CC BY
76ТЕХНОЛОГИИ echnologies
МОНИТОРИНГ СТЕПЕНИ ЗАГРЯЗНЕНИЯ МОЛОКА ОСТАТОЧНЫМИ КОЛИЧЕСТВАМИ АНТИБИОТИКОВ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ КОСТАНАЙСКОЙ ОБЛАСТИ
Рыщанова Раушан Мейрамбаевна,
кандидат ветеринарных наук, доктор PhD, профессор + 77476975277, raushan5888@mail. ru
Коканов Сабит Кабдешевич,
кандидат ветеринарных наук, начальник научно-инновационного центра испытательной лаборатории производства продуктов питания + 77058149133 [email protected]
Паламарчук Виктория Валерьевна,
магистрант + 77057010157, glamusichka@mail. ru
Костанайский государственный университет им. А. Байтурсынова (г.Костанай, Казахстан)
УДК 619:614:31:637.5:577.182.54
Аннотация. Целью статьи является предел обнаружения и специфичность иммуноферментного анализа антибиотиков на примере тетрациклина и хлорамфеникола, проследить за степенью загрязнения молока остаточными количествами антибиотиков. Вступление Республики Казахстан во Всемирную торговую организацию (2015 г.), расширение экспортно-импортных операций определяют необходимость повышения уровня контроля за состоянием здоровья животных, безопасностью продуктов животного происхождения и кормов, соблюдением требований основных положений общепризнанных международных договоров и соглашений. В связи с этим есть основание для тщательного контроля пищевых продуктов на наличие в них остатков антибиотиков. В статье приведены результаты исследований остаточных количеств антибиотиков тетрациклина и хлорамфеникола в молоке методом ИФА. Исследованию подвергли молоко - всего 57 проб. При проведении исследований применялись физико-химические и иммунологические методы. Для обработки результатов ИФА использовали специальную программу для иммуноферментных тестов, разработанную компанией R-Biopharm RIDASCREEN®. Опыты были проведены с использованием молока отечественного производства и импортного происхождения реализуемых в Костанайской области. Согласно Единым санитарно-эпидемиологическим и гигиеническим требованиям к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому надзору
Таможенного союза ЕврАзЭС максимально допустимый уровень содержания антибиотиков тетрациклинового ряда составляет 0,01 мг/кг. В результате проведенных исследований выявлено превышение максимально допустимого уровня тетрациклина в молоке от частного сектора и ТОО «Билдсервис».
Ключевые слова: мониторинг, молоко, антибиотики, ИФА, тест-система, контроль, образцы.
ТЕХНОЛОГИИ echnologies
MONITORING THE DEGREE OF CONTAMINATION OF MILK BY RESIDUAL QUANTITIES OF ANTIBIOTICS MANUFACTURERS KOSTANAY REGION
Raushan M. Rysanova,
candidate of veterinary Sciences, PhD, Professor + 77476975277 raushan5888@mail. ru
Sabit K. Kokanov,
candidate of veterinary Sciences, chief of the research and innovation center of the testing laboratory of food production + 77058149133 [email protected]
Victoria V. Palamarchuk,
master's student + 770570157 glamusichka@mail. ru
Kostanay state University by A. Baitursynov (Kostanay, Kazakhstan)
Abstract. The aim of the article is to limit the detection and specificity of enzyme immunoassay of antibiotics on the example of tetracycline and chloramphenicol, to monitor the degree of contamination of milk residues of antibiotics. Accession of the Republic of Kazakhstan to the world trade organization (2015), the expansion of exportimport operations determines the need to increase the level of control over the health of animals, the safety of animal products and feed, compliance with the requirements of the basic provisions of generally recognized international treaties and agreements. In this regard, there is a reason for careful monitoring of food products for the presence of antibiotic residues in them. The article presents the results of studies of residues of antibiotics tetracycline and chloramphenicol in milk by ELISA. The study was subjected to the milk - a total of 57 samples. During the research physicochemical and immunological methods were used. To process the results of ELISA, a special program for enzyme immunoassay developed by R-Biopharm RIDASCREEN was used. The experiments were conducted using milk of domestic production and imported origin sold in Kostanay region. According to the Unified sanitary-epidemiological and hygienic requirements for goods subject to sanitary-epidemiological supervision of the customs Union of EurAsEC, the maximum permissible level of tetracycline antibiotics is 0.01 mg/kg.as a result of the conducted studies, the excess of the maximum permissible level of tetracycline in milk from the private sector and Bildservice LLP was revealed.
