CC BY
65
19. Kawaguchi M., Takahashi M., Hata T., Kashima Y., Usui F., Morimoto H. et al. Inflammasome activation of cardiac fibroblasts is essential for myocardial ischemia/reperfusion injury. Circulation. 2011; 123(6): 594—604.
20. Frangogiannis NG. Pathophysiology of myocardial infarction. Compr. Physiol. 2015; 5(4): 1841—75.
21. Martinez F.O., Sica A., Mantovani A., Locati M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 2008; 13: 453—61.
22. Biswas S.K., Mantovani A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: cancer as a paradigm. Nature Immunol. 2010; 11(10): 889—96.
23. Geissmann F., Gordon S., Hume D.A., Mowat A.M., Randolph G.J. Unravelling mononuclear phagocyte heterogeneity. Nature Rev. Immunol. 2010; 10(6): 453—60.
24. wolfs I.M., Donners M.M., de winther M.P. Differentiation factors and cytokines in the atherosclerotic plaque micro-environment as a trigger for macrophage polarisation. Thromb. Haemost. 2011; 106(5): 763—71.
25. Fairweather D., cihakova D. Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity. J. Autoimmun. 2009; 33(3—4): 222—30.
26. Panizzi P., Swirski F.K., Figueiredo J.L., waterman P., Sosnovik D.E., Aikawa E. et al. Impaired infarct healing in atherosclerotic mice with Ly-6c(hi) monocytosis. J. Am. Coll. Cardiol. 2010; 55(15): 1629—38.
27. Frantz S., Nahrendorf M. cardiac macrophages and their role in ischaemic heart disease. Cardiovasc. Res. 2014; 102(2): 240—8.
28. Kzhyshkowska J., workman G., Cardу-Vila M., Arap w., Pasqualini R., Gratchev A. et al. Novel function of alternatively activated macrophages: stabilin-1-mediated clearance of SPARc. J. Immunol. 2006; 176(10): 5825—32.
29. Bouhlel M.A., Derudas B., Rigamonti E., Drnvart R., Brozek J., Haulon S. et al. PPARgamma activation primes human monocytes into alternative M2 macrophages with anti-inflammatory properties. CellMetab. 2007; 6(2): 137—43.
30. Bournazou I., Pound J.D., Duffin R., Bournazos S., Melville L.A., Brown S.B. et al. Apoptotic human cells inhibit migration of granulo-cytes via release of lactoferrin. J. Clin. Invest. 2009; 119(1): 20—32.
ORIGINAL ARTICLE
31. Soehnlein O., Lindbom L. Phagocyte partnership during the onset and resolution of inflammation. Nature Rev. Immunol. 2010; 10(6): 427—39.
32. Geissmann F., Jung S., Littman D.R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 2013; 19(1): 71—82.
33. Dewald O., Zymek P., winkelmann K., Bournazos S., Melville L.A., Brown S.B. et al. ccL2/Monocyte chemoattractant Protein-1 regulates inflammatory responses critical to healing myocardial infarcts. Circ. Res. 2005; 96(8): 881—9.
34. Nahrendorf M., Swirski F.K., Aikawa E., Stangenberg L., wurdinger T., Figueiredo J.L. et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. J. Exp. Med.. 2007; 204(12): 3037—47.
35. Ikejima H., Imanishi T., Tsujioka H., Kuroi A., Tanimoto T., Kitabata H. et al. Effect of human peripheral monocyte subsets on coronary flow reserve in infarct-related artery in patients with primary anterior acute myocardial infarction. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2010; 37(4): 453—9.
36. Martinez F.O., Gordon S., Locati M., Mantovani A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: new molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 2006; 177(10): 7303—11.
37. Monastirskaya E.A., Lyamina S.v., Malishev I.U. M1 and M2 phe-notypes of activated macrophages and their role in the immune response and disease. Pathogenesis. 2008; 6(4): 31—9. (in Russian)
38. Johnson J.L., newby A.c. Macrophage heterogeneity in atherosclerotic plaques. Curr. Opin. Lipidol. 2009; 20(5):.370—8.
39. Mosser D.M., Edwards J.P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Rev. Immunol. 2008; 8(12): 958—69.
40. Dobaczewski M., de Haan J.J., Frangogiannis N.G. The extracellular matrix modulates fibroblast phenotype and function in the infarcted myocardium. .J. Cardiovasc. Transl. Res. 2012; 5(6): 837—47.
