CC BY
70
УДК 577.353: 616.12-007.61
Вестник СПбГУ. Сер. 4. 2011. Вып. 4
Г. Б. Белостоцкая, И. С. Елдашев, С. В. Сурма, Б. Ф. Щёголев
MОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВОЗДЕЙСТВИЯ МАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ РАЗНОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ НА РЕГУЛЯЦИЮ УРОВНЯ КАЛЬЦИЯ В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ МЫШЕЧНЫХ КЛЕТКАX
Введение. Актуальность исследований воздействия слабых магнитных полей на биологические объекты обусловлена в первую очередь значимостью влияния геомагнитного поля (ГМП) на живые системы и их генезис. Несмотря на то, что магнитобио-логические эффекты (МБЭ) магнитных полей (МП) разной напряжённости описаны для многих биологических объектов — от растений [1] и бактерий [2] до клеток [3-7] и целостных организмов, включая человека [8-10], отсутствует понимание сущности биофизических процессов взаимодействия МП с биологическими субстанциями. Однако во многих работах рассматривается возможное влияние МП на процессы, происходящие с участием заряженных частиц — ионов кальция, магния, калия и др. [11, 12], которые, в свою очередь, участвуют в различных биохимических и физиологических процессах на уровне клеток, органов и тканей, тем самым вызывая различные отклонения в функциональном состоянии организмов.
Ранее нами было установлено, что снижение магнитного воздействия до 0,3 мкТл приводит к торможению процессов пролиферации и дифференцировки скелетных мышечных клеток, а слабое постоянное магнитное поле (ПМП) микротеслового диапазона стимулирует формирование многоядерных гипертрофированных миотрубок в первичной культуре [13, 14]. Было также показано, что стимулирующий эффект слабого ПМП обусловлен повышением концентрации внутриклеточного кальция [Ca2+]j в миотруб-ках [15, 16] за счёт индуцируемого МП высвобождения Ca2+ из саркоплазматического ретикулума (СР) через рианодиновые рецепторы (РиР).
В нашей работе впервые исследовано воздействие МП (0,3 и 160-400 мкТл) на Са2+-сигнализацию в культивируемых скелетных мышечных клетках новорождённой крысы. Изучение активности рецепторов наружной мембраны и СР, участвующих в выполнении основной функции мышечных клеток — сокращении, позволило рассмотреть МБЭ, индуцированные гипомагнитным полем и слабым ПМП, на молекулярном уровне и оценить степень их воздействия на функцию скелетной мускулатуры.
Материалы и методы. Сателлитные клетки мышц лапок новорождённых крыс выделяли по методике Бима и Кнадсона [17] в нашей модификации [18]. Изолированные клетки получали разрушением мышечной ткани с помощью коллагеназы IA (2 мг/мл) в растворе Рингера (мМ: 146 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 11 глюкозы, 10 HEPES, pH = 7,4) в течение 40 мин при 37 °С. Для снижения доли немышечных клеток суспензию ферментативно изолированных клеток преинкубировали на стеклянной поверхности в течение 1 ч.
Культивирование сателлитных клеток проводили в среде DMEM с 10 % сыворотки плодов коров (э.с.) и антибиотиками (50 ед./мл пенициллина/50 мкг/мл стрептомицина). На 3-й день культивирования её заменили на среду DMEM с 2 % э.с. и антибиотиками, что позволяло сократить период активной пролиферации миобластов и ускорить процесс слияния миоцитов и дифференцировки миотрубок. Клетки культивировали на полосках покровных стёкол (12 х 24 мм), предварительно покрытых поли-Д-лизином
© Г. Б. Белостоцкая, И. С. Елдашев, С.В.Сурма, Б. Ф. Щёголев, 2011
(Sigma, 0,1 мг/мл) и помещённых в чашки Петри (d = 40 мм, «Медполимер», Россия). Инкубирование клеток проводили в СО2-инкубаторе ("Jouan", Франция) при 5 % СО2, влажности 95 % и температуре 37 °С.