Key words: monitoring, milk, antibiotics, ELISA, test system, control, samples.
1. Введение
В последние годы химизация вошла в нашу жизнь и весьма крепко закрепилась в ней. Химические вещества нашли применение во всех сферах жизнедеятельности. И ветеринария здесь не является исключением. Особую роль играет применение лекарственных веществ.
Стремительный рост потребления продукции агропромышленного комплекса требует увеличения производительности и, как следствие, снижение себестоимости продукции достигаются при рациональном применении антибиотиков и стимуляторов роста в животноводстве. Отечественные производители сельскохозяйственной продукции, использующие в соответствии со своим технологическим регламентом антибиотики и стимуляторы роста, должны гарантировать безопасность продукции для здоровья человека. В настоящее время антибиотики широко применяются в медицинской и ветеринарной практике для лечения различных инфекционных заболеваний. Многие антибиотики обладают узким
Щ ТЕХНОЛОГИИ lechnologies
ISSN: 2658-4018
терапевтическим диапазоном и выраженным побочным действием, что делает потенциально опасным их бесконтрольное применение. При попадании в организм человека антибиотиков с пищевыми продуктами возможны любые токсические эффекты чаще всего в виде возникновения аллергических реакций, дисбактериозов и других неблагоприятных явлений. Вследствие чего возникла проблема возможного загрязнения продуктов питания животного происхождения остаточными количествами антибиотиков. Основная трудность в системе контроля за антибиотиками заключается в проблематичности сбора информации о влиянии тех или иных химических соединений на состояние здоровья человека. И связано это, прежде всего с тем, что между антибиотиком и человеком находится животное, в тканях которого могут содержаться не только остатки первичного соединения, но и остатки различных метаболитов. Эти вещества могут удаляться из организма животного как быстро, так и длительно.
В связи с этим необходимо проведение лекарственного мониторинга антибиотиков, который обеспечивает выбор индивидуальной дозы и схемы применения антибиотиков, повышает эффективность и безопасность лечения, необходимость непрерывного контроля за содержанием антибиотиков в организме больных животных. Согласно этого, есть основание для тщательного контроля пищевых продуктов на наличие в них остатков антибиотиков.
Рассмотрим методы определения антибиотиков в молоке. Микробиологические методы, используемые для анализа антибиотиков, имеют ряд недостатков, в частности для них характерны недостаточная чувствительность, специфичность и надежность. Физико -химические методы это трудоемкая и длительная пробоподготовка. Твердофазный иммуноферментный анализ получил широкое распространение для осуществления лекарственного мониторинга и антибиотикотерапии, а также для контроля продуктов питания.
Следует отметить, что на сегодняшний момент методом ИФА и ВЭЖХ возможно определять только остаточные количества левомицетина и тетрациклина, тогда как на практике применяется около 50 антибиотиков и их миксов.
Целью работы является предел обнаружения и специфичность иммуноферментного анализа антибиотиков на примере тетрациклина и хлорамфеникола, проследить за степенью загрязнения молока остаточными количествами антибиотиков.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
- определение остаточных количеств хлорамфеникола и тетрациклина в молоке методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы RIDASCREEN Chloramphenicol;
- провести сравнительный анализ чувствительности лабораторных методов выявления антибиотиков в продуктах животноводства (ИФА, ВЭЖХ и микробиологический метод);
- дать ветеринарно-санитарную оценку продукции животноводства при обнаружении остаточных количеств антибиотиков.
2. Методы и материалы
Работа проводилась в период с 2017 г. по 2018 г. в иммунобиологическом отделе испытательной лаборатории производства продуктов питания научно-инновационного центра при КГУ имени А. Байтурсынова. Мониторинговые исследования по обнаружению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животного происхождения проводили методом случайной выборки отбора образцов для собственных исследований, на рынках, в частном секторе, в торговой сети, ТОО «Билдсервис» п. Затобольск. Исследованию подвергли молоко - всего 57 проб. При проведении исследований применялись физико -химические и иммунологические методы. Определение остаточных количеств хлорамфеникола и тетрациклина в молоке методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы RIDASCREEN Chloramphenicol. Определяли чувствительность к тетрациклину и
Щ ТЕХНОЛОГИИ lechnologies
ISSN: 2658-4018
хлорамфениколу. Их содержание в животноводческой продукции регламентируется СанПиН 2.3.2.1078-01 и ФАО - ВОЗ. Измерения проводили на планшетном фотометре «Униплан» с использованием фильтра, соответствующего длине волны 450 нм. Пользовались методическими указаниями по «Определению остаточных количеств тетрациклина (Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа» (МУК 41.1912-04). Достоверность различий устанавливали по методу Стьюдента-Фишера (Плохинский Ш.А., 1970).