41. Anzai A., Anzai T., nagai S., Maekawa Y., nito K., Kaneko H. et al. Regulatory role of dendritic cells in postinfarction healing and left ventricular remodeling. Circulation. 2012; 125(10): 1234—45.
Поступила 04.06.16 Принята в печать 16.08.16
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 612.112.95.017.1:577.27.083.3
Сахно Л.В., Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Останин А.А., Черных Е.Р.
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИММУНОСУПРЕССОРНОЙ АКТИВНОСТИ М2-МАКРОФАГОВ
ФГБНУ «НИИ фундаментальной и клинической иммунологии», 630099, г Новосибирск
Макрофаги относятся к клеткам врожденного иммунитета и играют важную роль в защите организма от патогенного воздействия, поддержании тканевого гомеостаза (элиминации стареющих, опухолевых и поврежденных клеток) и процессах заживления. Анализ данных литературы позволяет вычленить как минимум два функциональных типа макрофагов — классические провоспалительные и противовоспалительные макрофаги, получившие название М1- и М2-клеток соответственно. М1- и М2-клетки имеют фенотипические особенности и характерный для каждого типа цитокиновый профиль. М2-макрофаги, генерируемые в условиях дефицита ростовых факторов, обладают повышенной цитотоксической и цитостатической активностью по сравнению с М1-клетками. Причем из 4 анализируемых коингибиторных и проапоптогенных молекул (B7-H1, CD206, TRIAL, FasL) ведущую роль в реализации цитотоксического эффекта играет молекула B7-H1, нейтрализация которой снижает апоптозиндуцирующую активность М2-клеток. Блокирование других молекул не влияет на способность М2-клеток индуцировать апоптоз Т-лимфоцитов. В то же время блокирование CD206 и TRAIL оказывает умеренный, но значимый подавляющий эффект на цитостатическую активность М2-клеток.
Ключевые слова: макрофаги; функциональная дихотомия; фенотип; проапоптогенная и цитостатическая активность.
Для цитирования: Сахно Л.В., Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Молекулярные механизмы иммуносупрессорной активностиМ2-макрофагов. Иммунология. 2016; 37(6): 311-315. DOI: 10.18821/0206-49522016-37-6-311-315
Для корреспонденции: Сахно Людмила Васильевна, канд. биол. наук, E-mail: [email protected]
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Sakhno L.V., Shevela E.Ya., Tikhonova M.A., Ostanin A.A., Chernykh E.R.
MOLECULAR MECHANISMS OF M2 MACROPHAGE IMMUNOSUPPRESSIVE ACTIVITY
«Scientific research Institute of fundamental and clinical immunology», 630099, Novosibirsk
Macrophages are cells of innate immunity and play an important role in protecting the body from pathogenic exposure, the maintenance of tissue homeostasis (elimination of ageing, neoplastic and damaged cells) and the healing process. Analysis of literature data allows to isolate at least two functional type macrophages — the classic proinflammatory and anti-inflammatory macrophages called M1 and M2 cells, respectively. M1 and M2 cells have phenotypic features and characteristics for each type cytokine profile. M2-macrophages generated in the conditions of deficiency of growth factors, have high cytotoxic and cytostatic activity compared with M1 cells. And of the 4 analyzed coinhabiting and proapoptotic molecules (B7-H1, CD206, TRIAL, FasL) leading role in the implementation of the cytotoxic effect plays a molecule B7-H1 neutralization which reduces apoptosisinducing activity of M2 cells. Blocking other molecules does not affect the ability of M2 cells to induce apoptosis of T-lymphocytes. At the same time blocking CD206 and TRAIL has a mild but significant suppressive effect on cytotoxic activity of M2 cells.
Keywords: macrophages; functional dichotomy; phenotype; proapoptotic and cytotoxic activity.
For citation: Sakhno L.V., Shevela E.Ya., Tikhonova M.A., Ostanin A.A., Chernykh E.R. Molecular mechanisms ofm2 macrophage immunosuppressive activity. Immunologiya.2016; 37(6): 311-315. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-311-315
For correspondence: SakhnoLuydmila Vasil'evna, Cand. biol. Sci., E-mail: [email protected].
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. This work was supported by RFBR grant No. 13-04-00113.
