CC BY
45
Мониторинг генетической структуры краснодарской популяции обыкновенной злаковой тли ЭсЬ12арЬ1з дгаттит Rondani*
Е.Е. Радченко, д.б.н., Т.Л. Кузнецова, к.б.н., Н.В. Алпатьева, к.б.н., ВНИИР РАСХН
Обыкновенная злаковая тля Schizaphis graminum Rondani — один из наиболее опасных вредителей зерновых культур на юге России. Насекомое зимует на озимых и дикорастущих злаках, весной и в начале лета питается на зерновых колосовых и овсе, а в июне массово мигрирует на сорго. В 2002—2010 гг. анализировали генетическую структуру краснодарской (Кубанская опытная станция ВИР — КОС ВИР, Гулькевичский р-н) популяции тли. Выявили высокий полиморфизм насекомого по вирулентности к образцам сорго и ячменя с разными генами устойчивости, а также по RAPD маркерам — как общий, так и сезонный. Важную роль в сезонной вариации частот фенотипов вирулентности играют абиотические факторы, под воздействием которых может меняться относительная конкурентоспособность клонов тли, и, следовательно, изменение условий среды приводит к дифференциальному отбору в популяции S. graminum. Наблюдали отбор из популяции генотипов насекомых, специфически приспособленных к виду растения-хозяина. Так, на ячмене преобладали авирулентные к устойчивым образцам сорго клоны. Миграция тли с ячменя на сорго приводила к быстрому накоплению клонов, вирулентных к генам устойчивости сорго Sgr1—Sgr4 и Sgr12 [1, 2].
Материал и методы. В 2012 г. анализировали структуру краснодарской (КОС ВИР) популяции S. graminum по вирулентности к образцам сорго и ячменя. Насекомых собирали в июле и августе на посевах восприимчивого образца к-10007 СЛВ-2. В лаборатории две собранные субпопуляции клонировали (июль — 22 клона, август — 61) и оценили повреждённость образцов сорго сорта Сарваши (гены устойчивости Sgr1 + Sgr2), Shallu (Sgr3), Deer (Sgr4), Соргоградское (Sgr5), Дурра белая (Sgr5 + Sgr6), Capbam (Sgr12) [3, 4]. Всходы заселяли тлями одного клона и при гибели контроля (Низкорослое 81) определяли повреждённость по шкале от 0 до 10 (гибель растений). Полиморфизм субпопуляций оценивали по частотам фенотипов, которые идентифицировали с помощью упомянутых образцов, разделённых на две группы: Deer — Сарваши — Capbam и Shallu — Соргоградское — Дурра белая. В каждой группе в случае авирулентности клона тли образцу присваивали значение 0. В случае вирулентности (восприимчивости сорго) первому образцу присваивали значение 1, второму — 2, третьему — 4. Фенотип
* При поддержке РФФИ (грант № 12-04-00710)
вирулентности клона тли обозначали числом из двух цифр, каждая из которых являлась суммой реакций дифференциаторов. Для оценки изменчивости и сравнения субпопуляций тли пользовались критериями Животовского [5].
Изучили изменчивость 49 клонов тли, собранных в августе на сорго, по вирулентности к образцам ячменя, т.е. культуры, которая в июне уже созревает и не является хозяином фитофага в период сбора субпопуляций. Оценивали повреждённость устойчивых к ряду идентифицированных в США биотипов насекомого сортов Post, Wintermalt и Herb, а также выделенных нами образцов к-16190, к-15600 из Китая и к-28129 из КНДР [6]. Использовали такой же подход, как и при работе с сорго. Образцы распределили в две группы в следующем порядке: Post - Herb - Wintermalt и к-16190—28129—15600.
С целью изучения закономерностей отбора фитофагов по вирулентности под влиянием генотипов растений сравнили изменение частот четырёх фенотипов вирулентности фитофага (00, 51, 73, 77) в искусственных популяциях, сформировавшихся после длительного размножения тли на образцах сорго Низкорослое 81 (неустойчивый контроль), Shallu (имеет ген устойчивости Sgr3) и Дурра белая (Sgr5 + Sgr6). В краснодарской популяции частота фенотипа 73 высока, остальные встречаются намного реже. Опытные образцы выращивали в оранжерее под изоляторами до фазы кущения, заселяли одновозрастными тлями с разными фенотипами вирулентности в соотношении 1:1:1:1 и через 2 месяца рендомизированно отбирали самок. После размножения отобранных клонов оценивали устойчивость к ним упомянутых выше шести образцов-дифференциаторов. Вследствие высокой смертности тлей на образце сорго сорта Дурра белая удалось изучить лишь 6 клонов насекомого.