Брали молоко объемом 5 см3 охладили до температуры 6 ± 2 С, перенесли в центрифужную пробирку, центрифугировали при температуре 4 - 10 С в течение 15 мин (при эффективности центрифугирования 4000 g). Удалили верхний слой жира и перенесли аликвоту обезжиренного молока в новую чистую пробирку. Смешали обезжиренное молоко с буфером № 2 (буферный раствор № 2 используется для разведения стандартных растворов при исследовании проб молока.) в соотношение 1:10. Для анализа использовали 0,05 см3 разведения обезжиренного молока с буфером на 1 лунку планшета. Коэффициент разбавления
Вставили в рамку планшета стрипы (лунки) в двух повторностях. Записали координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов.
1. Добавили по 0,05 см3 стандартных растворов и подготовленных растворов исследуемых образцов в соответствующие пары лунок.
2. Добавили по 0,05 см3 раствора антител в каждую лунку, перемешали вручную, легкими круговыми движениями рамки планшета по поверхности стола, избегая попадания смеси в соседние лунки, и оставили на инкубацию в течение 1 часа при комнатной температуре в пределах 20-25 С.
3. Вылили жидкость из лунок, перевернув рамку планшета и выбили капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполнили лунки 0,25 см3 раствора фосфатного моющего буфера и снова удалили раствор из лунок. Выбили капли жидкости, как описано выше. Повторили процедуру промывки лунок раствором фосфатного буфера еще два раза.
4. Добавили в каждую лунку по 0,1 см3 раствора коньюгата. Тщательно перемешали вручную и оставили на инкубацию в течение 15 мин при комнатной температуре в пределах
5. Вылили жидкость из лунок, перевернув рамку и тщательно выбили капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполнили лунки 0,25 см3 раствора фосфатного буфера и снова опорожнили лунки. Выбили капли жидкости, как описано выше. Повторили процедуру промывки лунок раствором фосфатного буфера еще два раза.
6. Добавили по 0,05 см3 субстрата и по 0,05 см3 хромогена в каждую лунку. Тщательно перемешали и инкубировали при комнатной температуре в пределах 20-25С в течение 15 мин в темноте.
7. Добавили в каждую лунку по 0,1 см3 стоп-реагента и перемешали вручную. (Рисунок1) В течение 60 мин, не более, после добавления стоп-реагента измерили оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм (бланк или нулевое считывание по воздуху), используя фотометр планшетный.
10.
20-25С.
ТЕХНОЛОГИИ echnologies
Рисунок 1. Внесение стоп-реагента
Данные по содержанию остаточных количеств антибиотиков были получены микробиологическим методом диффузии в агар. При приготовлении питательной среды использовали пептон, дрожжевой экстракт, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный, 40 %-ный коммерческий раствор глюкозы («Реахим», Россия). Оптимальной считали агарозную питательную среду, приготовленную на переваре Хоттингера с содержанием 120 - 140 мг % аминного азота, рН 7,2 -7,4 с добавлением 1 % глюкозы в виде 40 % стерильного раствора (при культивировании получали четкие зоны ингибиции).
3. Результаты
Результаты исследований остаточных количеств антибиотиков методом иммуноферментного анализа, высокоэффективной жидкостной хроматографии представлены в таблице 1.
