8, IL-10 и TNFa, но не IL-1b и IL-6 (табл . 2) . При этом определяемые в супернатантах уровни IL-2 в пределах 3,3-8,1 пг/мл (табл 2) не сопровождались экспрессией рецептора (CD25 антигена) к данному цитокину (табл . 1) . По-видимому, IL-2 зависимый путь (сам цитокин и рецептор к нему на мембране клеток) не являлся определяющим механизмом аутокринной активации пролиферации T-клеток и выживаемости опухолевого клона in vitro . Тем не менее, имела место IL-2 независимая активация, обусловленная мембранной экспрессией молекул пролиферации CD71 (рецептора к

трансферрину) и апоптоза С095 (табл . 1). Общее количество кариоцитов (ОКК) через 24 ч . культивирования повышалось несущественно с исходных 1 х10в/ мл до 1,12 (1,1—1,4)х10в/мл при медиане жизнеспособности Т-клеток 82,9 % . Согласно табл . 1, часть неприлипающих Jurkat Т-клеток в 24-часовой культуре погибала путем апоптоза (медиана 5,2%) и некроза (медиана 8,2 %) .

Добавление в клеточную культуру образцов титана с ТЮ2 покрытием изменяло морфофункциональное состояние лейкозных Т-лимфобластоидных клеток человека (табл . 1, 2) . Контакт с чужеродной поверхностью не вызывал увеличение экспрессии низкомолекулярной изоформы С045-молекулы (CD45RO), характерной для стимулированных Т-клеток . Однако проточная цитофлуориметрия показала статистически значимое уменьшение (табл . 1) доли неадге-зировавшихся клеток, экспрессирующих антигены дифференцировки и созревания Т-клеток: CD3 — на 0,5%, CD8 - на 1,85% и CD4 - на 2,1% в сравнении с контролем

Краткосрочный контакт Jurkat клеток с ТЮ2 покрытием не сопровождался изменением секреции ^-2 — основного лимфокина, продуцируемого данной клеточной линией . Тем не менее, выход ^-4, также способного усиливать рост Т-клеток и генерацию цитотоксических Т-лимфоцитов [14], снижался до нулевого значения (табл 2)

Таблица 1. Молекулярные маркеры мембран и показатели клеточной смерти линии иигкак клеток после 24-часового культивирования с образцами, несущими TiO2 покрытие на титановой подложке, Me №1^3)

Число погибших клеток, % Количество клеток, экспрессирующих мембранные маркеры, %

со о т п о со 0 Q. к CD3 CD4 CD8 CD71 CD45RO CD45RA CD16 CD56 CD25 CD95

п < е X

Клеточная культура на пластиковой поверхности культурального планшета (контроль), n = 3-15

5,2 (5,2-8,9) 8,2 (8,1-14,2) 98 (97,9-98,85) 27,5 (26,54-28,43) 2,16 (1,9-3,0) 94,0 (93,5-95,0) 0,55 (0,49-0,60) 94,9 (94,0-95,22) 2,46 (2,34-2,83) 2,5 (2,3-2,97) 0 (0-0,16) 1,0 (0,9-1,2)

Клеточная культура в присутствие образцов с TiO2 покрытием, n = 3-15

5,9 (5,6-6,9) 15,3 (8,2-19,3) 97,5 (97-98)* р<0,03 25,4 (24,76-26,70)* р<0,002 0,31 (0,2-0,43)* р<0,000003 94,0 (93,49-95) 0,50 (0,41-0,50) 94,0 (93,15-94,3) 2,33 (2,17-2,34) 2,36 (2,22-2,80) 0 (0-0,12) 0,56 (0,3-0,6)* р<0,002

Концентрация цитокинов, пг/мл

IL-1b IL-2 IL-4 IL-6 IL-8 IL-10 TNFa

Пластиковая поверхность культурального планшета (контроль), n = 12

0 (0-0,23) 5,67 (5,46-5,98) 1,10 (0,74-1,24) 0 11,12 (9,18-12,59) 6,10 (5,40-6,96) 14,95 (13,97-15,51)