Received 25.02.15 Accepted 16.08.16
введение
Макрофаги (Мф) являются пластичными клетками, которые могут проявлять как провоспалительные (М1-фенотип), так и противовоспалительные (М2-фенотип) свойства [1, 2]. Функциональный тип Мф во многом определяется условиями активации. Так, при классической активации липополисахари-дом (LPS) в сочетании с IFN-y Мф приобретают провоспалительные свойства М1-фенотип. В свою очередь при активации IL-4/IL-13, а также в присутствии IL-10, иммунных комплексов, дексаметазона и витамина D3 индуцируется М2-фенотип [2—4]. У человека дифференцировка моноцитов в М2-клетки индуцируется с помощью M-CSF (в отличие от GM-CSF, который индуцирует созревание М1-клеток) [5]. Кроме того, сигналом к переключению М1-фенотипа на М2 может являться фагоцитоз макрофагами апоптотических клеток [6].
М1-макрофаги обладают выраженной цитотоксической, антимикробной и антипролиферативной активностью, опосредованной продукцией активных метаболитов кислорода, нитро-оксида и провоспалительных цитокинов. Они играют важную роль в защите от внутриклеточных патогенов и элиминации опухолевых клеток, однако при патологии могут оказывать тканедеструктивное действие. Макрофаги с М2-фенотипом, напротив, ограничивают воспалительный/иммунный ответ и стимулируют процессы тканевой репарации, участвуют в формировании иммунологической толерантности при беременности и опухолевом росте [4, 7, 8]. Несмотря на важную роль М2 в норме и при патологии, механизмы супрессорной активности М2-макрофагов остаются малоизученными. Традиционно иммуносупрессорную активность М2-клеток связывают со сниженной продукцией провоспалительных и повышенным уровнем противовоспалительных цитокинов [5]. В то же время значение поверхностных молекул, способных опосредовать прямое цитотоксическое и/или цитостатическое действие макрофагов, остается практически неисследованным.
Ранее нами было показано, что генерация Мф в условиях дефицита ростовых/сывороточных факторов позволяет получить популяцию М2-клеток, которые отличаются от М1 повышенной экспрессией не только М2-ассоциированных (CD206), но и проапоптогенных молекул — B7-H1, FasL и TRAIL [9]. Генерируемые М2-клетки обладали более низкой способностью стимулировать пролиферацию аллогенных Т-клеток, при этом аллостимуляторная активность обратно коррелировала с экспрессией CD206, CD200R и TRAIL [9]. Эти данные позволили предположить, что низкая пролиферация Т-лимфоцитов
в присутствии М2-клеток в алло-СКЛ может быть обусловлена прямым цитотоксическим и/или цитостатическим эффектом М2-макрофагов, опосредованным повышенной экспрессией коингибиторных и/или проапоптогенных молекул.
Целью настоящей работы являлась оценка пролифера-тивной активности и уровня апоптоза Т-лимфоцитов в СКЛ, индуцированной М1- и М2-клетками, а также исследование влияния нейтрализующих антител против TRAIL, CD206, FasL, B7-H1 на цитотоксическую и цитостатическую активность М2-макрофагов.
Материал и методы
В исследование были включены 50 здоровых доноров крови в возрасте от 25 до 40 лет. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из гепаринизированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина. Для получения моноцитов МНК в концентрации 3—5 • 106/мл помещали в 6-луночные планшеты (TPP, Switzerland) в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Germany) с 5% FCS (Биолот, РФ) на 18 ч в СО2-инкубаторе, после чего удаляли фракцию не прилипших к пластику клеток. Относительное содержание CD14+-моноцитов во фракции прилипающих МНК составляло 93—95%. Макрофаги М1-типа генерировали из прилипающей фракции МНК в полной культуральной среде RPMI-1640, дополненной 0,05 mM 2-меркапэтанола, 2 mM пирувата натрия, 0,3 мг/мл L-глютамина (все реактивы Sigma-Aldrich), 1% раствора незаменимых аминокислот, 100 мкг/мл гентамицина в присутствии рекомбинантного GM-CSF человека (rhGM-CSF, 50 нг/мл, R&D Systems), 5% аутоплазмы и 2% FCS в течение 7 сут при 37 °C и 5% CO2. Макрофаги М2-типа генерировали в аналогичных условиях в полной культуральной среде в присутствии GM-CSF (50 нг/мл) и 2% аутоплазмы, т. е. на фоне депривации ростовых/сывороточных факторов.
Для оценки способности Мф стимулировать пролиферацию Т-клеток оценивали интенсивность пролиферативного ответа в алло-СКЛ. В качестве отвечающих клеток использовали МНК доноров (0,1 • 106/лунку), стимуляторами служили аллогенные М1- или М2-клетки в соотношении МНК:Мф = 10:1. Пролиферативный ответ в СКЛ оценивали на 5-е сутки радиометрически по включению 3Н-тимидина (1 мкК/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования. Индекс влияния МФ (ИВМФ) в СКЛ рассчитывали как отношение пролиферативного ответа МНК в присутствии Мф к уровню спонтанной пролиферации МНК.