Для ослабления ГМП и экранирования от различных переменных МП изготовлены две экранирующие камеры (ЭК) из аморфного магнитомягкого материала АМАГ 172. Первая камера позволяет ослабить ГМП в 160 раз, доведя значение МП до 0,3 мкТл, а коэффициент ослабления камеры № 2 равняется 26.
Увеличенное до 160-200 мкТл ПМП создавали с помощью постоянного кольцевого магнита (ПМ). Для стабилизации магнитного поля и уменьшения влияния внешних техногенных полей конструкция с кольцевым магнитом помещалась в ЭК № 2. В экспериментах с ПМП более высокой напряжённости (400 мкТл) применяли ПМ в виде кубика с гранями 1 х 1 х 1 см. Все измерения ПМП проводили с помощью однокоорди-натного магнитометра Fluxmaster (Германия), точность измерений которого составляет 1 нТл.
Регистрацию внутриклеточной концентрации кальция ([Ca2+]j) выполняли с помощью компьютерной системы анализа внутриклеточного содержания ионов (Intracellular Imaging & Photometry System, США). Возбуждение образца осуществляли при 340 и 380 нм, а эмиссию регистрировали при 510 нм. С помощью программы InCytIm2 рассчитывали концентрацию ионов кальция как соотношение интенсивностей флуоресценции (F340/F380) с учётом калибровочной кривой [19]. В качестве флуоресцентного зонда использовали Fura-2AM (Sigma) в концентрации 10 мкМ. Для изучения активности рецепторов наружной мембраны и СР применяли ацетилхолин (АцХ), лиганд АцХ-рецепторов в концентрации 10-20 мкМ, раствор Рингера с повышенным содержанием ионов K+ (KCl, 100 мМ) в качестве деполяризующего агента и активатор РиР 4-хлор-м-крезол (4-ХмК, 0,5-1,0 мМ).
Интенсивность нарастания [Ca2+]j под воздействием используемых лигандов и активаторов рецепторов определяли как отношение максимального значения концентрации к исходному уровню Ca2+ в каждой миотрубке и выражали в относительных единицах. Амплитуду Ca2+ ответа в наномолях (нМ) устанавливали как разницу между максимумом (пик) и минимумом (исходное значение) на кальциевых кривых. Скорость кратковременного повышения [Ca2+]j вычисляли путём деления амплитуды в наномолях на время, в течение которого этот процесс происходил, в секундах (с).
При статистической обработке результатов измерения внутриклеточной концентрации кальция усредняли данные измерений на нескольких миотрубках в одном эксперименте и данные нескольких экспериментов. Обработку осуществляли с помощью программы Microsoft Office Excel 2003, определяя среднее ± ошибка среднего (M ± m) в разделе "Data Analysis".
Результаты экспериментов. Основываясь на наших предыдущих исследованиях [15, 16], мы предположили, что эффект нарастания [Ca2+]j может быть обусловлен либо непосредственным воздействием ПМП на РиР, либо возможным взаимодействием модифицированных ПМП дигидропиридиновых рецепторов (ДГПР, L-каналы) с РиР, приводящим к активизации последних. Для проверки этого предположения были поставлены эксперименты по изучению влияния слабого ПМП с напряжённостью 200 и 400 мкТл и гипомагнитного воздействия (ослабление до 0,3 мкТл) на активность рецепторов наружной мембраны и СР. Опыты проводили на 7-8-суточных миотрубках.
