CC BY
195НАНОСИСТЕМЫ
45
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ НАНОБИОСЕНСОР НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТА ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ
'Кашин В.В., 'Колесов В.В., 'Крупенин С.В.,
2Паршинцев А.А.,3Решетилов А.Н., 2Солдатов Е.С., 4Азев В.Н.
^Институт радиотехники и электроники им. В.А.Котельникова РАН, http://www. cplire.ru
2МГУ им. М.В. Ломоносова, физический факультет, http://www.phys.msu.ru
3Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН, http://ibpm.ru
4Филиал института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, http://wwwjbibc.psn.ru
Поступила 16.12.2013
Разработана планарная топология для наноэлектронного трансдьюсера на основе фермента глюкозооксидазы. На основе методов электронно-лучевой нанолитографии, изготовлена планарная наноструктура для наноэлектронного биосенсора. Разработан метод химической модификации поверхности двуокиси кремния эпоксисиланом и осуществлена иммобилизация фермента глюкозооксидазы на поверхности планарной наноструктуры для наноэлектронного трансдьюсера через линкерные молекулы. Разработана методика регистрации биохимических сигналов. Продемонстрировано изменение функционального состояния иммобилизованного фермента глюкозооксидазы при наличии глюкозы в тестовом растворе.
Ключевые слова: биосенсор, нанотранзистор, наноструктуры, ферментные электрохимические сенсоры, ферментная активность
УДК 544.6:57 (579.087.9+543.95):543.86____
Содержание
1. Введение (45)
2. Изготовление планарной наноструктуры для наноэлектронного трансдьюсера. Метод двухслойной маски (47)
3. Технология электромиграции (50)
4. Электронный блок для контроля процесса электромиграции (51)
5. Микроскопическое исследование электродной наноструктуры (54)
6. Исследование ферментизированных электродов (56)
7. Исследование электронных свойств наноэлектронного трансдьюсера (57)
8. Заключение (57)
Литература (57)
1. ВВЕДЕНИЕ
Одним из основных направлений развития биомедицины является биосенсорика, в том числе методы имплантации биосенсоров в живой организм и контроль состояния организма в целом [1]. Биосенсоры — это аналитические устройства, использующие биологические материалы для «узнавания» определенных молекул и выдающие информацию об их присутствии и количестве в виде электрического сигнала. Принцип анализа, реализуемый в биосенсорах, основан
на том, что биоматериал, иммобилизованный на физических датчиках, при взаимодействии с анализируемыми соединениями генерирует зависимый от концентрации сигнал, регистрируемый преобразователем. В качестве одного из наиболее распространенных модельных биокатализаторов в биосенсорном анализе используется глюкозооксидаза, которая является высокоселективным ферментом с детально изученными характеристиками [1].
Все биосенсоры содержат два основных функциональных блока: биоселективный элемент, использующий различные биологические структуры, и физический преобразователь (трансдьюсер), трансформирующий
концентрационную зависимость в электронный сигнал [2].
Следует отметить, что биосенсоры в своем большинстве гораздо более избирательны, чем обычные химические сенсоры. Используя современные достижения биотехнологии и наноэлектроники, можно разрабатывать новые оригинальные наноэлектронные приборы для биомедицинских технологий дистанционного контроля [3, 4, 5, 6, 7].
Развитие промышленности, медицины, сельского хозяйства и других отраслей
РЭНСИТ | 2013 | ТОМ 5 | НОМЕР 2
НАНОСИСТЕМЫ
46 КАШИН В.В., КОЛЕСОВ В.В., КРУПЕНИН С.В.,
ПАРШИНЦЕВ А.А., РЕШЕТИЛОВ А.Н., СОЛДАТОВ Е.С., АЗЕВ В.Н.
производства требует разработки надежных методов качественного и количественного анализа присутствия различных веществ в образцах воды, почвы, крови и других физиологических жидкостях, продуктах питания и т.д. Большинство анализов сегодня выполняется в крупных стационарных лабораториях из-за необходимости использования определенного оборудования и высококвалифицированного технического персонала. Как правило, ценность таких методов повышается, если имеется возможность выполнять анализ непосредственно на месте отбора образцов. Вследствие этого широкое применение получают биосенсоры, обладающие малыми размерами, быстротой получения результатов и надежностью. Области применения таких биосенсоров — клиническая диагностика, анализ пищи и биопроцессов, мониторинг окружающей среды [8, 9].
Биосенсорная техника характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью анализа, упрощенными методиками подготовки и измерения образцов. Биосенсоры позволяют определять широкий спектр соединений в сложных образцах (кровь, плазма, моча или пища) с минимальной предобработкой анализируемого материала. Особое значение приобретают биосенсоры, в основе которых лежит высокочувствительный и специфичный иммуноферментный анализ (ИФА) [10]. Суть его состоит в использовании ферментов в качестве метки антител или антигенов и измерении ферментативной активности как своеобразного усилителя анализируемой реакции. Высокая чувствительность ИФА, позволяющего определять до 10-11-10-12 М анализируемого вещества в исследуемой жидкости, объясняется высокой активностью ферментов. При выборе фермента учитываются такие факторы как специфичность, каталитическая активность
фермента, доступность, стабильность и т.д. Кроме того, выбор ферментной метки определяется системой регистрации активности фермента. Особый интерес вызывают
потенциометрические сенсоры. Такие сенсоры сохраняют все преимущества твердофазного ИФА, и позволяют существенно упростить и ускорить процедуру анализа [11]. Кроме того, потенциометрические сенсоры позволяют 2
осуществлять анализ в мутных средах, что проблематично, например, с помощью оптических сенсоров. Известны модели иммунобиосенсоров потенциометрического типа, основанные на рН-чувствительных транзисторах (ПТ) и светоадресуемых сенсорах, в которых применяются ферментные метки, катализирующие образование электрохимически активного продукта [12]. Ферменты, используемые в качестве меток в иммуносенсорном анализе на основе ПТ, должны обеспечивать максимальное изменение pH в ходе реакции и максимальную начальную скорость реакции, что необходимо для уменьшения времени анализа. Наиболее распространенными ферментными метками для биосенсоров являются глюкозооксидаза (ГО) и уреаза [13]. Вместе с тем известно, что окисление некоторых субстратов пероксидазы хрена (ПХ) может также приводить к генерации значительных сдвигов рН [14]. В этой связи представляется важным оценить относительную эффективность ферментных меток различных типов, включая ПХ.
В настоящее время наиболее распространены твердофазные методы иммуноферментного анализа, где антиген или антитело находится в иммобилизованном состоянии. Такие методы позволяют существенно упростить проведение анализа и уменьшить фоновый сигнал. Поэтому важным оказывается выбор носителя для иммобилизации иммунокомпоненов. Интенсивно изучаются аналитические возможности как сенсоров химического типа, так и биосенсоры, в которых основная часть анализа — распознавание — возложена на биологический материал. Для выполнения аналитической функции биосенсором биологический материал сопрягается с преобразователем, роль которого, как правило, выполняетхимический сенсор. Таким образом, эти два типа приборов оказываются тесно связанными. Наряду с теоретическими и экспериментальными исследованиями активно происходит практическое внедрение сенсорной/ биосенсорной технологии [15]. Так, биосенсоры успешно используются для мониторинга объектов окружающей среды, позволяя выполнять быструю оценку наличия вредных веществ — пестицидов, поверхностно активных соединений, опасных микроорганизмов, индекса
2 НОМЕР | ТОМ 5 | 2013 | РЭНСИТ
НАНОСИСТЕМЫ
БПК (биологического потребления кислорода, являющегося индикатором легко окисляемой органики), используются для решения вопросов о качестве пищевых продуктов и воды, применяются в сельском хозяйстве. Пока же основное их практическое применение — медицинское. Интересными и важными являются сведения о возможности использования биосенсоров для выполнения процедуры секвенирования ДНК [16] (лат. sequentum — последовательность, здесь - нуклеотидов).
