CC BY
37
МОРФОЛОГИЯ. ПАТОЛОГИЯ
УДК 547.466.3:616.89-008.441.13:616.127
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОЦЕНКА КАРДИОПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ ПРОИЗВОДНЫХ
ГАМК В УСЛОВИЯХ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ
ИНТОКСИКАЦИИ
В. Н. Перфилова, И. Н. Тюренков, В. Б. Писарев, С. А. Лебедева, В. А. Толокольников, А. Н. Горячев
Кафедра фармакологии и биофармации ФУВ ВолГМУ, НИИ фармакологии при ВолГМУ, кафедра патологической анатомии с секционным курсом морфологии и патологии
Аннотация: в эксперименте на 48 белых беспородных крысах-самцах показано кардиотоксическое действие 50% р-ра этанола в дозе 8 г/кг интрагастрально, 1 раз в день, в течение 30 дней, проявляющееся патологическими изменениями морфоструктуры миокарда, снижением сократимости и инотропных резервов сердца. Выявлено кар-диопротекторное действие производных ГАМК- соединения РГПУ-147 и пирацетама, о чем свидетельствуют незначительные морфофункциональные изменения сердца в этих группах животных по сравнению с контрольной группой алкоголизированных животных в условиях хронической алкогольной интоксикации.
Ключевые слова: хроническая алкогольная интоксикация, производные ГАМК, ультраструктура миокарда, ино-тропные резервы сердца.
Хроническая алкогольная интоксикация обычно сопровождается значительными нарушениями функций соматических органов, в том числе и сердца. По статистике, до 15 % больных, особенно в молодом возрасте, умирают внезапно от сердечной недостаточности, возникающей в результате появления, под воздействием этилового спирта, органических изменений в сердце, что проявляется падением сократительной функции миокарда [8, 9, 15]. Поэтому актуальной задачей современной кардиофармакологии является поиск лекарственных препаратов, ограничивающих токсическое действие этанола на сердце и устраняющих последствия кардиотоксичности алкоголя.
В связи с многофакторным характером алкогольного поражения миокарда, для фармакокор-рекции его необходимо использовать препараты, включающие в себя кардиопротекторные свойства различных групп: антиагрегантов, антигипок-сантов, антиоксидантов и др. К числу таких препаратов можно отнести ГАМК-ергические средства [3-7, 13].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Морфофункциональная оценка кардиопро-текторного действия нового структурного аналога ГАМК - соединения РГПУ-147 в условиях хронической алкогольной интоксикации.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проведены на 48 белых беспородных крысах-самцах массой 260-280 г. Животные были поделены на 4 группы по 12 особей
в каждой. 1-я группа - позитивного контроля (ин-тактные животные), 2-я группа - алкоголизиро-ванные животные (негативный контроль), получавшие за 40 мин до введения этанола физиологического раствора внутрибрюшинно в эквивалентных исследуемым препаратам объемах, 3 и 4 группы - опытные, которые за 40 мин до введения этанола получали соединение РГПУ-147 и препарат сравнения пирацетам в дозах 50 и 200 мг/кг соответственно, 1 раз в день внутрибрюшинно. Хроническую алкогольную интоксикацию моделировали путем интрагастрального введения 50 %-го р-ра этанола 8 г/кг 1 раз в день в течение 30 дней. Содержание животных производилось в соответствии с "Приказом МЗ РФ № 750", Рекомендациями Комитета при Минздраве России, рекомендациями ВОЗ по экспериментальной работе с использованием животных [2, 14, 16] на базе НИИ фармакологии и кафедры фармакологии и биофармации ФУВ ВолГМУ.
Через месяц после алкоголизации по 6 животных из каждой группы под нембуталовым наркозом декапитировали. Исследуемый материал (ткани сердца целиком) фиксировали в 10 %-м р-ре формалина в течение 48 часов с дальнейшим обезвоживанием и изготовлением парафиновых блоков. Для морфологического исследования миокарда использовались серийные фронтальные срезы, окрашенные гематоксилином и эозином, Суданом III и IV. Было произведено 100 срезов на каждое сердце экспериментального животного. Микрофотосъемку с микропрепаратов производили фотокамерой CONTEX на увеличении 100, 400.