ORIGINAL ARTICLE
Количество пролиферирующих Т-клеток (в S, G2/M^a3e клеточного цикла) оценивали в 2-суточной алло-СКЛ методом двухцветной проточной цитометрии с использованием йодистого пропидия (PI). Для оценки ранних стадий апопто-за клетки метили анти-CD3 антителами и далее инкубировали с аннексином (An) и йодистым пропидием (Fitc Annexin V Apoptosis Detection Kit, BD) с последующим определением относительного количества CD3+An+PI- клеток (ранний апоп-тоз). Общее количество апоптотических клеток оценивали по суммарному количеству An+PI- и An+PI+ (CD3+An+-клетки).
Влияние нейтрализующих антител в СКЛ исследовали путем добавления анти-Б7-Ш (eBioscience, BD), анти-CD206 (BioLegend, Germany), анти-TRAIL (Abcam, USA), анти-FasL (BioLegend, Germany) антител в концентрации 3 мкг/мл.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ Statistica 6.0. Данные представлены в виде средних значений (М) и стандартной ошибки (S.E.), а также в виде медианных значений и квартиль-ного диапазона (LQ—UQ, 25—75% квартили). При сравнении вариационных рядов использовали непараметрический критерий Вилкоксона для связанных (парных) выборок.
результаты и обсуждение
Сравнительная оценка М1- и М2-клеток, генерируемых из МНК одних и тех же доноров, показала, что полученные в условиях дефицита ростовых факторов М2-клетки действительно отличались более низкой аллостимуляторной активностью (см. рисунок). Так, пролиферативный ответ аллоген-ных Т-лимфоцитов, индуцированный в СКЛ в присутствии М2-макрофагов, был в 1,7 раза ниже, чем в присутствии М1-клеток (5260 ± 980 vs 8919 ± 1340 имп/мин; pU = 0,0005). Различия также выявлялись при сравнении индексов влияния М2- и М1-клеток: 15,1 ± 3,4 vs 25,7 ± 3,9 расч. ед. соответственно (p = 0,0006).
Исследование уровня апоптоза Т-клеток в алло-СКЛ, индуцированной М1- и М2-клетками, показало, что М2-макрофаги обладали более высокой апоптоз-индуцирующей активностью (табл. 1). Количество Т-клеток в стадии раннего апоп-тоза и общее количество апоптотических клеток в алло-СКЛ в присутствии М2-клеток было достоверно выше, чем в СКЛ, индуцированной М-1 клетками. В СКЛ, индуцированной М2-макрофагами, Т-лимфоциты также характеризовались меньшим содержанием пролиферирующих клеток по сравнению с культурами, СКЛ в присутствии М1-макрофагов, однако различия были статистически недостоверны (табл. 1).
Чтобы выяснить, через какие сигнальные пути реализуется повышенная цитотоксическая и/или цитостатическая активность М2-макрофагов в культурах алло-СКЛ, были использованы нейтрализующие антитела против проапоптогенных (FasL, TRAIL) и коингибиторных (B7-H1, CD206) молекул, повышенная экспрессия которых была нами ранее выявлена на М2-клетках. Из данных табл. 2 видно, что добавление в культуры СКЛ анти-Б7-H1 антител приводило к статистически достоверному ослаблению проапоптогенной активности М2-макрофагов. Это проявлялось снижением уровня Т-клеток в стадии раннего апоптоза, а также общего количества апоптотических Т-клеток. При этом эффект нейтрализующих анти-Б7-H1 антител обнаруживался в 100% случаев. Добавление анти-Б7-H1 антител влияло также на цитоста-тическую активность М2-макрофагов, что проявлялось увеличением числа пролиферирующих CD3+ Т-лимфоцитов — с 20,9 ± 5,3 до 26,4 ± 4,5% (в S.G2/M фазе цикла). Несмотря на то что данный эффект регистрировался в виде отчетливой тенденции (p = 0,07), стимулирующее действие регистрировалось в 87% случаев, т. е. в 7 из 8 тестированных культур.