Результаты, представленные на рис. 1, б, в, отображают два варианта экспериментов по измерению [Ca2+]j в 7-суточных миотрубках при действии повышенной концентрации калия (KCl) и 4-ХмК непосредственно во время действия ПМП с напряжённостью
n = 2
—>
KCl 4-ХмК
t = 100 с
KCl 4-ХмК
4ws
KCl
4-ХмК
я
0 0
ö
C
vyvi
n = 3
n = 2
•/Mrv1
KCl
4-ХмК
АцХ
4-ХмК
Рис. 1. Изменение концентрации внутриклеточного кальция ([Ca2+]i) в 7-8-суточных миотрубках новорождённой крысы в ответ на действие KCl (100 мМ), 4-ХмК (1 мМ) и АцХ (20 мкМ) в различных условиях:
а — контроль ГМП (48—50 мкТл); б — в первые 2 мин воздействия ПМП (400 мкТл); в — через 5—8 мин воздействия ПМП (400 мкТл); г — через 10 мин воздействия ПМП (200 мкТл); д — через 2 ч ослабления ГМП (0,3 мкТл)
б
а
в
д
г
400 мкТл. В первом случае (см. рис. 1, б) деполяризация мембраны под воздействием KCl происходила на 1-й минуте, а активизация РиР с помощью 4-ХмК — на 3-й минуте действия ПМП. В другом опыте (см. рис. 1, в) агенты подавали на 5-й минуте (KCl) и 8-й минуте (4-ХмК) воздействия ПМП на фоне индуцируемого им нарастания [Ca2+]j в миотрубках. Сравнивая представленные данные с контролем ГМП (рис. 1, а), убедимся, что ПМП с напряжённостью 400 мкТл в первые минуты воздействия не только не снижает амплитуду нарастания [Ca2+]j в ответ на действие 4-ХмК, но даже несколько усиливает ответ миотрубок на деполяризацию наружной мембраны при подаче раствора Рингера с повышенной концентрацией ионов калия (KCl, 100 нМ). Однако увеличение времени воздействия ПМП с напряжённостью 400 мкТл всего на 5 мин, при котором уровень внутриклеточного Ca2+ повышается в 1,25 ± 0,09 раза по сравнению с исходным значением, вызывает снижение амплитуды Са2+-ответов и скорости нарастания [Ca2+]j (кривая нарастания [Ca2+]j при действии 4-ХмК имеет более пологий вид).
Результаты воздействия этих же агентов на фоне действия ПМП (200 мкТл) меньшей напряжённости представлены на рис. 1, г. Несмотря на то, что в этом случае
уровень [Ca2+]j возрос в 1,51 ± 0,02 раза, амплитуда повышения [Ca2+]j увеличилась по сравнению с контролем с 121 ± 11 нМ до 196 ± 26 нМ для KCl и с 178 ± 2 нМ до 196 ± 10 нМ для 4-ХмК.
Активность АцХ-рецепторов и РиР изучали после длительного (2 ч) ослабления ГМП, снижающего уровень магнитного воздействия до 0,3 мкТл (рис. 1, д). Ослабление практически не изменило активность АцХ-рецепторов. Амплитуда ответа составила 180 ± 16 нМ в контроле (не представлено на графике) и 175 ± 27 нМ после ослабления. Однако действие 4-ХмК в концентрации 1 мМ вызывало большую амплитуду Са2+-от-вета (209 ± 14 нМ), что в 1,17 раза превышает этот показатель в контроле.