TiO2 покрытие, n = 12

0 (0-0,10) 6,10 (3,30-8,10) 0 (0-0,79)* р<0,007 0 12,78 (11,71-13,22) 7,80 (4,87-9,86) 13,48 (8,0-14,15)* р<0,01

Таблица 2. Концентрация цитокинов в супернатантах иигкак Т-клеток после 24-часового культивирования с модельными имплантатами, несущими TiO2 покрытие на титановой подложке, Me №1^3)

Функциональная инактивация Jurkat Т-клеток после контакта с TiO2 покрытием не сопровождалась усилением процессов апоптоза или некроза в выбранной нами клеточной системе in vitro (табл . 1) . Внутриклеточный уровень АФК, активно участвующих в процессах клеточной активации и смерти, оставался на уровне 0,087 (0,078—0,094) у . е . , который статистически значимо не отличался от контрольного значения (клетки без образцов), составившего 0,099 (0,088-0,112) у . е .

В то же время, установлена обратная корреляция рельефа TiO2 поверхности и числа жизнеспособных Jurkat клеток в 24-часовой культуре (rs = -0,95; n = 9; p<0,0001), преимущественно, за счет увеличения процессов некроза (табл. 3) . Регрессионный анализ показал прямолинейное убывание доли живых Т-клеток в культуре с увеличением индекса шероховатости Ra (рис . 2), характеризующим увеличение рельефа поверхности образцов . При контакте с TiO2 поверхностями, имеющими шероховатость в диапазоне Ra 2,28-3,7 ¿им, жизнеспособность

Jurkat Т-клеток статистически значимо CP,,

:0,05)

и прогрессивно снижалась по сравнению с контролем роста клеток на пластике, составившем 82,9 (80,6-86,7)% .

Снижение выживаемости Jurkat Т-клеток не было связано с компонентами суперсемейства TNF (CD95(Fas/APO-1) и TNF-a). Секреция TNF-a и экспрессия CD95 достоверно уменьшались до 90% (Р.. <0,01) и 56% (Р.. <0,002), соответственно,

по отношению к показателям контрольной культуры клеток, не контактировавших с образцами (табл . 1, 2).

Своеобразная гипергия Jurkat Т-клеток на контакт с ТЮ2 покрытием может быть обусловлена факторами биологического влияния искусственного материала, как прямого, так и опосредованного через продукты (в том числе наночастицы) его деструкции и биодеградации . Тем более что часть Jurkat Т-клеток плотно адгезировала к ТЮ2 поверхности (рис . 3), изменение ее шероховатости оказывало заметное влияние на морфофункциональные показатели культуры лейкозных Т-лимфобластов (табл . 3).

Результаты показали (табл . 4), что в культуре Jurkat Т-клеток нанодисперсия диоксида титана в диапазоне 10-100 ПДК (по титану), также как и само ТЮ2 покрытие, не оказывала заметного влияния на внутриклеточную концентрацию АФК и апоп-тотическую гибель Т-лимфобластов .

С другой стороны, Jurkat Т-клетки реагировали на наноразмерный раздражитель увеличением в межклеточной жидкости концентраций Т^-а (на 22% независимо от дозы нанодисперсии) и, в меньшей степени, ^-2 (на 18% при 100 ПДК) . Следует отметить инверсивное действие ТЮ2 нанодисперсии в сравнении с эффектом объемного изделия (табл . 2, 5). Напротив, супрессирующий (на 11—18% по отношению к контролю) эффект ТЮ2 наночастиц на секрецию ^-4 (табл . 5) во многом соответствовал таковому для ТЮ2 покрытия (табл . 2) .