AKm-CD206, анти-TRAIL и анти-FasL антитела не оказывали значимого влияния на проапоптогенную активность М2-макрофагов (табл. 3). Относительное содержание Т-клеток в ранней стадии апоптоза (CD3+ An+ PI-) и общее
количество апоптотических клеток (CD3+An+) в присутствии нейтрализующих антител достоверно не изменялось. В то же время добавление в культуры алло-СКЛ анти-CD206 и анти-TRAIL антител (но не анти-FasL антител) сопровождалось статистически значимым увеличением числа пролиферирующих Т-лимфоцитов. При этом стимулирующий эффект анти-CD206 антител проявлялся в 100% случаев, а количество делящихся Т-клеток увеличивалось в среднем на 29 ± 8%. Эффект анти-TRAIL антител был менее выраженным, поскольку отчетливо регистрировался только в 8 из 11 исследованных культур (в 73% случаев), а величина эффекта составляла в среднем 14 ± 6%.
Суммируя полученные в настоящей работе данные, можно заключить, что М2-макрофаги, генерируемые в условиях дефицита ростовых факторов, обладают повышенной цито-токсической и цитостатической активностью по сравнению с М1-клетками. При этом из четырех анализируемых коингибиторных и проапоптогенных молекул (B7-H1, CD206, TRAIL, FasL) ведущую роль в реализации цитотоксического эффекта играет молекула B7-H1, нейтрализация которой снижает апоптоз-индуцирующую активность М2-клеток. Блокирование других молекул не влияет на способность М2-клеток индуцировать апоптоз Т-лимфоцитов. В то же время блокирование CD206 и TRAIL оказывает умеренный, но значимый, подавляющий эффект на цитостатическую активность М2-клеток. Таким образом, снижение пролиферации Т-клеток в культурах с М2-макрофагами по сравнению с уровнем ответа в культурах с М1 сопряжено с повышенной экспрессией М2-клетками коингибиторных и проапоптогенных молекул, обусловливающих более высокий цитотоксический и цито-статический потенциал М2-макрофагов.
Супрессорную активность М2-клеток наиболее часто связывают с повышенной продукцией противовоспалитель-ных/иммуносупрессивных цитокинов. При этом в зависимости от получаемого сигнала М2-клетки могут различаться по спектру продуцируемых цитокинов [10]. М2-клетки человека, генерированные в присутствии M-CSF, характеризуются высокой продукцией IL-10 на фоне низкой продукции IL-12, IL-1P, IL-6, TNFa в ответ на стимуляцию LPS, микобактери-альными антигенами, зимозаном A или IFN- в комбинации с CD40L [11]. В экспериментальных исследованиях на мышах продемонстрировано, что макрофаги, генерированные в присутствии IL-10/TGFp, отличаются высоким уровнем продукции IL-10 и TGFP [12].
Проведенный нами ранее протеомный анализ цитокинов, секретируемых М1- и М2-клетками, показал, что М2-клетки,
12 000
j
CD Q.
аз €■
s §
Q.
С
9000
6000
3000
X
МНК +M1 +M2
+M1 +M2
г 40
S
-30 с;
£
к
-20 X к
- 10 х ф
Ч.
S
г 0
Аллостимуляторная активность М1 и М2 макрофагов. МНК доноров (0,1 • 106/лунку; п = 16) культивировали в течение 2 суток в отсутствии (контроль) и в присутствии аллогенных М1 и М2 клеток в соотношении 10:1. Индекс влияния Мф в СКЛ рассчитывали как отношение пролиферативного ответа МНК в присутствии Мф к уровню спонтанной пролиферации МНК.
Данные представлены в виде М ± S.E. * — достоверность различий по критерию Вилкоксона для связанных выборок (рп < 0,01).
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 1
влияние макрофагов на апоптоз и клеточный цикл Т-лимфоцитов в 2-суточной алло-сКЛ
Показатель
М1
М2
P,
«Ранний» апоптоз 14,9 ± 2,7 (10) 18,3 ± 2,5 (10) 0,015
CD3+An+P^ клетки (%)
Общее число апоп- 15,8 ± 2,7 (10) 20,3 ± 2,7 (10) 0,007 тотических Т-клеток (CD3+An+) (%)
Пролиферирующие 35,1 ± 6,2 (8) 31,9 ± 6,5 (8) 0,16 CD3+Т-клетки в S,G2/M-фазе цикла (%)
Примечание. Данные представлены в виде средних значений (М) и стандартной ошибки ^.Е.). В скобках указано число наблюдений. рц - достоверность различий (по критерию Вилкоксона для связанных выборок).