Учитывая наблюдаемые эффекты, влияние МП на работу рецепторов наружной мембраны и СР оценивали по интенсивности и скорости Ca2+ -ответов на действие аце-тилхолина (АцХ), KCl (100 мМ) и активатора РиР — 4-хлор-м-крезола (4-ХмК). Гистограммы, представленные на рис. 2, показывают, что интенсивность нарастания [Ca2+]j в ответ на действие деполяризующего агента KCl снижается при увеличении времени воздействия ПМП (рис. 2, а). Амплитуда снижается в 2 раза при напряжённости ПМП 200 мкТл за 3 ч воздействия, а при 400 мкТл для достижения этого же эффекта достаточно 5 мин. Сходная картина наблюдается под воздействием ПМП с напряжённостью 400 мкТл в отношении РиР, активированных 4-ХмК в концентрации 1 мМ (рис. 2, в). Однако при кратковременном действии (10 мин) более слабого ПМП (200 мкТл) интенсивность Ca2+-выброса в ответ на действие 4-ХмК в концентрациях 0,5 и 1,0 мМ снижается, а при длительном (3 ч) пребывании миотрубок в МП этой интенсивности наблюдается повышение интенсивности ответа на действие 4-ХмК в концентрации 0,5 мМ и даже восстановление исходного значения этого показателя при активации РиР с помощью 4-ХмК в концентрации 1,0 мМ. Похожую ситуацию демонстрируют АцХ-рецепторы (рис. 2, б). Интенсивность их ответов на АцХ также снижается при непродолжительном действии ПМП с напряжённостью 200 мкТл и имеет тенденцию к повышению при увеличении времени магнитного воздействия.
При длительном (более 1 ч) гипомагнитном воздействии (0,3 мкТл) интенсивность нарастания [Ca2+]j в ответ на действие активатора повышается (см. рис. 2, в) по сравнению с ответом этих же рецепторов на 4-ХмК в нормальном ГМП (К). Однако для АцХ-рецепторов было зарегистрировано снижение Ca^-ответа по мере увеличения продолжительности пребывания миотрубок в экранируемом ГМП (см. рис. 2, б).
Поскольку в процессе экспериментов было выявлено, что повышение [Ca2+]j в ответ на действие активаторов и лигандов в одних случаях происходило быстрее, чем в других при равной амплитуде Ca2+ -ответов, был выбран дополнительный параметр — скорость нарастания [Ca2+]j. Этот показатель, по нашему мнению, позволяет оценить не только способность достижения максимального уровня концентрации внутриклеточного Ca2+, но также даёт возможность определить влияние МП на активность рецепторов наружной мембраны и СР.
Было установлено, что при кратковременном воздействии усиленного МП (ПМП, 200-400 мкТл) активность АцХ-рецепторов и РиР снижается, а при длительном — восстанавливается (рис. 3). Скорость нарастания [Ca2+]j в ответ на действие KCl, вызывающего деполяризацию наружной мембраны и запускающего электромеханическое сопряжение (ЭМС) между дигидропиридиновыми рецепторами (ДГПР) наружной мембраны и рецепторами СР (РиР), напротив, со временем снижается, что может свидетельствовать о нарушении взаимодействия между рецепторами.
В противоположность этому кратковременное экранирование ГМП снижает скорость нарастания [Ca2+]j в ответ на действие АцХ и 4-ХмК, в то время как увеличение
CS
и
-с
Б о я г
S
к —
KCl 100 мМ
16 12 8 4
0
К 10 мин 3 ч 1 мин 5 мин К 10 мин 3 ч 30 мин 1-3 ч
200 мкТл 400 мкТл 200 мкТл 0,3 мкТл
б
□ АцХ 10 мМ _г ■ АцХ 20 мМ ГТ!
□ 4-ХмК 0,5 мМ ■ 4-ХмК 1 мМ
К
10 3 ч 1 мин 5 мин 1-3 ч
мин
200 мкТл 400 мкТл 0,3 мкТл
Рис. 2. Изменение интенсивности Ca2+ ответов на действие:
KCl (100 мМ), б — 4-ХмК (0,5-1,0 мМ) и в — АцХ (10—20 мкМ) под воздействием МП разной напряжённости и длительности в 7-8-дневных миотрубках новорождённой крысы
в первичной культуре
а
в
а
времени гипомагнитного воздействия ускоряет Са2+-ответы АцХ-рецепторов и РиР, вызванные активацией этими агентами. Мы предполагаем, что этот эффект может быть обусловлен концентрацией Ca2+ в СР. Поскольку, как было показано ранее [15, 16], ПМП индуцирует нарастание [Ca2+]j, высвобождая Ca2+ из СР и опустошая при этом его запасы, то при дополнительном открытии РиР с помощью 4-ХмК наблюдается снижение скорости высвобождения Ca2+, а при активации РиР (4-ХмК, 0,5 мМ) в ослабленном ГМП происходит более стремительный выход Ca2+ из наполненного или даже переполненного кальцием СР.