Рис. 2. Регрессионная зависимость выживаемости Jurkat Т-клеток после 24-ч. культивирования с титановыми образцами, покрытыми оксидами титана. По оси абсцисс — средние значения индекса шероховатости покрытия йа, м; по оси ординат — медиана жизнеспособности клеток

Рис. 3. Клетка линии Jurkat на шероховатой поверхности оксидов титана. Оптическая микроскопия в отраженном свете, темное поле. Ув. х1000

Таблица 3. Коэффициенты ранговой корреляции по Спирмену между индексом шероховатости (Ra] поверхности из оксидов титана и морфофункциональными показателями in vitro культуры Jurkat Т-клеток

Индекс % живых клеток % апоптоза % некроза CD8 CD56 IL-2 IL-4 IL-10 TNFa

Ra -0,95 -0,69 0,95 0,71 -0,95 -0,95 -0,69 -0,92 0,68

n = 9 n = 9 n = 9 n = 14 n = 9 n = 12 n = 12 n = 12 n = 12

р<0,0001 р<0,042 р<0,0001 р<0,004 р<0,0001 р<0,000003 р<0,013 р<0,00003 р<0,015

Таблица 4. Доля апоптозных иигквЬ Т-клеток и уровень внутриклеточных активных форм кислорода после 24-часового культивирования с наноразмерными частицами диоксида титана, Me №1^3)

№ группы Исследуемая группа Результаты измерений

Апоптоз,% Активные формы кислорода, у.е.

1 Контрольная культура клеток 5,87 0,130

на пластике, n = 6 (5,32-6,99) (0,123-0,150)

Образцы наноразмерных частиц, n = 3

2 TiO2, 100 ПДК 4,82 0,131

(4,24-8,5) (0,129-0,194)

3 TiO2, 10 ПДК 4,76 0,139

(3,65-6,39) (0,130-0,162)

ПДК — предельно допустимая концентрация .

Таблица 5. уровень цитокинов в культуральной среде (пг/мл) при культивировании опухолевой линии Jurkat Т-лимфоцитов в присутствии наноразмерной дисперсии, Me (Q1-Q3)

№ группы Исследуемая группа Результаты измерений

TNFa IL-2 IL-4

Контроль секреции для наночастиц, п = 6

1 Контрольная культура клеток 27,41 4,02 4,14 на пластике, п = 6 (26,62-28,17) (3,97-4,04) (4,06-4,24)

Образцы наноразмерных частиц, п = 3

2 TiO2, 100 ПДК 33,52* (32,77-35,0) р<0,05 4,73* (4,61-5,0) р<0,05 3,67* (3,60-3,67) р<0,045

3 TiO2, 10 ПДК 33,51* (33,17-35,49) р<0,05 3,61 (3,56-4,55) 3,40* (3,27-3,60) р<0,045

* — в таблицах 1, 2, 5 указаны различия согласно и-критерию Манна — Уитни при сравнении с контролем секреции .

Полученные данные не позволяют однозначно связать супрессирующий эффект ТЮ2 поверхности на Jurkat Т-клетки через наноразмерные продукты их биодеструкции, поскольку: 1) ТЮ2 наночастицы обладали неоднозначным влиянием на клеточную секреторную активность; 2) использованных концентраций наночастиц (1—10 мг/л) можно добиться только за счет активного биомеханического воздействия на металлокерамическое ТЮ2 покрытие, недостижимого при краткосрочном культивировании; 3) ТЮ2 наночастицы не генерировали внутриклеточные окислительные процессы (табл . 4) .

Результаты измерения электростатических свойств ТЮ2 покрытия на титановой подложке показали отрицательный знак его заряда и среднюю амплитуду потенциала V = -147±35 мВ (число измерений 61). С увеличением индекса шероховатости Ra амплитуда отрицательного потенциала поверхности образцов линейно возрастала (г = 0,6; р<0,000001, п = 60).

Обсуждение

Использованные в нашем эксперименте Jurkat Т-клетки при 24-часовом культивировании на пластиковой поверхности (2й-культура) имели пре-

обладающий иммунофенотип CD3+/CD4+/CD71+/ CD45RA+ (табл . 1), что, в основном, функционально соответствует наивным/покоящимся Т-хелперам/ин-дукторам [15, 16] с экспрессией рецептора ктранс-феррину (CD71), митогену Т-лимфоцитов [17].

Только у 0,55% T-клеток в 24-часовой культуре присутствует CD45RO изоформа трансмембранного антигена, экспрессирующаяся in vitro активированными Т-лимфоцитами и (или) Т-клетками памяти [16, 18].