Морфометрическое исследование проведено в соответствии со сложившимися принципами системного количественного анализа [1]. Для прямого морфометрического исследования были использованы оцифрованные микрофотограммы миокарда крыс, обработанные с помощью программы для морфометрии "Image Tool, 3,00" (Texas, USA). В ткани миокарда определяли объемные доли (%) кардиомиоцитов (КМЦ), сосудов и соединительной ткани. Также определяли среднюю толщину (мкм), среднюю площадь поперечного сечения КМЦ (мкм2) и их ядер (мкм2). Статистическая обработка полученных данных была проведена общепринятыми для медико-биологических исследований методами с использованием пакета анализа "MS Excel" (USA).
Исследование сократимости миокарда и его инотропных резервов осуществлялось с помощью нагрузочных проб: нагрузки объемом, максимальной изометрической нагрузки. Нагрузка объемом осуществлялась путем введения 3 мл/кг физиологического раствора, максимальная изометрическая нагрузка - пережатием восходящей части дуги аорты на 30 с [12]. При этом регистрировались левожелудочковое давление (ЛЖД) и его первая производная (dp/dt+ и dp/dt-). Полученные данные сопоставлялись между собой. Более высокие показатели сократимости миокарда и ино-тропные резервы у животных опытных групп по сравнению с контрольной группой алкоголизиро-ванных животных свидетельствовали о кардио-протективном действии исследуемых веществ.
Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с помощью программы STATISTICA с использованием критерия Ньюме-на-Кейлса и представлена в виде М ± S, где М -средняя арифметическая, S - стандартная ошибка среднего.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
При морфологическом исследовании препаратов у интактной группы животных не было выявлено патологических изменений в миокарде. Общая картина миокарда животных контрольной группы представлена на рис. 1.
» »
_* ' .
Рис. 1. Интактный миокард. Ув. х400
1-20081
У животных, подвергшихся хронической алкоголизации, обнаружены выраженные дегенеративные изменения цитоплазмы и ядер кардиомиоцитов (извитость и жировая инфильтрация кардиомиоцитов, дефрагментация миофибрилл, увеличение и снижение плотности прокрашивания ядер), фиброзные изменения в интерстиции миокарда, нарушение коронарного кровообращения в виде полнокровия сосудов, стазов и слад-жирования эритроцитов, петехиальных кровоизлияний, набухания эндотелиоцитов сосудистого русла (рис. 2-5).
При введении соединения РГПУ-147 алко-голизированным животным изменения в тканях сердца проявлялись в значительно меньшей мере в сравнении с группой алкоголизированных крыс, о чем свидетельствует незначительная извитость кардиомиоцитов, пылевидная жировая инфильтрация, фиксируется небольшое снижение гликогена в цитоплазме кардиомиоцитов; дегенеративные изменения кардиомиоцитов минимальны, с единичными, слабо выраженными, дефрагментированными миофибрилловыми волокнами, отмечается минимальный отёк стромы миокарда с фокусами отложения соединительнотканных волокон. Сосуды менее полнокровны, в них определяются единичные проявления стаза и сладжирования эритроцитов, перива-скулярно фиксируется небольшое количество петехиальных кровоизлияний, отдельные кар-диомиоциты незначительно гипертрофированны (рис. 4-5).
Морфологические изменения в миокарде ал-коголизированных животных, получавших пираце-там, были более выражены по сравнению с группой животных, которым вводилось соединение РГПУ-147. В их миокарде отмечается значительная извитость и жировая инфильтрация кардио-миоцитов (особенно ярко проявляющаяся в поперечно расположенных мышечных волокнах), определяются умеренно выраженные жировые вакуоли, фиксируется существенное снижение гликогена в цитоплазме кардиомиоцитов. Обнаружены дегенеративные изменения кардиомио-цитов, сосуды полнокровны, спазмированы, эн-дотелиоциты кровеносных капилляров набухшие, с незначительно выраженной белково-вакуольной инфильтрацией, в сосудах определяются явления стаза и сладжирования эритроцитов, периваскулярно фиксируется умеренное количество очагов петехиальных кровоизлияний и незначительно гипертрофированных кардио-миоцитов (рис. 6-7).