С другой стороны, зависимость амплитуды повышения [Ca2+]j при действии KCl и 4-ХмК от напряжённости ПМП (см. рис. 1) при непродолжительном его воздействии можно объяснить увеличением времени открытого состояния РиР под влиянием ПМП. Однако увеличение времени магнитного воздействия приводит к постепенному истощению запасов Ca2+ в цистернах СР, причём чем больше напряжённость МП, тем быстрее снижается концентрация ионов кальция в депо и, соответственно, амплитуда Ca2+ -ответа.
Обсуждение. На основании собственных результатов [15, 16] и данных других авторов, указывающих на факт влияния повышенной концентрации внутриклеточного кальция на пролиферацию делящихся клеток [20], можно предположить, что в основе стимулирующего эффекта ПМП на пролиферацию и дифференцировку скелетных
35 и 30« 25-
и 20 «
S
3 15 Н
& 10-
О
л
Si и
5
10 мин 3 ч 200 мкТл
Ш АцХ 10 мкМ ■ АцХ 20 мкМ □ 4-ХмК 0,5 мМ 14-ХмК 1,0 мМ Ш KCl 100 мМ
й
1 мин 5 мин 400 мкТл
30 мин 1-3 ч 0,3 мкТл
Рис. 3. Изменение скорости нарастания [Ca2+]i в 7-8-дневных миотрубках новорождённой крысы в ответ на действие АцХ (10-20 мкМ), KCl (100 мМ) и 4-хлор-м-крезола (0,5-1,0 мМ) под воздействием МП разной напряженности и длительности
0
мышечных клеток в культуре лежит индуцируемое им нарастание [Ca2+]i, вызванное высвобождением кальция из СР через открытые РиР. На фоне опустошения СР во время действия ПМП (200-400 мкТл) дополнительная активизация изученных нами рецепторов демонстрирует снижение их активности. Реакция на деполяризующий стимул (KCl, 100 мМ) также снижается. При более длительном пребывании миотрубок в слабом ПМП активность АцХ-рецепторов восстанавливается, однако активность РиР, как и ответ на деполяризацию, остаётся низкой. Причём сопряжённость двух последних параметров, по-видимому, дополнительно свидетельствует в пользу индуцируемого нарушения сопряжения ДГПР и РиР в ЭМС под воздействием ПМП микротеслового диапазона напряжённости.
Вызванное воздействием слабого ПМП нарушение в ЭМС отражается на работе сократительного аппарата сформированных в первичной культуре миотрубок. Причём полностью дифференцированные миотрубки на поздних сроках развития менее чувствительны к воздействию слабого ПМП, демонстрируя постепенное снижение (до 25 %) частоты сокращений, тогда как миотрубки, находящиеся на стадии формирования ЭМС, резко снижают частоту сокращений (вплоть до полного прекращения) уже в первые минуты действия ПМП.
Литература
1. Фомичева В. М., Говорун Р. Д., Данилов В. И. Пролиферативная активность и клеточная репродукция в корневых меристемах гороха, чечевицы и льна в условиях экранирования геомагнитного поля // Биофизика. 1992. Т. 37. № 4. С. 745-749.
2. Horiuchi S., Ishizaki Y., OkunoK. et al. Change in broth culture is associated with significant suppression of Escherichia coli death under high magnetic field // Bioelectrochemistry. 2001. Vol. 53. N 2. P. 149-153.
3. BelyaevI. Ya., Alipov Ye. D., Harms-Ringdahl M. Effects of zero magnetic field on the conformation of chromatin in human cells // Biochim. Biophys. Ada. 1997. Vol. 1336. P. 465-473.