полученные в условиях дефицита ростовых факторов, отличаются от М1 более низкой продукцией иммунорегуляторных и провоспалительных цитокинов/хемокинов (IFN-y, IL-5, IL-6, TNFa, IL-17, MCP-1). При этом секреция иммуносупрессор-ных цитокинов была либо не изменена (IL-10), либо также снижена (IL-13) [9]. Полученные данные позволяют заключить, что одной из причин низкой пролиферативной активности Т-клеток в СКЛ, индуцированной М2-макрофагами, является не столько гиперпродукция IL-10/IL-13, сколько дефицит секреции иммунорегуляторных и провоспалительных цитоки-нов. В настоящей работе показано, что иммуносупрессорный эффект М2-клеток связан также с их прямым цитотоксическим и цитостатическим действием, опосредованным повышенной экспрессией коингибиторных и проапоптогенных молекул.
В литературе имеются единичные сообщения о возможной роли проапоптогенных молекул в реализации супрес-сорной активности макрофагов. Так, иммуносупрессорная активность опухоль-инфильтрирующих макрофагов может быть связана с проапоптогенной активностью этих клеток, обусловленной повышенной экспрессией B7-H4 под действием IL-6 и IL-10 [13]. Manrique с соавт. продемонстрировали у мышей существование субпопуляции Foxp3+ Мф, экспрес-сирующих проапоптогенные молекулы (TRAIL, CD200R, B7-H1, B7-H4) и способных ингибировать иммунный ответ и индуцировать апоптоз клеток [14]. Существуют сведения о цитостатической активности CD123+ миелоидных дендритных клеток по отношению к клеткам опухоли, которая опосредуется с помощью цитоплазматического TRAIL [15].
Таблица 2
влияние анти-B7-H1 антител на проапоптогенную и цитостати-ческую активность М2 макрофагов в 2-суточной алло-сКЛ
Показатель
М2 (контроль) М2 + анти-В7-Н1 P
«Ранний» апоптоз 13,3 ± 1,8 9,2 ± 0,7 0,018
Ап+Р1^3+Т-клетки (%)
Общее количество 15,4 ± 1,7 11,1 ± 0,8 0,018
апоптотических клеток An+CD3+ (%)
CD3+Т-клетки в 20,9 ± 5,3 26,4 ± 4,5 0,07
S,G2/M фазе цикла (%)
Примечание. МНК-доноров (0,Ы06/лунку; и=8) культивировали 2 сут с аллогенными М2-клетками в соотношении 10:1 в отсутствие (контроль) и присутствии нейтрализующих антител против В7-Н1 (анти-В7-Н1) в концентрации 3 мкг/мл. Данные представлены в виде М ± S.E. рц - достоверность различий (по критерию Вилкоксона для связанных выборок).
Таблица 3
влияние анти-CD206, анти-TRAIL и анти-FasL-нейтрализующих антител на проапоптогенную и цитостатиче-скую активность М2-макрофагов в 2-суточной алло-сКЛ
Антитела
Параметр
М2 (контроль) М2+антитела
Анти-
CD206
(«=11)
Анти-
TRAIL
(«=11)
Анти-FasL (n=16)
An+PI-CD3+(%) An+CD3+ (%)
CD3+Т-клетки в S,G2/M фазе цикла (%)
An+PI-CD3+(%)
An+CD3+ (%)
CD3+Т-клетки в S,G2/M фазе цикла (%)
An+PI-CD3+ (%)
An+CD3+ (%)
CD3+Т-клетки в S,G2/M фазе цикла (%)
16,7 ± 1,8
18.4 ± 1,6
27.5 ± 2,8
20.6 ± 1,8 22,3 ± 1,9
42.1 ± 4,1
17,9 ± 1,9
18.2 ± 1,7 24,5 ± 4,4
15,8 ± 1,8 17,3 ± 1,7
33,6 ± 2,2**
21 ± 1,7
23 ± 1,6 47 ± 4,0*
17,3 ± 1,9
17.5 ± 1,8
21.6 ± 4,1
Примечание. МНК доноров (0,1-106/лунку) культивировали 2 сут c аллогенными М2-клетками в соотношении 10:1 в отсутствие (контроль) и в присутствии нейтрализующих антител против CD206 (анти-СЭ206), TRAIL (анти-TRAIL), FasL (анти-FasL) в концентрации 3 мкг/мл. Данные представлены в виде М ± S.E. *, ** - достоверность различий по критерию Вилкоксона для связанных выборок (Рц<0,05 и Рц<0,01 соответственно).