Jurkat Т-клетки секретировали в межклеточную жидкость (табл . 2) широкий спектр иммуномоду-лирующих цитокинов и хемокинов (IL-2, IL-4, IL-8, IL-10 и TNFa), но не IL-1b и IL-6, с провоспалитель-ной (IL-2, IL-8, TNF-a) и противовоспалительной активностью (IL-4, IL-10) [19]. При этом IL-2, IL-4 [14] и IL-8 [20] повышают пролиферацию и выживаемость опухолевых клеток посредством аутокринных/ паракринных сигнальных путей

В свою очередь, IL-1 рассматривается как ауто-кринный костимулятор роста Т-клеток [14], в том числе линии Jurkat [21], и эндогенный ингибитор их CD95(Fаs)-опосредованного апоптоза [22].

IL-6 также обладает антиапоптотическим эффектом в отношении Т-клеток [16]. Fas (CD95 + ) —

трансмембранный рецептор - определялся только у 1% клеточной популяции (табл . 1). В условиях нехватки костимулирующих аутокринных факторов (IL-1, IL-6, табл . 2) обнаруженный дисбаланс секреции IL-2 (табл . 2) при полном отсутствии экспрессии его рецептора (CD25 антигена) (табл. 1) мог лежать в основе медленного роста Jurkat популяции in vitro.

Дополнительно IL-10 (табл . 2) способен индуцировать анергию Т-клеток [23], подавлять их пролиферацию и активацию, ингибировать экспрессию IL-2, как описано [19].

Долгое время титан считался биоинертным материалом [9, 10] за счет образования тонкой (толщина менее 1 мкм) пленки диоксида титана на своей поверхности посредством «самопассивации». Микродуговое оксидирование титановых подложек позволило увеличить толщину оксидного покрытия в среднем до 9 мкм, что предполагает повышение полезных свойств изделий, включая антикоррозионную стойкость и диэлектрические свойства их поверхности

Металлокерамическая, биоинертная по своей сути, TiO2 пленка не вызывала усиления процессов апоптоза и некроза в культуре Jurkat Т-клеток (табл .

1). Более того, контакт клеточной культуры с потенциальным раздражителем сопровождался подавлением путей клеточной смерти, реализуемых через звенья суперсемейства «TNF-а — CD95(Fas/APO-1)» (табл . 1,2) . С другой стороны, имели место уменьшение экспрессии маркеров дифференцировки и созревания Т-лимфоцитов (CD3, Cd4, CD8), подавление IL-4-зависимых механизмов выживаемости Т-клеток (табл 2)

При индексе шероховатости TiO2 покрытия Ra>2,2 мкм функциональная инактивация Jurkat Т-клеток сопровождалась прогрессивным снижением числа жизнеспособных клеток в культуре (рис

2) При этом результаты (табл 4, 5) клеточного воздействия взвесей наночастиц TiO2 в диапазоне 10—100 ПДК (по титану) не позволяют рассматривать их как однозначного посредника негативного клеточно-молекулярного эффекта рельефа TiO2 покрытия на процессы клеточной смерти

Часть авторов считают, что наночастицы оксидов титана [6], в отличие от ионов и оксидов других металлов, не обладают цитотоксичностью в отношении Jurkat Т-клеток [2, 5]. При этом наночастицы способны адсорбироваться на поверхности Jurkat Т-клеток [24]

В таком случае, взаимодействие Jurkat Т-клеток с рельефом TiO2 покрытия, но не с продуктами его разрушения, скорее всего, лежит в основе снижения их жизнеспособности и функциональной активности Установлены тесные связи индекса шероховатости поверхности (Ra) с морфофункциональными показателями Jurkat Т-клеток (рис . 2, табл . 3). При этом

обратная и прямая его корреляции соответственно с долей апоптозных и некротизированных клеток (табл . 3) позволяют предположить, что именно клеточная мембрана является основной мишенью влияния физических свойств ТЮ2 покрытия .