Таблица 1. - Количество антибиотиков в молоке методом иммуноферментного анализа
исследуемые пробы организация, предоставившая пробы антибиотики организация проводившая исследование
хлорамфеникол тетрациклин
молоко ТОО «Билдсервис» 0 7 ил ппп ниц
молоко центральный рынок 0 11 ил ппп ниц
молоко частный сектор 0 13 ил ппп ниц
молоко торговая сеть 0 0 ил ппп ниц
Концентрация тетрациклина в образцах, подготовленных по МУК 4.1.1912-04, составила в молоке - 0,043 мг/кг, молоко содержало наиболее широкий спектр из выделенных антибиотиков - тетрациклина. Из 57 образцов в 31 были обнаружены антибиотики, что составило 57 %. Установлено, что во всех пробах остаточные количества антибиотиков в
ТЕХНОЛОГИИ echnologies
десятки раз превышали МДУ, который определен СанПиН 2.3.2.1078-01, тогда как согласно инструкций молоко от коров, которых лечили антибиотиками, не должно поступать в пищу. Обнаружение в пробах только перечисленных антибиотиков объясняется тем фактом, что для анализа положительных проб использовали методы дифференциального определения только хлорамфениколов и тетрациклинов.
Результаты сравнительного тестирования чувствительности методов ИФА, ВЭЖХ (МУК 4.1.1912-04) и микробиологического метода (МУК 3049-84) по определению хлорамфеникола и тетрациклина в одних и тех же молока представлены в таблице 2.
Таблица 2. - Определение хлорамфеникола и тетрациклина в молоке
Образец АБ Концентрация антибиотика, мг/кг
ИФ &А ВЭЖХ Микробиология Мт
1 2 1 2 1 2 1 2
Молоко № 1 Т 0,064 0,063 0,071 0,051 0,070 0,08 0,0670,003 0,0650,01
Молоко № 2 Т 0,068 0,065 0,065 0,050 0,060 0,050 0,0610,004 0,0550,007
Молоко № 3 Т 0,043 0,046 0,047 0,040 0,040 0,040 0,0430,002 0,0420,003
Молоко № 4 Т 0,050 0,051 0,055 0,045 0,050 0,040 0,0510,002 0,0450,003
Образцы:1 - рынок; 2-ч/с; 3- торговая сеть; 4-ТОО «Билдсервис»
Х - хлорамфеникол, Т - тетрациклин
Результаты, полученные параллельно с использованием одних и тех же образцов, вполне сопоставимы и различаются незначительно, что свидетельствует о сходной эффективности использованных методов.
Статистическая обработка данных позволила определить, что отличия в концентрации антибиотиков, полученной с помощью различных методов, не превышают 10% -ный уровень. То есть, повторяемость результатов при использовании разных методов очень высокая. Более чувствительный метод ИФА может использоваться для изучения образцов с пограничным содержанием антибиотиков во избежание получения ложно отрицательных результатов.
Микробиологический метод определения антибиотиков, как наиболее доступный, может использоваться для скрининговых целей, а положительные результаты, полученные с его помощью, должны служить основанием для дальнейших исследований продуктов животноводства методом ИФА
Таблица 3. - Влияние кипячения молока на разрушение антибиотиков
Образец молока Исходное содержание антибиотика, мг/л (Мт) Содержание антибиотиков после обработки
Кипячение
мг/л (Мт) %
Естественный фон, n 15 0,009 (0,0002) 0,0086 (0,01) 95
Тетрациклин, n 10 0,5 (0,002) 0,465 (0,02) 93
t
39
ТЕХНОЛОГИИ echnologies
При рассмотрении результатов анализов, очевидно, что кипячение практически не влияют на количество антибиотиков в молоке. После кипячения в молоке остается от 90 до 95 % исходного количества антибиотиков, то есть разрушается от 5 до 10 % их количества.
Для проведения иммуноферментного анализа по определению антибиотиков в молоке использовали тест-системы Ridascreen® Tetracyclin, Ridascreen® Chloramphenicol, производства R-Biopharm AG, Дармштадт, Германия (Рисунок 2).
Рисунок 2. Набор реагентов ИФА для детекции хлорамфеникола
Интерпретация результатов анализа
Для обработки результатов ИФА использовали специальную программу для иммуноферментных тестов, разработанную компанией R-Biopharm RIDASCREEN®'
Инструкция по обработке результатов анализа без использования программного обеспечения:
А R
— * 100 = — (%), где
Ао Во
А-абсорбция стандартного раствора (или пробы);
Ао- абсорбция нулевого стандарта плотности
Нулевой стандарт приравнивается, таким образом, к 100%, а величины оптической плотности указываются в процентах. По величинам относительной оптической плотности, вычисленным для стандартных растворов и соответствующим значениям концентрации антибиотика в цг/л строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат.