Заключение
Полученные нами результаты показали, что цитоток-сическая/цитостатическая активность лежит в основе им-муносупрессивной активности М2-клеток, генерируемых в условиях дефицита ростовых факторов, при этом проа-поптогенная активность генерируемых в этом случае М2-макрофагов обусловлена в первую очередь молекулой В7-Н1. Негативная регуляция Т-клеток через активацию РБ-1/ РВ^1(В7-Н1) пути обсуждается при многих иммунопатологических заболеваниях — опухолевом росте, аутоиммунных заболеваниях, бактериальных, вирусных и паразитарных инфекциях [16—19]. Также показано, что повышенная экспрессия В7-Н1 регистрируется не только на опухолевых клетках [16], но и на антигенпрезентирующих клетках, включая моноциты [20, 21], дендритные клетки [22] и макрофаги [23]. При этом блокирование В7-Н1-опосредуемого сигнала на антигенпрезентирующих клетках приводит к снижению продукции ]Ь-10 и усилению их аллостимуляторной активности и секреции ^-12. [24]. Запуск продукции противовоспалительных цитокинов (]Ь-10) и подавление секреции провоспалительных цитокинов в макрофагах может также опосредоваться через активацию маннозных рецепторов [25, 26]. Поэтому выявленное нами увеличение числа про-лиферирующих Т-клеток в СКЛ в присутствии анти-В7-Н1 и анти-СБ206 антител может быть связано с ингибирова-нием продукции ]Ь-10 при блокировании В7-Н1- и СБ206-ассоциированных сигнальных путей.
Относительно возможных механизмов индукции М2-клеток в условиях дефицита ростовых факторов можно полагать, что в условиях депривации возрастает количество апоптотических лимфоцитов, поглощение которых, согласно данным литературы, индуцирует переключение в сторону М2-макрофагов. Однако данное предположение требует дальнейших экспериментальных подтверждений.
В целом проведенные нами исследования расширяют существующие представления о молекулярных механизмах иммуномодулирующей активности М2-макрофагов и обосновывают необходимость дальнейших исследований роли коингибиторных и проапоптогенных молекул в регуляции
взаимодействий между М2-макрофагами и активированными Т-лимфоцитами.
Финансирование. Работа поддержана грантом РФФИ № 13-04-00113-а.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература
9. Сахно Л.В., Тихонова М.А., Шевела Е.Я., Тыринова Т.В., Лепли-на О.Ю., Останин А.А. и др. Фенотипические и функциональные особенности М2-подобных макрофагов человека. Бюллетень СО РАМН. 2014; 34(4): 18—24.
references
1. Cassetta L., Cassol E., Poli G. Macrophage polarization in health and disease. Sci. World J. 2011; 11: 2391—402.
2. Gordon S. Alternative activation of macrophages. Nature Reviews. 2002; 3: 23—35.
3. Martinez F.O., Sica A., Mantovani A., Locati M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 2008; 13(2): 453—61.
4. Vega M.A., Corbi A.L. Human macrophage activation: too many functions and phenotypes for a single cell type. Immunologia. 2006; 25(4): 248—72.
5. Verreck F.A., de Boer T., Langenberg D.M., Hoeve M.A., Kramer M., Vaisberg E. et al. Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco) bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101(13): 4560—5.
6. Fadok V.A., Bratton D.L., Konowal A., Freed P.W., Westcott J.Y., Henson P.M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/paracrine mechanisms involving TGF-beta, PGE2, and PAF. J. Clin. Invest. 1998; 101: 890—8.
7. Nagamatsu T., Schust D.J. The contribution of macrophages to normal and pathological pregnancies. Am. J. Reprod. Immunol. 2010; 63(6): 460—71.
8. Sica A., Bronte V. Altered macrophage differentiation and immune dysfunction in tumor development. J. Clin. Invest. 2007; 117(5): 1155—66.
9. Sakhno L.V., Tikhonova M.A., Shevela E.Ya., Tyrinova T.V., Lep-lina O.Yu., Ostanin A.A. et al. Phenotypic and functional features of human M2-like macrophages. Byulleten'SO RAMN. 2014; 34(4): 18—24. (in Russian)
10. Mantovani A., Biswas S.K., Galdiero M.R., Sica A., Locati M. Macrophage plasticity and polarization in tissue repair and remodeling. J. Pathol. 2013; 229: 176—85.