Рассматривая различные варианты измерений, применяемые в биосенсорах, можно отметить, что их значительная часть основана на преобразователях электрохимического типа—т.е. связана с регистрацией таких электрохимических явлений как появление тока или его изменение при взаимодействии фермента с субстратом; изменение ионного состава среды в результате реакции, в том числе изменение рН. Эффект изменения рН в результате биохимической реакции широко используется при создании разнообразных биосенсоров — ферментного, иммунного, клеточного типов. Специально для этой цели разрабатываются ион-селективные электроды. Подклассом ион-селективных являются рН-чувствительные [17].
Одними из самых распространенных биосенсоров являются амперометрические биосенсоры на основе иммобилизированных оксидаз. Класс ферментов оксидаз является высокоспецифичным по отношению к определяемым субстратам - сахару (глюкозе), спиртам (этиловый спирт) и др. [18]. При наличии в диагностируемой биологической жидкости глюкозы активный центр белка глюкозооксидазы окисляет глюкозу и передает два электрона кислороду до образования перекиси водорода: глюкоза + Н2О + О2 = глюконовая кислота + Н2О2.
2. ИЗГОТОВЛЕНИЕ ПЛАНАРНОЙ НАНОСТРУКТУРЫ ДЛЯ НАНОЭЛЕКТРОННОГО ТРАНСДЬЮСЕРА. МЕТОД ДВУХСЛОЙНОЙ МАСКИ
Для создания планарной наноструктуры наноэлектронного трансдьюсера использовалась технология подвешенной жесткой маски на основе германия [19]. Данная технология подразумевает создание многослойной структуры из полимеров, содержащей одним из слоев пленку германия в несколько десятков
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ НАНОБИОСЕНСОР 47
НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТА ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ
нанометров. Последовательное применение методов стандартной литографии, различных фоторезистов и реактивно ионного травления [20, 21] дает значительное (до 300 нм) нависание слоя германия над подложкой, позволяющее применять напыление толстых слоев металла. Обеспечиваемая слоем германия жесткость такой структуры является избыточной для целей изготовления простых планарных структур, что в принципе позволяет отказаться от использования слоя германия при изготовлении маски. Такой подход позволяет существенно сократить маршрут изготовления, повысив, тем самым, итоговую надежность и технологичность.
Двухслойная технология состоит из нескольких этапов: подготовка подложки
(нанесение оксида кремния на кремниевую подложку), последовательное нанесение слоев сополимера и полимера, засветку ультрафиолетовыми (УФ) лучами, засветку электронным лучом, проявление в смеси толуола и спирта, напыление хрома и золота, растворение маски в ацетоне.
А) Подготовка подложки.
Стандарная кремниевая пластина диаметром 76 мм последовательно промывалась в ацетоне, спирте и 2 минуты в 10% растворе HCl. Затем в напылительной установке Leybold Z-400 методом магнетронно-ионного распыления на подложку наносился оксид кремния толщиной 400 нм. Напыление проводилось в атмосфере смеси Лг и O2 при давлении: 1.210-2 мбар и 310-3 мбар соответственно. Скорость напыления составляла 2 А/с. В дальнейшем подложка разрезалась алмазным резцом на чипы размером 9х9 мм. Таким образом, на каждом чипе формировался диэлектрический слой.
Б) Нанесение двойной полимрной маски
На каждый чип наносился слой сополимера производства MicroChem марки EL11. Нанесение производилось методом центрифугирования при скорости 4000 об/мин за 60 секунд. После чего нанесенный сополимер запекался на керамической плитке (Dataplate 721-2) при температуре 160°С в течение 10 минут. После этого нанесенный слой для повышения чувствительности облучался УФ излучением длиной волны 310 нм при интенсивности 25-27 мВт/см в течение 5 секунд.
РЭНСИТ | 2013 | ТОМ 5 | НОМЕР 2
НАНОСИСТЕМЫ
48 КАШИН В.В., КОЛЕСОВ В.В., КРУПЕНИН С.В.,
ПАРШИНЦЕВ А.А., РЕШЕТИЛОВ А.Н., СОЛДАТОВ Е.С., АЗЕВ В.Н.
Рис. 1. Двухслойная полимерная структура: на оксидированной кремниевой подложке 500 нм сополимера
EL11 и 50 нм полимера 950С.
Далее следовало нанесение верхнего слоя полимера производства MicroChem марки 950С . Нанесение производилось также методом центрифугирования при скорости 5000 об/мин за 60 сек. Запекание верхнего слоя полимера проводилось при температуре 180°С в течение 30 мин.
Таким образом, на чипе формировалась двухслойная полимерная пленка (рис. 1).
В) УФ засветка и проявление
После суточной выдержки образца, необходимой для релаксации механических напряжений в нанесенной маске, производилось формирование периферийной инфраструктуры подводящих электродов с характерными размерами деталей < 10 мкм, при этом центральная часть чипа размером 80х80 мкм при этом оставалась незасвеченной. Под УФ лампой при интенсивности излучения 25-27 мВт/см2 через кварцевый фотошаблон в течение 2 минут засвечивался необходимый рисунок (рис. 2).
Рис. 2. Кварцевый фотошаблон, формирующий маску для подводящих электродов при УФ засветке с длиной волны 310 нм и интенсивностью 25-27 мВт/см2 в течение 2 мин.
Рис. 3. Шаблон маски для засветки электронным лучом субмикронной части образца, формирующий структуру наноэлектродов шириной вплоть до 100 нм.
После этого чип помещался на 1 мин. 45 сек. в раствор толуола и спирта в отношении 1:10, находящийся при температуре 20°С. Это приводило к тому, что проэкспониованный полимер вымывался с чипа.
Г) Засветка электронным пучком и проявление
Область размером 80х80 микрон в центре чипа служила для формирования наноструктуры (характерные размеры деталей < 1 мкм), которая является прообразом наноэлектронного трансдьюсера. Засветка этой области проводилась электронным лучом в растровом электронном микроскопе Cambridge Instruments Stereoscan-200.
Ток луча при засветке составлял 16 пА, ускоряющее напряжение 30 кВ, диаметр луча примерно 8 нм. Управляющая программа обеспечивала засветку требуемых областей согласно заложенному в нее шаблону, содержащему узкие (до 100 нм) полоски длиной несколько микрон (рис. 3).
Рис. 4. Двухслойная маска, обеспечивающая необходимую структуру наноэлектродов и имеющая незначительный подтрав нижнего слоя сополимера.
2 НОМЕР | ТОМ 5 | 2013 | РЭНСИТ
НАНОСИСТЕМЫ
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ НАНОБИОСЕНСОР 49 НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТА ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ
Рис. 5. Слева - напыленные пленки металла (Cr и Ли). Справа - сформированные после растворения полимерной маски в
ацетоне электроды на поверхности чипа.