Для того чтобы вычислить концентрацию антибиотика в исследуемой исходной пробе в цг/л, величину концентрации антибиотика, полученную по калибровочной кривой, следует умножить на соответствующий фактор разведения. При работе в соответствии с протоколами пробоподготовки, используются факторы разведения, указанные в таблице 4.
Таблица 4 - Факторы разведения для исследуемых образцов
Для определения тетрациклина:
молоко, молочная продукция, мясо, рыба, креветки 10
молочный порошок 100
сыр 25
сливочное масло, колбасные изделия 20
мёд 50
ТЕХНОЛОГИИ echnologies
Окончание табл. 4
цельное яйцо 60
Для определения хлорамфеникола:
молоко 1
молочный порошок 1
йогурт, кефир, сливочное масло, сливки 0,5
творог, сметана 1
мясо, рыба, креветки 0,25
яйца 1
плазма/ сыворотка 1
4. Заключение
Сырье и продукты животного происхождения отечественного производства, отобранные на предприятиях и на рынках г. Костаная, содержат остаточные количества антибиотиков. Наиболее часто в образцах обнаруживались антибиотики тетрациклинового ряда - в 74,5 % проб.
Методы ИФА и микробиологический метод позволяют определять остаточные количества антибиотиков на уровне, обусловленном требованиями СанПиН 2.3.2.1078-01 (0,01 мг/кг). Более чувствительный метод ИФА (0,00001 мг/кг) может использоваться для изучения образцов с пограничным содержанием антибиотиков во избежание получения ложноотрицательных результатов.
Кипячение незначительно влияет на содержание остаточных количеств антибиотиков в молоке. После кипячение в молоке остается от 90 до 95% исходного количества антибиотиков.
Контроль за остаточными количествами антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения должны проводиться повсеместно и регулярно с целью исключения поступления к потребителю продукции, не соответствующей требованиям стандартов качества и безопасности по содержанию лекарственных препаратов.
5. Конфликт интересов
Авторы подтверждают, что представленные данные не содержат конфликтных интересов.
6. Благодарности
Работа была подготовлена при поддержке иммунобиологическим отделом испытательной лаборатории производства продуктов питания научно-инновационного центра при КГУ имени А. Байтурсынова, под руководством научного руководителя Коканова С. К. и кандидата ветеринарных наук, доктора PhD Рыщанова Р.М.
Список литературы
1. Субботин, В.М. Современные лекарственные средства в ветеринарии / В.М. Субботин, С.Г. Субботина, И.Д. Александров. - Серия "Ветеринария и животноводство", Ростов-на-Дону: «Феникс», 2000. - 592 с.
2. Данилевская, Н. В. Особенности применения антибиотиков в ветеринарной практике [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.vettorg.ru/articles/item-39.html
3. Егоров, A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа / Е.М. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова. -Москва: Высшая школа, 1991. - 288 с.
4. Nilsson, L. Correlation of bioluminescent assay of gentamicin in serum with agar diffusion assay, latex agglutination inhibition card test, enzyme immunoassay, and fluorescence immunoassay. - J. Clin. Microbiol., 1984. - 20(3). - Р. 396-399.
Щ ТЕХНОЛОГИИ lechnologies
ISSN: 2658-4018
5. Костюковский А. Методы определения антибиотиков в пищевых продуктах / А. Костюковский, Д.Б. // Меламед. - Мед. реф. ж., 1985. - Разд.У11(5). - с. 29-36.
6. Ambrose, P.J. Clinical pharmacokinetics of chloramphenicol and chloramphenicol succinate. / P.J. Ambrose Clin // Pharmacokinet., 1984. - 9(3). - Р. 222-238.
7. Кальницкая, О.И. Антибактериальные препараты и их определение в животноводческой продукции // Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции: Материалы 5-ой международной научно-практической конференции. - М. - 2004. - С. 163-165.
8. Кальницкая О.И. Оптимальные среды и режимы культивирования микроорганизмов // Научный вестник ЛГАВМ. - Львов. - 2000. - С. 112-114.
9. Мук 4.1.2158-07 Определение остаточных количеств антибиотиков тетрациклиновой группы и сульфаниламидных препаратов в продуктах животного просхождения методом иммуноферментного анализа. - 15 с.