Неактивированные Jurkat клетки способны посредством электростатического взаимодействия отрицательно заряженных гликопротеинов на своей мембране (дзета-потенциала) прикрепляться к ТЮ2 поверхности, предпочитая участки с нулевым зарядом [25]. Микродуговое ТЮ2 покрытие имеет отрицательный заряд и поверхностный электростатический потенциал, который линейно возрастает с увеличением шероховатости поверхности. Часть Т-лимфобластоподобных клеток адгезируется к ТЮ2 покрытию (рис . 3) и может подвергаться прямому контактному влиянию носителей поверхностного заряда

Подъемный электрод измерителя потенциала фиксирует электрическое поле на расстоянии 500 мкм (50 диаметров клеток) от измеряемой поверхности [13]. Образцы титана закрывали 77% поверхности лунки в культуральном планшете, в связи с чем электрический заряд ТЮ2 покрытия мог оказывать влияние на большую часть популяции Jurkat Т-клеток в течение 24 ч .

Ранее показан благоприятный эффект отрицательного заряда микродуговых кальцийфосфатных покрытий на титане (при сопоставимой шероховатости поверхности) на дифференцировку и созревание здоровых стромальных клеток человека [26]. Изменение величины и знака трансмембранного потенциала, связанного с дзета-потенциалом [27], во многом определяет судьбу клеток [28]

Полученные результаты позволяют предположить, что шероховатость диэлектрического ТЮ2 покрытия индуцирует электростатический потенциал, который, в отличие от здоровых клеток, оказывает тормозящий эффект на морфофункциональную активность иммортализированной Jurkat линии лей-козных Т-лимфобластоподобных клеток человека через механизмы, не связанные с генерацией активных форм кислорода .

Функциональная супрессия иммунокомпетентных клеток может объяснить хорошую выживаемость титановых имплантатов в организме человека и, с другой стороны, иметь значение в случае выбора материала при эндопротезировании и остеосинтезе у больных, страдающих гемобластозами

Благодарности

Авторы выражают признательность старшему научному сотруднику Е.В. Легостаевой (Институт физики прочности и материаловедения СО РАН, г. Томск) за тестирование физических свойств подложек с покрытием из оксидов титана.

ЛИТЕРАТУРА:

1. ГОСТ Р ИСО 10993-20-2009 Изделия медицинские . Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 20. Принципы и методы исследования иммунотоксичности медицинских изделий . Введ . 2010-09-01. М .: Стандартинформ; 2010 .

2 . Au A. , Ha J ., Hernandez M . et al . Nickel and Vanadium Metal Ions Induce Apoptosis of T-lymphocyte Jurkat Cells . J . Biomed . Mater . Res . A . 2006; 79(3): 512-21.

3 . Chen X., Su J ., Chang J . et al . Inhibition of CD147 Gene Expression via RNA Interference Reduces Tumor Cell Proliferation, Activation, Adhesion, and Migration Activity in the Human Jurkat T-lymphoma Cell Line . Cancer Invest . 2008; 26(7): 689-97 .

4 . Stevens M . J ., Donato L . J ., Lower S . K . et al . Oxide-dependent Adhesion of the Jurkat Line of T lymphocytes . Langmuir . 2009; 25(11): 6270-8 .

5 . Caicedo M ., Jacobs J . J ., Reddy A . et al . Analysis of Metal Ion-induced DNA Damage, Apoptosis, and Necrosis in Human (Jurkat) T-cells Demonstrates Ni2+ and V3+ are more Toxic than other Metals: Al3 + , Be2 + , Co2 + , Cr3 + , Cu2 + , Fe3 + , Mo5 + , Nb5 + , Zr2 + . J . Biomed . Mater . Res . A . 2008; 86(4): 905-13 .

6 . Tuomela S ., Autio R ., Buerki-Thurnherr T . et al . Gene expression profiling of immune-competent human cells exposed to engineered zinc oxide or titanium dioxide nanoparticles . PLoS One 2013; 8(7): e68415 .

7 . Хлусов И .А., Сурменева М . A., Сурменев Р . А. и др . Кле-точно-молекулярные аспекты иммунологической совместимости имплантатов с наноструктурным кальцийфосфатным покрытием . Бюллетень сибирской медицины 2012; 4: 78-85 .

8 . Ratner B . D . , Hoffman A. S ., Schoen F .J . et al ., editors . Biomaterials Science: an introduction to materials in medicine . 2nd ed . San Diego: Elsevier Academic Press; 2004.