После засветки чипы повторно проявлялись в растворе толуола и спирта в отношении 1:10, находящемся при температуре 20°С. При этом в маске окончательно формировалась структура будущих наноэлектродов (рис. 4).
Сополимер, подсвеченный УФ
излучением и обладающий поэтому большей чувствительностью, проявлялся в растворителе чуть быстрее верхнего слоя полимера, что обеспечивало небольшое нависание одного полимера над другим. Это в дальнейшем существенно улучшало надежность удаления маски после напыления металла.
Д) Напыление золота, растворение маски При помощи установки L-560 производилось напыление металлов на проявленные чипы. Сначала для лучшей адгезии золота при помощи электронного луча напылялась двухнанометровая пленка Cr, после чего термическим способом наносился слой золота толщиной 15 нм. Напыление происходило при давлении 4-10-7 мбар при скорости 1 А/с.
После напыления чипы сразу помещались в ацетон, нагретый до 60°С. В течение 45 мин. происходило окончательное растворение остатков полимерной маски, при котором лишний металл, лежащий на резистивной маске, удалялся с чипа (рис. 5).
Таким образом создаются заготовки электродов молекулярного транзистора для обработки методом электромиграции. Заготовки представляют собой узкий тонкопленочный золотой мостик, соединенный с подводящими электродами. Изготовленный по описанной выше технологии образец приведен на рис. 6.
На снимке в растровом электронном микроскопе (РЭМ) видна субмикронная область в центре образца, в которой сформированы тонкопленочные электроды из пленки золота 15 нм с подслоем титана 2 нм. Помимо крупных (2 мкм шириной и 10-20 мкм длиной) в центре созданы два ряда тонких мостиков (3 мкм длиной и 180 нм шириной). Рисунок обладает хорошей четкостью, края электродов отчетливо видны,
Рис. 6. Су6микронная частъ °бразца: видна структура Рис. 7. Узкий (180 нм) тонкопленочный (15 нм Ли) тонкопленочных электродов (15 нм Ли толщиной) с двумя мостик, сформированный в центре чипа, с измеренным рядами узких (менее 200 нм) мостиков. сопротивлением 470 Ом.
РЭНСИТ | 2013 | ТОМ 5 | НОМЕР 2
НАНОСИСТЕМЫ
50 КАШИН В.В., КОЛЕСОВ В.В., КРУПЕНИН С.В.,
ПАРШИНЦЕВ А.А., РЕШЕТИЛОВ А.Н., СОЛДАТОВ Е.С., АЗЕВ В.Н.
что свидетельствует о нормальном протекании процесса растворения маски и удалении лишнего металла. Такое качество достигается именно за счет созданного нависания верхнего слоя фоторезиста в полимерной маске. Увеличенная фотография единичного мостика приведена на рис. 7.
Характерные значения сопротивления получившихся мостиков лежат в диапазоне 300-500 Ом, что является обычным для таких тонких (< 20 нм) пленочных структур подобной геометрии (180 нм х 2 мкм). Разброс сопротивления обусловлен различной длиной подводящих пленочных электродов.
Электроды для молекулярного транзистора могутбыть полученыс помощьюлитографических методов [22], а также путем разрезания золотой пленки с получением в ней зазора нанометрового масштаба [23]. Для разрыва тонкопленочного нанопровода может быть эффективно использована технология электромиграции. Эта техника требует возможности задания тока высокой плотности через золотой нанопровод, а также системы контроля его параметров в режиме реального времени [24].
Таким образом, в результате разработки методики изготовления тонкопленочных заготовокдля проведенияпроцессаформирования нанозазора технологией электромиграции были подобраны технологические параметры создания двойной полимерной маски, обеспечивающие необходимые свойства заготовок и, прежде всего, малую ширину (менее 200 нм) тонкопленочных мостиков и достаточное нависание (30-50 нм) верхнего слоя фоторезиста для эффективного удаления лишнего металла с чипа на заключительной стадии его изготовления.
А) Для нижнего сополимера EL11: скорость нанесения - 4000 об/мин, время нанесения - 60 сек., температура полимеризации - 160°С, время полимеризации - 10 мин., интенсивность УФ подсветки 25-27 мВт/см2, время подсветки 5 сек.
Б) Для верхнего полимера 950С.: скорость нанесения - 5000 об/мин, время нанесения - 60 сек., температура полимеризации - 180°С, время полимеризации - 30 мин.
Разработанная технология с применением двухслойной полимерной маски позволяет существенно сократить время изготовления тонкопленочных мостиков для последующего
проведения процесса электромиграции, а также обеспечивает хорошую воспроизводимость чипов за счет отказа от сложной технологической процедуры в виде реактивно-ионного травления.
3. ТЕХНОЛОГИЯ ЭЛЕКТРОМИГРАЦИИ
Для надежности и удобства всестороннего исследования экспериментальных чипов был разработан измерительный стенд на основе модульности измерительной системы. Модульность заключается в закреплении чипа на автономной плате из текстолита (чипхолдер), позволяющей производить все подключения, а также исследования структурных характеристик (анализ строения и размеров наноэлектродов и зазоров) в РЭМ и других устройствах без повторного размещения и подключения чипа на плате.
Соединение чипа с чипхолдером осуществлялось тонкими алюминиевыми проводами с помощью ультразвуковой сварки. Для ультразвуковой сварки использовалась аппаратура фирмы WestBond. Процесс приваривания заключался в подведении иглы с тонким (6 мкм) алюминиевым проводом к поверхности металлического электрода и прикладывании мощного ультразвукового импульса. При этом нить расплющивалась и сваривалась с поверхностью электрода. Для тонких золотых пленок оптимальным временем воздействия импульса является 30 мс, а прикладываемая мощность должна находиться в диапазоне от 0.6 до 1.2 Вт. Для фиксации чипхолдера было спроектировано и изготовлено специальное устройство. Внешний вид блока фиксации измеряемого чипа показан на рис. 8.
Созданное устройство позволяет закреплять чипы на специальной текстолитовой плате
Рис. 8. Блок фиксации платы с исследуемым чипом.
2 НОМЕР | ТОМ 5 | 2013 | РЭНСИТ
НАНОСИСТЕМЫ
при помощи разваривания ультразвуком тонкой (6 мкм) алюминиевой проволоки. Это обеспечивает постоянный надежный контакт чипа с измерительной системой, а также дает возможность многократно подключать плату с чипом к установке без перемонтажа чипа на чипхолдере. Последнее, в свою очередь, позволяет осуществлять разносторонние эксперименты: как дополнительные технологические операции, так и исследования структуры образцов в РЭМ, АСМ и т.п. Кроме этого в установке реализована возможность использовать чипы различных размеров 11х11, 10х10, 9х9, 3х3 мм и калибровать систему с помощью плат с известными характеристиками.
Путем помещения всей системы в герметизированный корпус в виде тонкостенной (0.1 мм) трубки из нержавеющей стали диаметром 22 мм и длиной 1.5 метра реализована возможность проводить все операции в вакууме и при низкой (до 4.2 К) температуре для углубленного анализа и исследования образцов.
4. ЭЛЕКТРОННЫЙ БЛОК ДЛЯ КОНТРОЛЯ ПРОЦЕССА ЭЛЕКТРОМИГРАЦИИ
Метод проведения разрыва тонкопленочной заготовки при помощи электромиграции подразумевает возможность подачи на микросхему исследуемого чипа различного напряжения, а также регистрации отклика системы в реальном времени. Блок-схема измерительной установки приведена на рис. 9.