4. SakuraiH., Okuno K., KuboA. et al. Effect of a 7-tesla homogeneous magnetic field on mammalian cells // Bioelectrochem. Bioenerg. 1999. Vol. 49. Iss. 1. P. 57-63.
5. BeischerD. E. Biomagnetics // Ann. NY Acad. Sci. 1965. Vol. 134. N 1. P. 454-458.
6. Beischer D. E. The null magnetic field as reference for the study of geomagnetic directional effects in animals and man // Ann. NY Acad. Sci. 1971. Vol. 188. P. 324-330.
7. Wever R. Human circadian rhythms under the influence of weak electric fields and the different aspects of these studies // Int. J. Biometeor. 1973. Vol. 17. N 3. P. 227-232.
8. Леднёв В. В. Биоэффекты слабых комбинированных постоянных и переменных магнитных полей // Биофизика. 1996. Т. 41. № 1. С. 224-231.
9. LiboffA. R. Electric-field ion cyclotron resonance // Bioelectromagnetics 1997. Vol. 18. N 1. P. 85-87.
10. Teodori L., Gohde W., Valente M. G. et al. Static magnetic fields affect calcium fluxes and inhibit stress-induced apoptosis in human glioblastoma cells // Cytometry. 2002. Vol. 49. P. 143-149.
11. FanelliC., Coppola S., Barone R. et al. Magnetic fields increase cell survival by inhibiting apoptosis via modulation of Ca2+ influx // FASEB J. 1999. Vol. 13. P. 95-102.
12. Агаджанян Н. А., Власова И. Г. Влияние инфранизкочастотного магнитного поля на ритмику нервных клеток и их устойчивость к гипоксии // Биофизика. 1992. Т. 37. № 4. С. 681-689.
13. Eldashev I. S., Shchegolev B. F., Surma S. V., Belostotskaya G. B. The influence of low intensity magnetic field on proliferation and differentiation of new born rat muscle cells in the primary culture // Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies. Pushchino., 2010. P. 77-80.
14. Елдашев И. С., Щёголев Б. Ф., Сурма С. В., Белостоцкая Г. Б. Влияние слабых магнитных полей на развитие сателлитных клеток новорождённой крысы в первичной культуре // Биофизика. 2010. Т. 55. № 5. С. 868-874.
15. Елдашев И. С., Белостоцкая Г. Б., Щёголев Б. Ф. Возможный механизм действия постоянного магнитного поля слабой интенсивности на физиологические процессы в культивируемых скелетных мышечных клетках // Матер. межд. научно-практ. конф. «XXXIX неделя науки в СПбГПУ». 2010. Ч. XVI. С. 13-15.
16. Белостоцкая Г. Б., Голованова Т. А., Елдашев И. С. и др. Уровень внутриклеточного кальция как показатель физиологического состояния мышечных клеток // Труды 1-й межд. научно-практ. конф. «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» / под ред. А. П. Кудинова, Б. В. Крылова. СПб., 2010. Т. 3. С. 23-26.
17. BeamK. G., Knudson M. Calcium current in embryonic and neonatal mammalian skeletal muscle //J. Gen. Physiol. 1988. Vol. 91. P. 781-798.
18. Белостоцкая Г. Б., Захаров Е. А., ДарашинаИ. В. Дифференцировка скелетных мышечных клеток в культуре сателлитных клеток // Цитология. 2006. Т. 48. № 9. С. 743-744.
19. Grynkiewicz G., PoenieM., TsienR. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties // J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 3440-3450.
20. Замай Т.Н., Замай А. С. Концентрация внутриклеточного кальция в асцитных клетках карциномы эрлиха с разной скоростью пролиферации // Фундаментальные исследования. 2004. № 1. С.122-123.
Статья поступила в редакцию 28 июня 2011 г.