Кроме того, оценили изменчивость насекомого с помощью пиросеквенирования фрагментов митохондриального генома. В ходе исследования изучили нуклеотидный полиморфизм трёх фрагментов общей протяжённостью 422 пары нуклео-тидов (пн). Эти последовательности ранее были использованы F.O. Aikhionbare, Z.B. Mayo [7] для идентификации распространённых в США биотипов S. graminum B, C, E-I.
ДНК выделяли из колоний тли, собранных в 65 точках на посевах восприимчивого образца сорго СЛВ-2 по методике, предложенной на сайте molbiol (http://molbiol.ru/protocol/14_04. html) с рядом модификаций. По аналогии с праймерами, предложенными F.O. Aikhionbare,
Z.B. Mayo [7], разработали праймеры для амплификации трёх областей митохондриального генома: F GGTCCTTTTCGTAATTGAATATAACCC и R GAGTTCAAACCGGCGTAAGCCAGGT для идентификации фрагмента гена ND1, межгенного спейсера, tRNA-Leu и фрагмента 16S rRNA длиной 156 пн; F ACTTGAATCGGAATACAGCCAGT и R GGATTTTTACCACGATTTCGTTAGAT для фрагмента гена cytochrome b, tRNA-Ser и фрагмента ND1 длиной 174 пн; F GAGGGAGGAAAAGATATATTTG и R GCTTATTCATCTGTTGTTCA - для фрагмента гена ND4 длиной 92 пн. Пиросеквенирование проводили на приборе GS Junior от Roche/454 в ЦКП «Геномные технологии и клеточная биология» (ВНИИСХМ РАСХН). Выравнивание нуклеотид-ных последовательностей и их анализ проводили с помощью программы MEGA.
Результаты и обсуждение. Повреждённость образцов сорго сорта Дурра белая и Deer авирулент-ными клонами не превышала 2 баллов. Широкое варьирование характерно для сортов Сар ваши, Capbam (1-4 балла) и Соргоградское (2-4 балла); повреждённость Shallu авирулентными клонами составляла преимущественно 3 балла. Вирулентные клоны во всех случаях обусловливали повреждён-ность растений 9-10 баллов.
Частоты вирулентных к изучаемым образцам клонов тли существенно различались. Если сорго сорта Сарваши сильно повреждали 77 клонов из 83 изученных, то лишь 12 клонов были вирулентны к образцу сорта Дурра белая. Выявили 18 фенотипов вирулентности (9 - июль, 16 - август), при этом доминировал фенотип 71 (частота в июле - 0,26, в августе - 0,24). Наблюдали отчётливое снижение частот вирулентности к образцам Дурра белая (18,1% в июле и 13,1% в августе) и Deer (81,8-63,9%), а также повышение - для сорта Shallu (59,0-86,9%).
Выявили 14 фенотипов вирулентности тли, питавшейся на ячмене. Доминировал (26,5%) вирулентный к сортам селекции США фенотип 70. Наиболее высоки частоты клонов, сильно повреждающие сорта Herb (89,8%) и Wintermalt (93,9%). В большинстве случаев наблюдали слабо выражен-
ную устойчивость (7—8 баллов) против вирулентных клонов, что, очевидно, обусловливается проявлением генов со слабым фенотипическим эффектом.
Наиболее конкурентоспособным оказался клон с фенотипом вирулентности 73 (табл. 1). На образце сорта сорго Дурра белая не имеющие генов вирулентности к дифференциаторам насекомые погибли, а частота клонов, вирулентных к одному из генов устойчивости этого образца (Sgr5), оказалась выше, чем вирулентных к двум генам (фенотип 77). Очень редко встречающийся в природе фенотип 51, несмотря на вирулентность к сорту Shallu, был менее конкурентоспособен на этом образце, чем клон с фенотипом вирулентности 00.
Сравнили плодовитость на сорте пшеницы Ленинградская 97 самок с фенотипами вирулентности 77 и 73, длительно питавшихся на образцах сорго, с исходными клонами. Оказалось, что после питания на сорго плодовитость самок с фенотипом вирулентности 77 возросла в 1,5 раза (P<0,01), однако для второго фенотипа различия были несущественны. Возможность изменения неспецифической агрессивности клонов следует изучить на более обширном материале.