При проведении процесса разрыва тонкопленочного мостика методом
электромиграции очень важно учитывать характерные значения скорости нагрева места разрыва (непосредственно области разрыва и возможно примыкающих к ней участков электродов), поскольку для обеспечения контролируемости процесса разрыва
Рис. 9. Блок-схема измерительной системы для проведения исследования образца.
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ НАНОБИОСЕНСОР 51
НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТА ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ
необходимо обеспечить малость характерного времени срабатывания системы обратной связи по сравнению с лавинообразно уменьшающимся временем миграции атомов металла при сильном повышении температуры.
Локальный нагрев можно разумно
минимизировать путем применения способов более активного отвода тепла: во-первых,
использовать хорошо теплопроводящую
подложку; во-вторых, резко увеличить толщину подводящих электродов на краях выбранного участка электромиграции [25].
Крайне важным также является своевременное снятие внешнего воздействия с тонкопленочной заготовки, поскольку процесс электромиграции на заключительных стадиях происходит лавинообразно [26].
Можноввести двавременных технологических параметра для электронной схемы, управляющей процессом разрыва тонкопленочной перемычки: период опроса состояния системы (время между двумя последовательными измерениями напряжения, снимаемого с образца) и задержка срабатывания обратной связи (время, прошедшее между моментом превышения образцом заданных критических характеристик до начала снятия внешнего воздействия с системы в целом).
Характерным временем, в течение которого происходит существенная перестройка структуры золотой пленки при проведении электромиграции, является время порядка нескольких десятков миллисекунд (10—50 мс) [27].
Это означает, что электронная система должна иметь времена срабатывания значительно меньше 1 мс для лучшего контроля над перестройкой золотой пленки.
Для проверки возможности создания измерительной системы с заданными скоростями опроса был изготовлен макет на базе микроконтроллера фирмы Atmel. В качестве микросхем были выбраны: микросхема управления Atmel Atmega3250, аналогоцифровой преобразователь 16 бит Analog Devices AD7686, а также набор аналоговых ключей (Analog Devices AD714) и мультиплексоров (Analog Devices ADG658) с низкими токами утечки (до 100 пА). Рисунок топологии печатной платы выполнялся в программе SprintLayout версии 5.0 с учетом технических
РЭНСИТ | 2013 | ТОМ 5 | НОМЕР 2
52
КАШИН В.В., КОЛЕСОВ В.В., КРУПЕНИН С.В.,
ПАРШИНЦЕВ А.А., РЕШЕТИЛОВ А.Н., СОЛДАТОВ Е.С., АЗЕВ В.Н.
НАНОСИСТЕМЫ
Рис. 10. Измерительная плата для проведения процесса электромиграции тонкопленочных мостиков (размер платы
8 х 13 см).
условий изготовления ТУ 235454-011-5122270705 (минимальная ширина дорожки — 0.15 мм, минимальный диаметр отверстия —0.4 мм и т.д.). Плата была изготовлена по полученной топологии, после распайки всех элементов плата имеет вид, приведенный на рис. 10.
Разработанная плата отвечает заложенным скоростным характеристикам (период считывания и время реакции 15 и 20 мкс соответственно).
Для обеспечения работы установки была написана управляющая программа, состоящая из двух частей. Первая часть, загружаемая в микроконтроллер, написана на языке Си (компилятор Codevision CAVR 1.24.8). Вторая часть управляющей программы, ввиду особенностей работы с шиной PCI в ОС MS Windows, не позволяющих получить заданное время обратной связи (20 мкс), написана на NI Labview под РТОС Pharlab с использованием модуля реального времени. В программе реализован простейший способ воздействия на систему путем подачи на тонкопленочный мостик линейно растущего напряжения. Напряжение увеличивается со скоростью 1.2 мВ за 10 мс, при этом на каждом шаге по задаваемому напряжению проводится 1000 измерений выходного значения напряжения и определение сопротивления исследуемой перемычки. Критерием остановки служит превышение измеренного сопротивления изначально заданного значения.
Созданная установка позволяет проводить определение параметров электромигрируемого мостика с периодом 10 мкс, причем время реакции по заданному критерию составляет всего 20 мкс. Реализованные в аппаратуре
Рис.
Ro Rx
11. Принципиальная электрическая схема для проведения электромиграции.
параметры позволяют наблюдать за протеканием процесса электромиграции золота. Кроме того, система обладает возможностью по заданной программе управлять коммутацией 16 различных тонкопленочных заготовок, расположенных на чипе, что позволяет отказаться от ручного переключения механических тумблеров в процессе работы с образцом (при выборе исследуемого мостика, используемого в схеме сопротивления и снятии вольт-амперной характеристики).
Принципиальная электрическая схема для проведения электромиграции представлена на рис. 11.
Последовательно с исследуемым мостиком включается известное сопротивление, на схему подается напряжение, и измеряется напряжение на мостике. В схеме реализуется делитель напряжения, где выходное напряжение линейно связано с входным.
Убъгх -
При этом любые изменения сопротивления мостика нарушают линейность и позволяют, тем самым, контролировать процесс, изменяя внешнее воздействие.
В модельном эксперименте с целью определения скоростных характеристик системы вместо тонкопленочного мостика применялся резистор с известным сопротивлением, соединенный последовательно с ключом, позволяющим разомкнуть электрическую цепь (рис. 12).
Рис. 12. Принципиальная электрическая схема модельного эксперимента для определения скоростных характеристик электронного блока установки.
2 НОМЕР | ТОМ 5 | 2013 | РЭНСИТ
НАНОСИСТЕМЫ
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ НАНОБИОСЕНСОР 53 НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТА ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ
1 500!?/ r -7.14 g 5.00^/ Stop \ 1 100™
20 VIKC
/— V
I */ \
1 V . > V 1
г k. 4 У
\
1 s V 2
4 J
Print to nz disk fie: J {ЩЦ
Рис. 13. Временная диаграмма, демонстрирующая время срабатывания обратной связи с момента превышения заданного критерия до начала снятия со схемы внешнего напряжения.
Прибором, визуализирующим данный процесс, был цифровой осциллограф Agilent модель 54621A (200 Мс/c, 60 Мгц).
На рис. 13 представлены записанные диаграммы подаваемого на схему напряжения (2) и напряжения, снятого с участка R0—kato4 (1). Входное напряжение (2) линейно увеличивается со скоростью 1.2 мВ/10 мс. В произвольный момент (точка А) ключ механически был разомкнут, при этом снимаемое выходное напряжение становилось равным входному. Программа, отслеживающая состояние схемы, непрерывно ее опрашивает и регистрирует значение напряжения на участке R0—ключ. При превышении сопротивления (R = V *^/^ — VJ) данного участка цепи изначально заданного значения внешнее напряжение отключается. На снимке видно, что время между изменением самого сопротивления (точка А) и началом снятия напряжения (точка Б) составляет менее 20 мкс.
Такая скорость реакции позволяет точно контролировать изменение структуры золотого тонкопленочного мостика в процессе электромиграции. В частности, на рис 9 показан тонкопленочный мостик, который изготовлен по описанной выше технологии. Мостик представляет собой тонкую (15 нм) пленку золота с 2 нм подслоем титана шириной 180 нм и длиной 3 мкм. Чип был приварен 6 мкм алюминиевыми проводами к медным дорожкам на чипхолдере и подключен в измерительную установку.