В результате проведенных морфометриче-ских исследований обнаружено, что у крыс, подвергшихся 30-дневной алкогольной интоксикации, происходит уменьшение объемной доли кар-диомиоцитов, что свидетельствует о снижении числа активно функционирующих клеток (см. табл.).
Рис. 2. Миокард алкоголизированных животных. Ув. х100: 1 - отек стромы, 2 - фиброз интерстиция, 3 - полнокровие сосудов, стаз и сладж эритроцитов, 4 - выраженная извитость кардиомиоцитов
Рис. 3. Миокард алкоголизированных животных. Ув. х400: 1 - фрагментация клеток, 2 - извитость кардиомиоцитов, 3 -гиперхромность ядер, 4 - экстравазация эритроцитов, 5 -стромальный отек, 6 - фиброз интерстиция
Рис. 4. Миокард алкоголизированных животных, получавших соединение РГПУ-147. Ув. х400: 1 - умеренное полнокровие сосудов, незначительные явления стаза и сладжа, 2 - незначительный отек ткани, 3 - слабая извитость кардиомиоцитов
Рис. 5. Миокард алкоголизированных животных, получавших соединение РГПУ-147. Ув. х400: 1 - небольшая волнистость миофибрилл, 2 - незначительный межклеточный отек
Рис. 6. Миокард алкоголизированных животных, получавших пирацетам. Ув. х400: 1 - отек межклеточного пространства, 2 - фрагментация и дезинтеграция кардиомиоцитов
Рис. 7. Миокард алкоголизированных животных, получавших пирацетам. Ув. х400: 1 - выраженный отек стромы, 2 - отчетливая извитость мышечных волокон, 3 - выраженные жировые вакуоли, 4 - петехиаль-ные периваскулярные кровоизлияния, 5 - фрагментация кар-диомиоцитов, 6 - выраженная гипертрофия клеток, 7 - гипер-хромия ядер кардиомиоцитов
Таблица
Показатели морфометрии миокарда у крыс с хронической алкогольной интоксикацией (M±m)
Исследуемые показатели Интактные животные (физиол. р-р) Алкоголизированные животные (алкоголь) Пирацетам + алкоголь РГПУ-147 + алкоголь
Объемная доля КМЦ, % 74,8+3,6 66,0+2,4* 68,6+1,7 75,8+2,6**
Объемная доля сосудов, % 2,2+0,2 5,5+0,2* 4,8+0,3** 2,8+0,2**
Объемная доля фиброб-ластов, % 5,2+0,4 7,0+0,4* 6,2+0,4 5,8+0,4**
Объемные доли соединительной ткани и инфильтратов, % 14,6+1,3 25,7+1,8* 22,4+2,1 16,2+1,4**
Толщина КМЦ, мкм 40,0+1,6 58,9+1,8* 50,4+2,3** 46,5+2,8**
Площадь поперечного сечения КМЦ, мкм2 152,5+10,1 290,5+6,9* 211,5+6,9** 161,8+7,9**
Площадь поперечного сечения ядер КМЦ, мкм2 26,8+1,8 27,4+1,6 27,9+0,9 24,0+1,3**
* - достоверные различия негативного контроля с интактной группой (р<0,05); ' гативным контролем (р<0,05).
достоверные различия опытных групп с не-
При этом происходит увеличение объемных долей фибробластов и соединительной ткани, указывающих на явления мелкоочагового фиброза, характерного для гипоксического повреждения ткани миокарда при алкогольной интоксикации и нарастании склеротических процессов. Увеличение объемной доли сосудов можно трактовать как необходимость компенсаторного ангиогенеза в условиях относительной гипоксии. Анализ данных показывает, что, несмотря на уменьшение объемной доли кардиомиоцитов, в последних наблюдается статистически достоверное увеличение таких показателей, как толщина и площадь поперечного сечения (табл.).