9 . Thull R . Titan in der Zahnheilkunde-Grundlagen . Z . Mitteilungen . 1992; 82: 39-45 .

10 . Ogawa T . Ultraviolet photofunctionalization of titanium implants . Int . J . Oral Maxillofac . Implants 2014; 29(1): e95-102 .

11. Curtis A . S ., Varde M . Control of cell behavior: topological factors . J . Natl . Cancer Inst . 1964; 33: 15-26 .

12 . Legostaeva E .V ., Kulyashova K . S ., Komarova E . G . et al . Physical, chemical and biological properties of micro-arc deposited calcium phosphate coatings on titanium and zirconium-niobium alloy Mat. -wiss . u .Werkstofftech . 2013; 44(2-3): 188-97 .

13 . Гостищев Э . А ., Сурменев Р . А ., Хлусов И . А . и др . Исследование биоэлектрической совместимости тонких кальций-фосфатных покрытий, полученных методом высокочастотного магнетронно-го распыления . Известия Томского политехнического университета 2011; 319(2): 108-13 .

14 . Де Вита В . Т . , Хеллман С ., Розенберг С .А ., редакторы . Биологические методы лечения онкологических заболеваний: Пер . с англ М: Медицина; 2002

15 Gallagher P F , Fazekas de St Groth B , Miller J F CD4 and CD8 molecules can physically associate with the same T-cell receptor PNAS USA 1989; 86: 10044-8 .

16 Law H K W , Tu W , Liu E et al Insulin-like growth factor I promotes cord blood T cell maturation through monocytes and inhibits their apoptosis in part through interleukin-6 BMC Immunology 2008; 9: 74-86 . doi:10 . 1186/1471-2172-9-74 .

17 . Bi B .Y., Lefebvre A. M ., Dus D . et al . Effect of lactoferrin on proliferation and differentiation of the Jurkat human lymphoblastic T cell line . Arch . Immunol . Ther . Exp (Warsz) . 1997; 45(4): 315-20 .

18 . Akbar A . N ., Terry L ., Timms A . et al . Loss of CD45R and gain of UCHL1 reactivity is a feature of primed T cells . J . Immun . 1988; 140: 2171-78 .

19 . Khalaf H ., Jass J ., Olsson P . E . Differential cytokine regulation by NF-kappaB and AP-1 in Jurkat T-Cells . BMC Immunol . 2010; 27: 11-26 .

20 . Waugh D . J . J ., Wilson C . The interleukin-8 pathway in cancer . Clin . Cancer Res . 2008; 14(21): 6735-41.

21. Arana-Argaez V . E ., Delgado-Rizo V ., Pizano-Martinez O . E . et al . Inhibitors of MAPK pathway ERK1/2 or p38 prevent the IL-1-induced up-regulation of SRP72 autoantigen in Jurkat cells . J . Biol . Chem . 2010; 285: 32824-33 .

22 . Tatsuta T., Cheng J ., Mountz J . D . Intracellular IL-1beta is an inhibitor of fas-mediated apoptosis . J . Immunol . 1996; 157(9): 3949-57 .

23 . Groux H ., Bigler M ., de Vries J . E . et al . Interleukin-10 induces a long-term antigen-specific anergic state in human CD4+ T Cells . J . Exp . Med . 1996; 184: 19-29 .

24 . Montet-Abou K ., Montet X ., Weissleder R . et al . Transfection agent induced nanoparticle cell loading . Mol . Imaging 2005; 4(3): 165-71.

25 Stevens M J , Donato L J , Lower S K et al Oxide-dependent adhesion of the Jurkat line of T lymphocytes . Langmuir. 2009; 25(11): 6270-8

26 Khlusov I A , Khlusova M Y , Pichugin V F et al Artificial niches for stromal stem cells as a potential instrument for the design of the surface of biomimetic osteogenic materials Russian Phys J 2014; 56(10): 1206-11.

27 . Самойлов В . О . Медицинская биофизика . СПб: СпецЛит; 2007 .

28 Sundelacruz S , Levin M , Kaplan D L Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation Stem Cell Rev . 2009; 5: 231-46 .

Поступила: 07.02.2015