Снятая вольтамперная характеристика является линейной и демонстрирует сопротивление 470 Ом. Затем на этом образце был реализован процесс электромиграции со следующими параметрами:
1) режим увеличения напряжения—линейный;
2) скорость роста напряжения - 1.2 мВ/10 мс;
3) исходное сопротивление исследуемого мостика — 470 Ом;
4) скорость опроса состояния системы 10 мкс.
В ходе этого процесса удалось реализовать
достаточно медленное, поэтапное изменение сопротивления тонкопленочной перемычки. Процесс электромиграции несколько раз по заданному значению сопротивления останавливался и снималась промежуточная вольт-амперная характеристика образца. Таким образом проводилось отслеживание протекавшего процесса миграции атомов из наметившейся щели в пленке. На приведенном рис. 14 показан результат этого процесса, когда образец практически потерял электрическую проводимость через тонкий мостик.
Рис. 14. Слева - РЭМ снимок тонкопленочного мостика после проведения процесса электромиграции, демонстрирующий явное, значительное изменение структуры тонкой пленки. В центре - РЭМ снимок образовавшегося в этой пленке зазора
размером ~30 нм. Справа - ВАХ, соответствующая данному зазору.
РЭНСИТ | 2013 | ТОМ 5 | НОМЕР 2
НАНОСИСТЕМЫ
54 КАШИН В.В., КОЛЕСОВ В.В., КРУПЕНИН С.В.,
ПАРТТТИНТТЕВ А.А., РЕШЕТИЛОВ А.Н., СОЛДАТОВ Е.С., АЗЕВ В.Н.
Рис. 15. АСМ-изображение наноэлектродной структуры трансдьюсера.
Электрический блок созданной установки имеет необходимые скоростные показатели для обеспечения контролируемого разрыва тонкопленочного мостика в реальном времени. Значения основных показателей выбраны в результате анализа теоретических и экспериментальных данных о кинетике атомов металла в процессе электромиграции и установлены на уровне: период измерения 10 мкс, время срабатывания обратной связи 20 мкс. Это существенно меньше характерных времен протекания процессов в тонкой пленке и обеспечивает достаточно детальное слежение за этими процессами, что в конечном итоге позволяет вовремя прекращать процесс электромиграции и достигать, в принципе, предельно малых зазоров атомарного масштаба (~1 нм).
На рисунке хорошо видно, что электрод деформирован, что является результатом перемещения материала электрода и
Heh/ln
Рис. 16. АСМ-изображение отдельного наноэлектрода с рабочим нанозазором.
его реструктуризации, как следствие -образование локальных сужений, именно за счет образования которых и увеличивалось сопротивление мостика. В конце концов, этот процесс завершился разрывом нанопровода и образованием нанозазора (~30 нм). ВАХ в этом случае выглядит, как показано на рисунке справа, что соответствует разрыву.
5. МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОДНОЙ НАНОСТРУКТУРЫ
Сформированная топологическая структура исследовалась методами атомно-силовой микроскопии. На рис. 15-16 показано АСМ-изображение наноэлектродной
структуры трансдьюсера с системой рабочих нанозазоров после модификации поверхности ферментом глюкозаоксидазы.
С помощью режима фазового контраста (Phase Imaging), основанного на базе методов
Рис. 17. Топографическое (слева) и фазовое (справа) АСМ-изображения отдельного рабочего нанозазора с нанесенным
молекулярным слоем фермента.
2 НОМЕР | ТОМ 5 | 2013 | РЭНСИТ
НАНОСИСТЕМЫ
Рис. 18. СТМ изображение молекул глюкозооксидазы. бесконтактной атомно-силовой микроскопии, исследованы области нанозазоров. Метод фазового контраста позволяет с высоким пространственным разрешением исследовать неоднородность различных свойств на поверхности материалов. В частности, мода фазового контраста позволяет различить области, отличающиеся по химическому составу, адгезионным и упругим свойствам. Принцип действия основан на детектировании разности фаз между механическими колебаниями зонда вблизи поверхности образца и электрическим сигналом, возбуждающим эти колебания с помощью пьезопривода.
На изображениях фазового контраста на поверхности золотых наноэлектродов видны отдельные «мягкие» агрегированные объекты, упругие свойства которых отличны от остальной поверхности. Видно, что часть агрегатов зафиксированы в области нанозазора и, по-видимому, включены в электрическую цепь трансдьюсера (рис. 17).
Рис. 20. Конструкция измерительного стенда с макетом наноэлектронноготрансдьюсера.Сверху-выносной измерительный блок с входными электрометрическими усилителями, внизу -ЦАП/АЦП с питающими аккумуляторами
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ НАНОБИОСЕНСОР 55 НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТА ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ
Рис. 19. АСМ изображение зазора между золотыми наноэлектродами, покрытыми молекулярным слоем фермента
Размер молекулы глюкозооксидазы составляет около 7 нм, что позволяет использовать этот белок в полученных нанозазорах для минимизации биосенсоров [28]. На рис. 18 представлено СТМ изображение нескольких отдельных молекул глюкозооксидазы, лежащих на свежесколотой поверхности подложки из пиролитического графита.
АСМ изображение зазора между золотыми наноэлектродами, покрытыми молекулярным слоем фермента, показано на рис. 19.
Измерительный стенд
Для исследования электронных свойств макета трансдьюсера был разработан и создан компьютеризированный измерительный
стенд. Для снижения электрических помех в измерительном стенде использованы автономные аккумуляторные источники питания. Внешний вид созданного измерительного стенда показан на рис. 20.
Исследуемый макет наноэлектронного трансдьюсера (рис. 21) представлял собой планарную наноструктуру из 18 отдельных рабочих нанозазоров, сформированных на кремниевом чипе размером 9х9 мм с помощью методов электронной литографии и
Рис. 21. Макет наноэлектронного трансдьюсера: кремниевый чип с наноэлектронной структурой, смонтированный на чипхолдере.
РЭНСИТ | 2013 | ТОМ 5 | НОМЕР 2
НАНОСИСТЕМЫ
56 КАШИН В.В., КОЛЕСОВ В.В., КРУПЕНИН С.В.,
ПАРШИНЦЕВ А.А., РЕШЕТИЛОВ А.Н., СОЛДАТОВ Е.С., АЗЕВ В.Н.
электромиграции. Чип крепился на чипхолдере и с помощью технологии ультразвуковой сварки алюминиевым проводом диаметром 25 мкм электрически подключался к измерительным контактам [21].
6. ИССЛЕДОВАНИЕ
ФЕРМЕНТИЗИРОВАННЫХ ЭЛЕКТРОДОВ
Разработке макета наноэлектронного трансдьюсера на основе планарной наноструктуры со встроенными молекулами ферментов предшествовали
эксперименты с использованием макроразмерных преобразователей электрохимического типа. Исследовалось сопряжение электродов с ферментом глюкозооксидазой, который наносили в виде раствора, а также иммобилизовали с использованием глутарового альдегида. Фермент наносился в микроколичествах.