Это можно охарактеризовать как явление компенсаторной гипертрофии миокарда. К этому же процессу можно отнести и увеличенный показатель площади поперечного сечения ядер клеток миокарда при алкогольной интоксикации, указывающий на активные синтетические и метаболические процессы в них как отражение внутриклеточной регенерации в ответ на повреждающее действие этилового алкоголя. Однако данный критерий статистически недостоверен (см. табл.).
При морфометрическом исследовании миокарда алкоголизированных животных, получавших соединение РГПУ-147, было обнаружено статистически достоверное, по основной массе критериев, его кардиопротективное действие. Защитное действие препарата сравнения пираце-тама выражено незначительно и по ряду морфо-метрических критериев статистически недостоверно в сравнении с аналогичными показателями алкоголизированных животных контрольной группы.
Хроническая алкогольная интоксикация способствует значительному снижению инотропных резервов сердца, что проявляется в несущественном увеличении у алкоголизированных животных ЛЖД, скорости сокращения (dp/dt+), скорости
расслабления (dp/dt-) миокарда в условиях нагрузки объемом и максимальной изометрической нагрузки по сравнению с интактной группой (рис. 1, 2, а-с).
У животных, получавших перед алкоголизацией соединение РГПУ-147 и препарат сравнения пирацетам при нагрузке объемом ЛЖД увеличивалась на 16,5 и 14 %, скорость сокращения -на 24,7 и 16,7 %, скорость расслабления на 27 и 24,4 % соответственно, что было достоверно выше, чем у животных негативного контроля (р<0,05) (рис. 1, а-с). При максимальной изометрической нагрузке у групп животных, получавших соединение РГПУ-147, статистически значимо (р<0,05) увеличивались ЛЖД, dp/dt+ и dp/dt- по сравнению с контрольной группой животных, получавших этанол на 60,7; 35,2 и 129 % соответственно. У животных, получавших пирацетам - на 58,4; 29 и 124,5 %, что также было выше, чем в контрольной группе алкоголизированных животных, однако статистически значимых отличий выявлено не было (рис. 2, а-с).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, морфофункциональное исследование токсического действия алкоголя на сердце показало, что 30-дневное введение 50 %-го р-ра этанола 8 г/кг интрагастрально один раз в день приводит к патологическим изменениям в миокарде крыс. Обнаружено, что данные патологические изменения способствуют нарушению сократительных свойств сердца, которые проявляются при использовании нагрузочных тестов. Аналог гамма-аминомасляной кислоты соединение РГПУ-147, в большей степени, и препарат сравнения пирацетам способны предотвращать повреждающее действие этанола, что подтверждается как морфометрическими данными, так и при исследовании функциональных резервов сердца.
40 35 30 25 20 15 10 5
0
ис -5
-10
* ' " -Г
* I*
А Г г.. " ::
/•'' 1 ^ . У 1 --н к '
к'; А ' г
г '
ход 5 сек 10 сек 15- сек 20 сек 25 сек 30- с
время
* - J
* А ' * к. ; ■-
//' /' \ ( - >1 . ✓ = Г —\ \ 'о . , V ч
/ ^ ■ ■ 1
ход 5 сек 10 сек 15 сек 20 сек 25 сек 30 с
время
50
40
30
20
10
0 ис -10
-20
од 5 сек 10 сек 15 сек 20
;ек 30. сек
время
♦ интакт -А--- РГПУ-147+алкоголь
- алкоголь+физ.р-р
- пирацетам+алкоголь
Рис. 1. Изменение ЛЖД (а), скорости сокращения (б) и скорости расслабления (с) миокарда у алкоголизиро-
ванных животных в условиях нагрузки объемом: * - изменения показателей достоверны по отношению к группе алкоголизированных животных по д-критерию Ньюмена-Кейлса при р<0,05
* *
! Г 4 N J [—|
\\ •, ч\' : !! ' -11
ход 5 сек 10 сек 15 сек 20 сек 25 сек 30 сек 51 р-10 !
время
* * I__т 1
№""" ■ " * И ■ - ч
1- • ч у г .