В ходе анализа краснодарской популяции получили 139 воспроизводимых последовательностей (табл. 2). Полиморфные сайты обнаружены во всех фрагментах, за исключением спейсера между геном ND1 и tRNA-Leu, который оказался идентичен во всех последовательностях. Преобладали (около 80%) идентичные варианты последовательностей фрагментов ND1, межгенного спейсера, tRNA-Leu, cytochrome b, tRNA-Ser. Вместе с тем обнаружено несколько последовательностей, которые отличаются от доминирующих фрагментов одной или двумя нуклеотидными заменами. Полученные данные согласуются с результатами F.O. Aikhionbare, Z.B.Mayo [7], которые характеризуют эти фрагменты как низко- и среднеполиморфные.
Наиболее полиморфным оказался фрагмент гена ND4. Обнаружено 3 типа последовательностей, обозначенных нами I, II и III (рис.), встречаемость которых составила 40, 42 и 18% соответственно.
1. Характеристика по вирулентности модельных популяций S. graminum, сформировавшихся на образцах сорго
Образец, на котором сформирована популяция Изучено клонов тли Частота фенотипа вирулентности, % Среднее число фенотипов
00 51 73 77
Низкорослое 81 34 26,5 17,6 35,3 20,6 3,93 ± 0,09
БИаИи 36 22,2 5,6 50,0 22,2 3,56 ± 0,21
Дурра белая 6 0 16,7 50,0 33,3 2,87 ± 0,25
2. Характеристика изученных фрагментов митохондриального генома S. graminum
Фрагмент Изучено фрагментов Число полиморфных сайтов
ND1, межгенный спейсер, tRNA-Leu 74 11
Cytochrome b, tRNA-Ser, ND1 23 5
ND4 42 20
Рис. - Дендрограмма степени сходства нуклеотидных последовательностей фрагмента гена N04 5. graminum. Римскими цифрами I, II и III обозначены основные митотипы
Основной вклад в дифференциацию митотипов вносит строение триплета, кодирующего 323-ю аминокислоту лейцин (Leu) в предполагаемой белковой последовательности фермента: для митотипа I — TTG, для II — CTG и для III — TTA. Кроме того, митотип III отличается от двух других строением триплета, кодирующего 299 аминокислоту Gly (GGG — для I и II митотипов и GGT — для III). Отметим, что редкие для российских популяций варианты, характерные для митотипа III, распространены в США и обнаруживаются у биотипов S. graminum B, C, E—I.
Вывод. Таким образом, выявлена высокая общая и сезонная вариабельность обыкновенной злаковой тли по вирулентности к образцам сорго и ячменя с различными генами устойчивости. Генетическая структура популяции насекомого может радикально меняться в период вегетации хозяина. Показана необходимость многократных сборов S. graminum в течение одного сезона вегетации злаков для корректного изучения структуры популяций фитофага и для идентификации генов устойчивости растений-хозяев. Установлена возможность изменения неспецифической агрессивности клонов
тли под влиянием генотипов растений. Впервые с помощью пиросеквенирования показана неоднородность краснодарской популяции S. graminum по нуклеотидным последовательностям фрагментов митохондриального генома.
Литература
1. Радченко Е.Е., Кузнецова Т.Л., Алпатьева Н.В. Динамика генетической структуры краснодарской популяции обыкновенной злаковой тли при смене растения-хозяина // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2012. Т. 16. № 2. С. 480-487.
2. Радченко Е.Е., Кузнецова Т.Л., Зубов А.А. Многолетний сезонный полиморфизм краснодарской популяции обыкновенной злаковой тли по вирулентности к образцам сорго с различными генами устойчивости // Экология. 2012. Т. 43. № 3. С. 182-187.
3. Радченко Е.Е. Идентификация генов устойчивости сорго к обыкновенной злаковой тле // Генетика. 2000. № 4. Т. 36. С. 510-519.
4. Радченко Е.Е. Наследование устойчивости образцов зернового сорго и суданской травы к обыкновенной злаковой тле // Генетика. 2006. № 1. Т. 42. С. 65-70.
5. Животовский Л.А. Показатели популяционной изменчивости по полиморфным признакам // Фенетика популяций. М.: Наука, 1982. С. 38-44.
6. Радченко Е.Е., Звейнек И.А., Тырышкин Л.Г., Коновалова Г.С. и др. Ячмень. Устойчивость образцов из Юго-Восточной Азии к вредителям и болезням // Каталог мировой коллекции ВИР. Вып. 751. СПб.: ВИР, 2004. 43 с.
7. Aikhionbare F.O., Mayo Z.B. Mitochondrial DNA sequences of greenbug (Homoptera: Aphididae) biotypes // Genetic Analysis Biomol. Engineering. 2000. V. 16. № 6. P. 199-205.