Исследование активности глюкозооксидазы на золотых подложках
Для измерений использовался гальваностат-потенциостат IPCmicm (ООО «Кронас», Россия), соединенный с персональным компьютером. Измерения проводились на поверхности электродов при комнатной температуре. В качестве электрода сравнения использовался электрод Ag/AgCl. Измерения проводились при -700 мВ в микрообъеме 20 мкл. Использовались ГО (EC 1.1.3.4, выделена из Aspergillus niger, активность 185000 ед/г, Sigma-Aldrich Co. Растворы глюкозы на поверхность электрода наносились в различной концентрации. В качестве базового раствора использовали 50 мМ калий-фосфатный буфер рН 6.3, содержащий 0.1 М хлорид калия. Регистрируемым параметром являлась как амплитуда сигнала (нА), так и максимальная скорость изменения сигнала (нА/с).
Иммобилизацию ГО осуществляли на поверхности электрода кросс-сшивкой глутаровым альдегидом в соответствии с методикой, описанной [29].
На золотые электроды наносили 2 мкл смеси следующего состава: 10 мкл 10%-го раствора ГО в 30 мМ калий-фосфатном буфере (рН 6), 10 мкл 17%-го раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в вышеуказанном буфере и 10 мкл 10%-го водного раствора глутарового альдегида. Затем электрод подсушивали при комнатной температуре в течение 10 мин.
раствора глюкозы.
На электродах, полученных нанесением золота на подложку из слюды, измерения проводились в микрообъеме 20 мкл при внесении раствора ГО в концентрации 0.01мг/мл и растворов глюкозы в концентрации 2.5 и 25 мМ. Вид отклика электрода на глюкозу представлен на рис. 22. При проведении повторных измерений амплитуда сигналов электрода снижалась, что, по-видимому, связано с отслоением золотого покрытия с поверхности подложки.
Калибровочная кривая для электрода с иммобилизованной ГО представлена на рис. 23. ГО иммобилизовали кросс-сшивкой глутаровым альдегидом. Нижний предел детекции составлял 10 мМ. Чувствительность в области линейного диапазона составляла 0.42 нА/мМ.
Таким образом, при проведении измерений на электродах, полученных напылением золота на различные подложки, было зарегистрировано
полученного нанесением золота на подложку из графита, для иммобилизованной ГО.
2 НОМЕР | ТОМ 5 | 2013 | РЭНСИТ
НАНОСИСТЕМЫ
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ НАНОБИОСЕНСОР 57 НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТА ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ
. образец без ГО вода глюкоза 10 м М А
/
-250 -200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200 250
мВ
Рис. 24. Контрольный образец. Реакция на глюкозоксидазу отсутствует.
уменьшение тока при внесении раствора глюкозы, что соответствует аналогичному уменьшению тока на платиновом электроде (электрод типа Кларка). Получена калибровочная зависимость для золотого электрода на подложке из графита. Нижний предел детекции составлял 10 мМ. Чувствительность в области линейного диапазона 0.42 нА/с. Данные эксперименты явились подготовительными для исследования переноса заряда в наноструктурах.
7. ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЛЕКТРОННЫХ СВОЙСТВ НАНОЭЛЕКТРОННОГО ТРАНСДЬЮСЕРА
Электронные свойства наноэлектронного трансдьюсера исследовались в буферном растворе в отсутствие и при добавлении глюкозоксидазы. Показано, что на контрольном образце реакция на глюкозоксидазу отсутствует (рис. 24), а на наноэлектронной структуре, модифицированной ферментом, присутствует электронный отклик датчика на 10 мМ раствор глюкозы (рис. 25).
Присутствует электронный отклик датчика на 10 мМ раствор глюкозы.
Рис. 26. ВАХ для разных концентраций глюкозы в
Получена экспериментальная зависимость тока в нанозазоре с иммобилизированным ферментом - глюкозооксидазой от концентрации глюкозы в тестовом водном растворе. На рис. 26 показан график ВАХ для разных концентраций глюкозы. Измерения проводились в диапазоне концентраций глюкозы в организме человека 1- 6 мМ.
8. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Разработана технология создания макета наноэлектронного биосенсора на основе планарной наноструктуры со встроенными ферментными комплексами. Разработана методика нанесения и иммобилизации молекул фермента на электродах наноструктуры. Разработана методика регистрации
биохимических сигналов. Продемонстрировано изменение функционального состояния иммобилизованного фермента глюкозооксидазы при наличии (окислении) глюкозы в тестовом растворе в зависимости от ее концентрации.
ЛИТЕРАТУРА
1. Reshetilov AN, Reshetilova TA. Nanosensors and their applications. In: Metal nanoparticles in microbiology. Berlin, Springer Verlag, 2011, p. 269-283.
2. Asefa T, Duncan CT, Sharma KK. Recent advances in nanostructured chemosensors and biosensors. Anatyst, 2009, 134(10):1980-1990.
3. Soldatov ES, Khanin VV, Trifonov AS, Gubin SP, Kolesov VV, Presnov DE, Iakovenko SA, Khomutov GB, Korotkov AN. Room temperature molecular single-electron transistor. Physics Uspekhi, 1998, 41(2):202-202.
РЭНСИТ | 2013 | ТОМ 5 | НОМЕР 2
НАНОСИСТЕМЫ
58 КАШИН В.В., КОЛЕСОВ В.В., КРУПЕНИН С.В.,
ПАРШИНЦЕВ А.А., РЕШЕТИЛОВ А.Н., СОЛДАТОВ Е.С., АЗЕВ В.Н.
4. Gubin SP, Gulayev YuV, Khomutov GB, Kislov VV, Kolesov VV, Soldatov ES, Sulaimankulov KS, Trifonov AS. Molecular clusters as building blocks for nanoelectronics: the first demonstration of cluster SET transistor at room temperature. Nanotechnology, 2002, 13:185-194.
5. Soldatov ES, Gubin SP, Maximov IA, Khomutov GB, Kolesov VV, Sergeyev-Cherenkov AN, Shorokhov VV, Sulaimankulov KS, Suyatin DB. Molecular cluster based nanoelectronics. Microelectronic Engineering, 2003, 69:536-548.
6. Gubin SP, Gulyaev YuV, Khomutov GB, Kislov VV, Kolesov VV, Maximov IA, Samuelson L, Soldatov ES, Taranov IV. Electronics of molecular nanoclusters. Intern. J. of Nanoscience, 2004, 3(1-2):137-147.
7. Колесов ВВ, Сапков ИВ, Солдатов
ЕС. Молекулярный одноэлектронный транзистор на основе планарной наноструктуры. Труды 20-й Межд. Крымской конф. “Микроволновые и телекоммуникационные технологии” (КрыМиКо’2010), 13-17 сент.
2010, Севастополь, Крым, Украина, с. 857-858.
8. Scognamiglio V, Pezzotti G, Pezzotti I, Cano J, Buonasera K, Giannini D, Giardi MT. Biosensors for effective environmental and agrifood protection and commercialization: from research to market. Microchimica Acta, 2010, 170:215-225.
9. Reshetilov AN, Kitova AE, Arkhipova AV. Determination of ethanol in acetic acid-containing samples by a biosensor based on immobilized Gluconobacter cells. Nusantara Bioscience, MBI & UNS Solo, 2012, 3:97-100.
10. Pantelopoulos A, Bourbakis NG. A survey on wearable sensor-based systems for health monitoring and prognosis. IEEE Transactions on Systems, Man and Cybernetics, Part C: Applications and Reviews, 2009, 40(1):1-12.
11. Reddy RRK, Chadha A, Bhattacharya E. Porous silicon based potentiometric triglyceride biosensor. Biosensors and Bioelectronics, 2001, 16(4-5):313-317.