11. Verreck F.A.W., de Boer T., Langenberg D.M.L., van der Zanden L., Ottenhoff T.H.M. Phenotypic and functional profiling of human proinflammatory type-1 and anti-inflammatory type-2 macrophages in response to microbial antigens and IFN- and CD40L-mediated co-stimulation. J. Leukoc. Biol. 2006; 79: 285—93.
12. Cao Q., Wang Y., Zheng D., Sun Y., Wang Y., Lee V.W.S. et al. IL-10/ TGF^-modified macrophages induce regulatory T cells and protect
ORIGINAL ARTICLE
against Adriamycin nephrosis. J. Am. Soc. Nephrol. 2010; 21(6): 933—42.
13. Kryczek I., Zou L., Rodriguez P., Zhu G., Wei S., Mottram P. et al. B7-H4 expression identifies a novel suppressive macrophage population in human ovarian carcinoma. J. Exp. Med. 2006; 203(4): 871—81.
14. Manrique S.Z., Correa M.A.D., Hoelzinger D.B., Dominguez A.L., Mirza N., Lin H.-H. et al. Foxp3-positive macrophages display immunosuppressive properties and promote tumor growth. J. Exp. Med. 2011; 208(7): 1485—99.
15. Shi J., Ikeda K., Maeda Y., Shinagava K., Ohtsuka A., Yamamura H. et al. Identification of CD123+ myeloid dendritic cells as an early-stage immature subset with strong tumoristatic potential. Cancer Letters. 2008; 270(1): 19—29.
16. Curiel T.J., Wei S., Dong H., Alvarez X., Cheng P., Mottram P. et al. Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity. Nat. Medicine. 2003; 9(5): 562—7.
17. Sharpe A.H., Wherry E.J., Ahmed R., Freeman G.J. The function of programmed cell death 1 and its ligands in regulating autoimmunity and infection. Nat. Immunology. 2007; 8(3): 239—45.
18. Wilcox R.A., Feldman A.L., Wada D.A., Yang Z-Z., Comfere N.I., Dong H. et al. B7-H1 (PD-L1, CD274) suppresses host immunity in T-cell lymphoproliferative disorders. Blood. 2009; 114(10): 2149—58.
19. Ye P., Weng Z.-H., Zhang S-L. Zhang J.-A., Zhao L., Dong J.-H. et al. Programmed death-1 expression is associated with the disease status in hepatitis B virus infection. Word J. Gastroenterol. 2008; 14: 4551—7.
20. Schreiner B., Mitsdoerffer M., Kieseier B.C., Chen L., Hartung H.P., Weller M. et al. Interferon-в enhances monocyte and dendritic cell expression of B7-H1 (PD-L1), a strong inhibitor of autologous T-cell activation: relevance for the immune modulatory effect in multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 2004; 155(1—2): 172—82.
21. Trabattoni D., Saresella M., Biasin M., Boasso A., Piacentini L., Ferrante P. et al. B7-H1 is upregulated in HIV infection and is a novel surrogate marker of disease progression. Blood. 2003; 101(7): 2514—20.
22. Sakhno L.V., Tikhonova M.A., Tyrinova T.V., Shevela E.Ya., Leplina O.Yu., Nikonov S.D. et al. Cytotoxic activity of dendritic cells as a possible mechanism of negative regulation of T lymphocytes in pulmonary tuberculosis. Clin. Dev. Immunol. 2012; 2012: 628635. doi: 10.1155/2012/628635.
23. Smith P., Walsh C.M., Mangan N.E., Fallon R.E., Sayers J.R., McKenzie A.N.J. Schistosoma mansoni worms induce energy of T cells via selective upregulation of programmed death ligand 1 on macrophages. J. Immunol. 2004; 173(2): 1240—8.
24. Chen L., Zhang Z., Chen W., Zhang Z., Li Y., Shi M. et al. B7-H1 up-regulation on myeloid dendritic cells significantly suppresses T cell immune function in patients with chronic hepatitis B. J. Immunol. 2007; 178(10): 6634—41.
25. Allavena P., Chieppa M., Bianchi G., Solinas G., Fabbi M., Laskarin G. et al. Engagement of the mannose receptor by tumoral mucins activates an immune suppressive phenotype in human tumor-associated macrophages. Clin. Dev. Immunol. 2010; 2010: 547179. doi:10.1155/2010/547179.
26. Guirado E., Schlesinger L.S., Kaplan G. Macrophages in tuberculosis: friend or fol. Semin. Immunopathol. 2013; 35(5): 563—83.
Поступила 25.02.15 Принята к печати 16.08.16
