CC BY
82
Материалы конференции
УДК 617.735:615.27
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕТИНОПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ КОРОТКИХ ПЕПТИДОВ
Н. С. Линькова, В. Е. Проняева, А. В. Дудков, С. В. Трофимова Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии, Санкт-Петербург, Россия
MOLECULAR MECHANISM OF SHORT PEPTIDES RETONOPROTECTIVE ACTIVITY
N. S. Linkova, V. E. Pronyaeva, A. V. Dudkov, S. V. Trofimova Saint-Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, St. Petersburg, Russia
© Коллектив авторов, 2013 г.
Ретинопротекторные средства на основе пептидных биорегуляторов (ретиналамин, эпиталон) успешно применяются в офтальмологии для лечения возрастной макулярной дистрофии, глаукомы, диабетической ретинопатии и другой патологии. Установлено, что молекулярный механизм ретинопротекторного действия тетрапептида эпиталона и нового ретинопротекторного пептида Т-37 связан с их способностью стимулировать дифференцировку нейронов и клеток пигментного эпителия сетчатки. Ключевые слова: трипептид, ретинопротектор, патология сетчатки.
Retinoprotective drugs on the base of peptide bioregulators (retinalamin, epithalon) are successfully using in ophthalmology for treatment of age-related macular degeneration, glaucoma, diabetic retinopsaty and other pathology. Molecular mechanism of retinoprotective activity of peptides epithalon and T-37 is connected with ability to stimulate neuronal differentiation and pigment epithelium. Keywords: tripeptide, retinoprotector, retina pathology.
Пептидные геропротекторы являются новым классом лекарственных препаратов [1—4]. Первым пептидным ретинопротекторным препаратом стал ретиналамин. Затем на основе анализа его аминокислотного состава были синтезированы короткие пептиды эпиталон и Т-37. Тетрапептид эпиталон способствует регенерации сетчатки при различных дистрофических ее поражениях, уменьшает степень выраженности деструктивных изменений и индуцирует восстановление ее световой чувствительности при зрительной дезадаптации [1].
Клинические эффекты ретинопротекторного действия эпиталона могут быть обусловлены повышением функциональной активности различных типов клеток сетчатки. Установлено, что эпи-талон и ретиналамин индуцируют дифференци-ровку соответственно нервной и ретинальной ткани при добавлении в культуру полипотентных клеток [1, 4].
Целью исследования явилась сравнительная оценка влияния пептидов Т-37 и сочетания эпи-талона и Т-37 на молекулярные механизмы диф-ференцировки клеток сетчатки.
Материалы и методы исследования. Образцы сетчатки 10-дневных цыплят получали из ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава РФ (Санкт-Петербург).
Сразу после извлечения сетчатку помещали в стерильную чашку Петри и разделяли на эксплантаты (фрагменты величиной около 1 мм3). Затем эксплантаты переносили в чашку Петри с коллагеновым покрытием и культивировали в 3 мл питательной среды с рН = 7,2, включающей раствор следующего состава из расчета на 100 мл: раствор Хенкса 41 мл, среда Игла 30 мл, феталь-ная бычья сыворотка 25 мл, глюкоза 40% 1 мл, инсулин 2,5 мл (100 ЕД) и гентамицин 0,5 мл (20 мг). Продолжительность культивирования в инкубаторе составила 3 сут (36,7 °С, 5% СО2), так как именно такой временной интервал необходим для формирования зоны роста. Органотипические культуры сетчатки были разделены на 3 группы: контрольную — с добавлением физиологического раствора и 2 экспериментальные — с добавлением трипептида Т-37 в концентрации 0,05 нг/мл и с совместным введением пептидов Т-37 и эпиталона в концентрации 0,01 нг/мл.
Органотипические культуры фиксировали охлажденным до -20 °С 95% этанолом. Далее проводили окраску методом иммуноцитохимии с использованием моноклональных антител к маркерам Вгп3, Рахб, Ргох1, Vsx1 и ТТР (1 : 50, <Шако»), являющимися ключевыми факторами дифферен-
Materials of conference
цировки клеток сетчатки [5-7]. Затем культуры фотографировали в программе АСТ-1. Для оценки результатов иммуноцитохимического окрашивания проводили морфометрическое исследование с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа «Nikon Eclipse» E400, цифровой камеры «Nikon» DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программного обеспечения «Vidеotest Morphology 5.2».
Статистическая обработка экспериментальных данных включала в себя подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения от среднего и доверительного интервала для каждой выборки и проводилась в программе «Statistica 6.0». Для анализа вида распределения использовали критерий Шапиро—Уилка. Для проверки статистической однородности нескольких выборок бы-
сетчатки TTR во 2-й группе увеличилась в 2,1 раза, а в 3-й группе данный показатель возрастал в 6 раз. Таким образом, введение в культуру клеток трипептида Т-37 в сочетании с эпиталоном оказывает наибольший эффект на дифференцировку нейронов и пигментный эпителий сетчатки в сравнении с добавлением только трипептида Т-37.