12. Adami M, Sartore M, Baldini E, Rossi A, Nicolini C. New measuring principle for LAPS
devices. Sensors and Actuators B: Chemical, 1992, 9(1):25-31.
13. Pan T, Huang M-D, Lin W-Y, Wu M-H. A urea biosensor based on pH-sensitive Sm2TiO5 electrolyte—insulator—semiconductor. Analytica Chimica Acta, 2010, 669:68—74.
14. http://www.newchemistry.ru/printletter.php.
15. Bergveld P. Thirty years of ISFETOLOGY. What happened in the past 30 years and what may happen in the next 30 years. Sensors and Actuators B: Chemicall, 2003, 88:1-20.
16. Pourmand M, Karhanek M, Persson HHJ, Webb CD, Lee TH, Zahradrnkova A, DavisRW Direct electrical detection of DNA synthesis. Proc. of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103(17):6466-6470.
17. Wu M, Lin T-W, Huang M-D, Wang H-Y, Pan T-M. Label-free detection of serum uric acid using novel high-k Sm TiO membrane-based electrolyte—insulator—semiconductor. Sensors and Actuators B, 2010, 146:342—348.
18. De Benedetto GE, Palmisano F, Zambonin PG. One-step fabrication of a bienzyme glucose sensor based on glucose oxidase and peroxidase immobilized onto a poly(pyrrole) modified glassy carbon electrode. Biosensors and Bioelectronics, 1996, 11(10):1001-1008.
19. Krupenin VA, Lotkhov SV, Vishenski SV. Photo and electron-beam lithography sharing common stencil. J.Vac. Sci. Technol, 1993, B11(6):2132.
20. Steinmann P, Weaver JMR. Fabrication of sub-
5 nm gaps between metallic electrodes using conventionsl lithographic techniques. Vac.
Sci&TechnolB, 2004, 22:3178.
21. Толливер Д, Новицки Р, Хесс Д и др. Плазменная технология в производстве СБИС, п/ред.Айнспрук Н, Браун Д. М., Мир, 1987, 469 с.
22. Steinmann P, Weaver JMR. Fabrication of sub-
5 nm gaps between metallic electrodes using conventionsl lithographic techniques. Vac.
Sa&TechnolB, 2004, 22:3178-3180.
23. Kolesov VV, Sapkov V, Soldatov ES. Using a Focused Ion Beam for the Creation of a Molecular Single Electron Transistor. Moscow Unit. Physics Bulletin, 2009, 64(4):384-388.
24. Park H, Lim AKL, Alivisatos AP. Fabrication of metallic electrodes with nanometer separation
2 НОМЕР | ТОМ 5 | 2013 | РЭНСИТ
НАНОСИСТЕМЫ
with electromigration. Appl. Phys. Letters, 1999, 35:2-5.
25. Trouwborst ML, van der Molen SJ, van Wees BJ. The role Joule heating in the formation of nanogaps by electromigration. J.Appl.Phys.,
2006, 99:1143-1147.
26. O’Neill K, Osorio EA, van der Zant HSJ. Self Breaking in Planar Few-atom Au Constrictions for nm-Spaced Electrodes. Appl. Phys. Lett.,
2007, 90:1331-1336.
27. Heersche HB, Lientschnig G et al. In situ imaging of electromigration-induced nanogap formation by transmission electron microscopy. Appl Phys. Lett., 2007, 91(7):072107-3.
28. Gulyaev YuV, Kolesov VV, Kislov VV, Taranov IV, Gubin SP, Khomutov GB, Soldatov ES, Maximov IA, Samuelson L. Electronics of molecular nanoclusters. Intern. J. of Nanoscience, 2004, 3(1-2):137-147.
29. Бидей СП и др. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Вудворд Д (ред.). Москва, Мир, 1988, 215 с.
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ НАНОБИОСЕНСОР 59 НА ОСНОВЕ ФЕРМЕНТА ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ
Кашин Вадим Валерьевич
научный сотрудник
Институт радиотехники и электроники им.
В.А.Котельникова РАН
11/7, ул. Моховая, Москва 125009, Россия
+7 495 629 3368, [email protected].
Колесов Владимир Владимирович
к.ф.-м.н, завлаб, действительный член РАЕН
Институт радиотехники и электроники им.
В.А.Котельникова РАН
11/7, ул. Моховая, Москва 125009, Россия
+7 495 629 3368, [email protected].
Крупенин Сергей Владимирович
к.ф.-м.н., н.с.
Институт радиотехники и электроники им.
В.А.Котельникова РАН
11/7, ул. Моховая, Москва 125009, Россия
+7 495 629 3368, [email protected].
Паршинцев Александр Александрович
аспирант
МГУ им. М.В.Ломоносова, физический факультет 1/2, Ленинские горы, Москва 119991, Россия +7 495 939 5935, [email protected].
Решетилов Анатолий Николаевич
д.х.н, завлаб, действительный член АИН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Москва, Россия
5, просп.Науки, Пущино 142290 Моск. обл., Россия +7 4967 31-86-10, [email protected].
Солдатов Евгений Сергеевич
к.ф.-м.н., с.н.с, член-корреспондент РАЕН МГУ им. М.В.Ломоносова, физический факультет 1/2, Ленинские горы, Москва 119991, Россия +7 495 939 5935, [email protected].
Азев Вячеслав Николаевич к.х.н, н.с.
Филиал института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН
6, просп. Науки, Пущино 142290 Моск. обл., Россия +7 916 199 5855.
РЭНСИТ | 2013 | ТОМ 5 | НОМЕР 2
60
NANOSYSTEMS
MOLECULAR NANOBIOSENSOR
ON THE BASIS OF GLUCOSE OXYDAS ENZYME
Kashin V.V., Kolesov V.V., Krupenin S.V.
Kotel’nikov Institute of Radio Engineering and Electronics of RAS, http://www. cplire.ru [email protected]
Parshintsev A.A., Soldatov E.S.
Lomonosov Moscow State University, Physics Department, http://www.phys.msu.ru [email protected]
Reshetilov A.N.
Scryabin Institute of Biochemistry and Physiology of microorganisms of RAS, http://www.ibpm.ru [email protected]
Azev V.N.
Branch of Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of RAS, http://www.bibc.psn.ru [email protected]
The last achievements in a solution of the miniaturization problem of electronic devices, and also successes in combination of technologies of biology and nanoelectronics allowed to develop original designs of nanodevices, in particular, transistors on the basis of single molecules that gives essentially new possibility of use of nanostructures for development not only miniature physical devices, but also for the solution of more wide range of tasks in live systems. In the work the planar topology for the nanoelectronics transducer on the basis of the glucose oxydase enzyme is developed. On the basis of the methods of electron-beam nanolithography, two shadow deposition and plasma-chemical etching the planar nanostructures for the nanoelectronics transducer were prepared. The method of the chemical surface modification of silicon dioxide by epoxysilane was developed and the immobilization of the glucose oxidase enzyme on the surface of planar nanostructure for the nanoelectronics transducer through the linker molecules was realized. The registration procedure of the biochemical signals was developed. The electronic properties of a nanoelectronic transducer were investigated in buffer solution in absence and at addition of a glucose oxydas. It is shown that on a control sample reaction to glucose oxydas is absent, and on the nanoelectronic structure modified by enzyme an electronic response of the biosensor to 10 мМ solution of glucose is present. Thus a change in the functional state of the immobilized ferment of the glucose oxidase enzyme with the presence (oxidation) of glucose in the test solution was demonstrated.