'Ч\ • ■ \| н--'н
■■ — — \\ ход 5 сек 10 сек 15 сек 20 сек 25 сек 30 сек 5 1 еТТ0 г- II
время
80
60
40
20
0 ис -20
-40
-60
-80
од 5 сек 10 сек 15 сек 20 сек
время
♦ интакт - - -А- - - РГПУ-147+алкоголь
- алкоголь+физ.р-р
- пирацетам+алкоголь
Рис. 2. Изменение ЛЖД (а), скорости сокращения (б) и скорости расслабления (с) миокарда у алкоголизиро-ванных животных в условиях максимальной изометрической нагрузки: * - изменения показателей достоверны по отношению к группе алкоголизированных животных по ^-критерию Ньюмена-Кейлса при р<0,05; # - изменения показателей достоверны по отношению к группе животных, получавших препарат сравнения пир-ацетам по ^-критерию Ньюмена-Кейлса при р<0,05
о 50
0
-100
а
а
50
100
40
80
60
30
40
20
20
0
10
сек 25
В
в
Учитывая политропное действие ГАМК и ее аналогов, можно предполагать, что кардиопро-текторный эффект соединения РГПУ-147 и пир-ацетама в условиях ХАИ обусловлен способностью ограничивать повреждающее действие активных форм кислорода на мембраны кардио-миоцитов и их гибель, улучшать коронароный кровоток и микроциркуляцию, стимулировать процессы энергообразования [15, 16].
Таким образом, можно сделать заключение, что производные ГАМК - соединение РГПУ-147 и пирацетам - предотвращают повреждающее действие этанола, т. е. обладают кардиопротек-торным действием в условиях хронической алкоголизации.
ЛИТЕРАТУРА
1. Автандилов Г. Г. Медицинская морфометрия. -М., 1990. - 384 с.
2. Березовская И. В. // Ланималогия - 1993. -№ 1. - С. 42-43.
3. Воронков А. В. Нейропротекторные свойства фенибута и его аналогов при алкогольном повреждении мозга: автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - Волгоград, 2003. - 24 с.
4. Гречко О. Ю. Кардиоваскулярные свойства новых производных фенибута и карфедона: автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - Волгоград, 2000. - 20 с.
5. Кошкин И. В., Букач Т. А. Алкогольное поражение сердца. Практическое руководство. - Набережные Челны, 2001. - 112 с.
1-20081
6. Кресюн В. И., Кравченко В. С., Кадырова Л. Л.// Фармакол и токсикол. - 1990. - Т. 53, № 2. - С. 29-31.
7. Ледяев М. Я. Влияние новых соединений - производных гамма-аминомасляной кислоты на агрегацию тромбоцитов и свертывание крови: автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - М., 1986.
8. Моисеев В. С. // Кардиология. - 2003. - № 10. -С. 4-9.
9. Оковитый С. В. // ФАРМиндекс-Практик. -2003. - Вып. 5. - С. 85-111.
10. Перфилова В. Н., Тюренков И. Н., Лебедева С. А. и др. // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2006. - № 2(18). - С. 78-81.
11. Перфилова В. Н., Островский О. В., Веров-ский В. Е. и др. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 143, № 3. - С. 312-315.
12. Тюренков И. Н., Гурбанов К. Г. // Достижения современной экспериментальной фармакологии сердечно-сосудистой системы. - Воронеж, 1981. -С. 50-66.
13. Хан В. В. Влияние некоторых производных гамма-аминомасляной и янтарной кислот на коронарное кровобращение в условиях ишемизированного миокарда: автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - Ростов-н/Д, 1990. - 26 с.
14. Червонская Г. П., Панкратова Г. П., Миронова Л. Л. и др. // Токсикол. вестн. - 1998. - № 3. - C. 2-8.
15. Keatsky Arthaus Z. Alkogol in Heaelt and Disease. - New-York: Barsel. - 2001. - P. 517-546.
16. Zutphen L. F., Baumans V., Beynen A. C. Principles of laboratory animal science. - Amsterdam: Elsevier, 1993. - 389 p.