Результаты иммуноцитохимического исследования свидетельствуют, что пептид КЕ и сочетание пептидов Т-37 и эпиталона является индуктором дифференцировки клеток сетчатки, что согласуется с данными других исследователей о стимулирующем влиянии гормонов и пептидов на их функциональную активность. Известно, что изменение уровня экспрессии соматостатина влияет на дифференцировку биполярных клеток [5]. Установлено, что короткие пептиды ADNF-9 и NAP
ли использованы непараметрические процедуры однофакторного дисперсионного анализа (критерий Краскела—Уоллиса).
Результаты исследования и их обсуждение. Площадь экспрессии маркера зрелых нейронов Ргох1 во 2-й группе возрастала в 1,8, а в 3-й группе — в 3 раза относительно контроля (табл.). Площадь экспрессии маркера конечной стадии диффе-ренцировки ганглиозных клеток ВгпЗ во 2-й группе возрастала в 5,5, а в 3-й группе — в 8,4 раза по сравнению с контролем (табл.). Пептиды не влияли на экспрессию маркера начального этапа диф-ференцировки нейронов Рахб. Площадь экспрессии маркера зрелых биполярных клеток "У^х1 во 2-й группе увеличивалась в 2,6 раза по сравнению с контролем, а в 3-й группе этот показатель достоверно не изменялся (табл.). Площадь экспрессии маркера клеток пигментного эпителия
способствовали увеличению выживаемости культуры ганглиозных клеток, а также стимулировали рост аксонов в эксплантатах сетчатки [7].
Следует отметить, что трипептид Т-37 в большей степени влиял на экспрессию маркеров нейронов сетчатки (Вгп3, Ргох1, "Уэх1) и может в дальнейшем изучаться в качестве ретинопротекторного средства при лечении тапеторетинальной абио-трофии, колбочко-палочковой дистрофии и различных нейродегенеративных заболеваний.
Совместное введение пептидов Т-37 и эпита-лона оказывало наиболее выраженную стимуляцию на экспрессию маркера клеток пигментного эпителия сетчатки TTR. Таким образом, сочетание указанных пептидов может являться эффективным средством при лечении различной рети-нальной патологии.
Таблица
Влияние пептидов на площадь экспрессии маркеров дифференцировки в культуре клеток сетчатки
Группа Площадь экспрессии, %
Proxl Brn3 Pax6 Vsxl TTR
1 группа (контроль) 0,040 ± 0,002 0,031 ± 0,003 0,018 ± 0,001 0,037 ± 0,003 0,022 ± 0,002
2 группа (пептид Т-37) 0,071 ± 0,001* 0,170 ± 0,005* 0,022 ± 0,004 0,14 ± 0,003* 0,047 ± 0,002*
3 группа (пептид Т-37 + эпиталон) 0,120 ± 0,003*# 0,260 ± 0,005*# 0,024 ± 0,004 0,035 ± 0,004 0,133 ± 0,003*#
Примечание:
* р < 0,05 по сравнению с соответствующим контролем; # р < 0,05 по сравнению с соответствующим показателем во 2-й группе.
Материалы конференции
Литература
1. Хавинсон В. Х. Тетрапептид, стимулирующий функцию сетчатой оболочки глаза, фармакологическое средство на его основе и способ его применения. — Патент РФ № 2161982.2001.
2. Хавинсон В. Х., Земчихина В. Н., Трофимова С. В., Малинин В. В. Влияние пептидов на пролиферативную активность клеток сетчатки и пигментного эпителия // Бюл. эксп. биол. мед. — 2003. — Т. 135. — № 6. — С. 700-702.
3. Хавинсон В. Х., Малинин В. В., Трофимова С. В., Земчихина В. Н. Индукционная активность пептидов сетчатки // Бюл. эксп. биол. мед. — 2002. — Т. 134. — № 11. — С. 560-563.
4. Anisimov V. N., Khavinson V. Kh. Peptide bioregulation of aging: results and prospects. // Biogerontology. — 2010. — № 11. — P. 139-149.
5. Casini G., Catalani E., Dal Monte M., Bagnoli P. Functional aspects of the somatostatinergic system in the retina and the potential therapeutic role of somatostatin in retinal disease // Histol. Histopathol. — 2005. — Vol. 20. — № 2. — P. 615-632.
6. Hewitt A. W., Kearns L. S., Jamieson R. V., Williamson R. A., van Heyningen V., Mackey D. A. PAX6 Mutations May Be Associated with High Myopia // Ophthalmic Genetics. — 2007. — Vol. 28. — № 3. — P. 179-182.
7. Lagreze W. A., Pielen A., Steingart R., Schlunck G., Hofmann H. D., Gozes I., Kirsch M. The peptides ADNF-9 and NAP increase survival and neurite outgrowth of rat retinal ganglion cells in vitro // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. — 2005. — Vol. 46. — № 3. — P. 933-938.
Контактная информация:
197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3. Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии;
[email protected], Линькова Наталья Сергеевна; раб. тел.: (812)-230-00-49