Keywords: biosenor, nanotransistor, nanostructures, enzymatic electrochemical sensors, enzymatic activity
UDC 544.6:57 (579.087.9+543.95):543.86
Bibliography - 29 references
RENSIT, 2013, 5(2):45-61_______________________________
REFERENCES
1. Reshetilov AN, Reshetilova TA. Nanosensors and their applications. In: Metalnancparticks in microbiology. Berlin, Springer Verlag, 2011, p. 269-283.
2. Asefa T, Duncan CT, Sharma KK. Recent 5. advances in nanostructured chemosensors and biosensors. Analyst, 2009, 134(10):1980-1990.
3. Soldatov ES, Khanin VV, Trifonov AS, Gubin SP, Kolesov VV, Presnov DE, Iakovenko SA, Khomutov GB, Korotkov AN. Room 6 temperature molecular single-electron transistor. Physics Uspekhi, 1998, 41(2):202-202.
4. Gubin SP, Gulayev YuV, Khomutov GB, Kislov VV, Kolesov VV, Soldatov ES, Sulaimankulov
Received 16.12.2013
KS, Trifonov AS. Molecular clusters as building blocks for nanoelectronics: the first demonstration of cluster SET transistor at room temperature. Nanotechnology, 2002, 13:185-194. Soldatov ES, Gubin SP, Maximov IA, Khomutov GB, Kolesov VV, Sergeyev-Cherenkov AN, Shorokhov VV, Sulaimankulov KS, Suyatin DB. Molecular cluster based nanoelectronics. Microelectronic Engineering,, 2003, 69:536-548.
Gubin SP, Gulyaev YuV, Khomutov GB, Kislov VV, Kolesov VV, Maximov IA, Samuelson L, Soldatov ES, Taranov IV. Electronics of molecular nanoclusters. Intern. J. of Nanoscience, 2004, 3(1-2):137-147.
2 НОМЕР | ТОМ 5 | 2013 | РЭНСИТ
NANOSYSTEMS
7. Kolesov VV, Sapkov IV, Soldatov ES. Molecular single electron transistor on the basis of the planar nanostructure. Proc. 20-th Int. Crimean Conf. “Microwave & Telecommunication Technology” (CriMiCo’2010), 13-17 Sept. 2010, Sevastopol, Crimea, Ukraine, pp. 857-858.
8. Scognamiglio V, Pezzotti G, Pezzotti I, Cano J, Buonasera K, Giannini D, Giardi MT. Biosensors for effective environmental and agrifood protection and commercialization: from research to market. Mirochimica Acta, 2010, 170:215-225.
9. Reshetilov AN, Kitova AE, Arkhipova AV. Determination of ethanol in acetic acid-containing samples by a biosensor based on immobilized Gluconobacter cells. Nusantara Bioscience. MBI & UNS Solo, 2012, 3:97-100.
10. Pantelopoulos A, Bourbakis NG. A survey on wearable sensor-based systems for health monitoring and prognosis. IEEE Transactions on Systems, Man and Cybernetics, Part C: Applications and Reviews, 2009, 40(1):1-12.
11. Reddy RRK, Chadha A, Bhattacharya E. Porous silicon based potentiometric triglyceride biosensor. Biosensors and Bioelectronics, 2001, 16(4-5):313-317.
12. Adami M, Sartore M, Baldini E, Rossi A, Nicolini C. New measuring principle for LAPS devices. Sensors and Actuators B: Chemical, 1992, 9(1):25-31.
13. Pan T, Huang M-D, Lin W-Y, Wu M-H. A urea biosensor based on pH-sensitive Sm2TiO5 electrolyte—insulator—semiconductor. Analytica Chimica Acta, 2010, 669:68-74.
14. http://www.newchemistry.ru/printletter.php.
15. Bergveld P Thirty years of ISFETOLOGY. What happened in the past 30 years and what may happen in the next 30 years. Sensors and Actuators B: Chemicall, 2003, 88:1-20.
16. Pourmand M, Karhanek M, Persson HHJ, Webb CD, Lee TH, Zahradrnkova A, DavisRW Direct electrical detection of DNA synthesis. Proc. of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103(17):6466-6470.
17. Wu M, Lin T-W, Huang M-D, Wang H-Y, Pan T-M. Label-free detection of serum uric acid using novel high-k Sm TiO membrane-based electrolyte—insulator—semiconductor. Sensors and Actuators B, 2010, 146:342—348.
MOLECULAR NANOBIOSENSOR 61 ON THE BASIS OF GLUCOSE OXYDAS ENZYME
18. De Benedetto GE, Palmisano F, Zambonin PG. One-step fabrication of a bienzyme glucose sensor based on glucose oxidase and peroxidase immobilized onto a poly(pyrrole) modified glassy carbon electrode. Biosensors and Bioelectronics, 1996, 11(10):1001-1008.
19. Krupenin VA, Lotkhov SV, Vishenski SV. Photo and electron-beam lithography sharing common stencil. J.Vac. Sci. Techno., 1993, B11(6):2132.
20. Steinmann P, Weaver JMR. Fabrication of sub-5 nm gaps between metallic electrodes using conventionsl lithographic techniques. Vac. Sci.&Technol. B, 2004, 22:3178.
21. Tolliver D, Novicky R, Hess D et al. VIST Electronics Microstructure Science: Plasma Processing for VLSI. Einspruch NG, Braun D (eds.). Miami, Acad.Press, 1981.
22. Steinmann P, Weaver JMR. Fabrication of sub-5 nm gaps between metallic electrodes using conventionsl lithographic techniques. Vac. Sci.&Technol. B, 2004, 22:3178-3180.
23. Kolesov VV, Sapkov V, Soldatov ES. Using a Focused Ion Beam for the Creation of a Molecular Single Electron Transistor. Moscow Univ. Physics Bulletin, 2009, 64(4):384-388.
24. Park H, Lim AKL, Alivisatos AP Fabrication of metallic electrodes with nanometer separation with electromigration. Appl. Phys. Letters, 1999, 35:2-5.
25. Trouwborst ML, van der Molen SJ, van Wees BJ. The role Joule heating in the formation of nanogaps by electromigration. J.Appl.Phys.,
2006, 99:1143-1147.
26. O’Neill K, Osorio EA, van der Zant HSJ. Self Breaking in Planar Few-atom Au Constrictions for nm-Spaced Electrodes. Appl. Phys. Lett;.,
2007, 90:1331-1336.
27. Heersche HB, Lientschnig G et al. In situ imaging of electromigration-induced nanogap formation by transmission electron microscopy. Appl. Phys. Lett;, 2007, 91(7):072107-3.
28. Gulyaev YuV, Kolesov VV, Kislov VV, Taranov IV, Gubin SP, Khomutov GB, Soldatov ES, Maximov IA, Samuelson L. Electronics of molecular nanoclusters. Intern. J. of Nanoscience, 2004, 3(1-2):137-147.
29. Bidey SP, Brodelius P, Kabral IMA, Kaflan MP
Immobilised cells and enzymes a practical approach. Woodward J (ed.). Oxford-Washington, IRL Press, 1985, 215 p.
РЭНСИТ | 2013 | ТОМ 5 | НОМЕР 2
