CC BY
58
БИОЛОГИЯ
УДК 612.57
МОЛЕКУЛЯРНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГЕПАРИНА С ПЧЕЛИНЫМ ЯДОМ И ЕГО КОМПОНЕНТАМИ IN VITRO
© 2009 г. А.Е. Хомутов, М.Б. Звонкова, К.А. Пурсанов,
З.В. Перепелюк, А.Г. Бутылин
Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
Поступила в редакцию 15.10.2009
Фото колориметрическими исследованиями, изучением спектров поглощения в УФ-области и видимой части спектра показано, что в растворе происходит взаимодействие гепарина с пчелиным ядом и мелиттином. Фосфолипаза А2 in vitro с гепарином не взаимодействует. Введение в состав растворителя солей натрия, калия, кальция и серебра сопровождается увеличением оптической плотности. При исследовании в видимой части спектра показано, что пчелиный яд вытесняет метиленовый синий из комплексных соединений с гепарином.
Ключевые слова: гепарин, яд пчелы, фотоколориметрия.
Введение
Актуальной задачей современной физиологии является выяснение роли эндогенных физиологически активных веществ в регуляции различных функций организма. Одним из важных биорегуляторов является гепарин, играющий особую роль в поддержании гомеостаза. Диапазон физиологического действия гепарина чрезвычайно широк. Показано, что гепарин кроме антикоагу-лянтной активности способен стимулировать функцию системы мононуклеарных фагоцитов, ограничивать локальные воспалительные реакции, понижать содержание в крови холестерола и триглицеридов [1], повышать уровень нуклеиновых кислот [2], изменять активность различных ферментов, например повышать активность лак-татдегидрогеназной реакции [3].
Хорошо установленным фактом является способность гепарина к взаимодействию с широким спектром белков, пептидов, ферментов [4-7].
Важная роль отводится изучению взаимодействия гепарина с различными фармакологическими агентами и лекарственными средствами, в том числе и с пчелиным ядом [8-16].
Материалы и методы
В работе использовали гепарин (АО «Курган»), содержащий 5000 МЕ в 1 мл, протамин
сульфат (1%-ный раствор), пчелиный яд, полученный сотрудниками кафедры физиологии и биохимии человека и животных ННГУ в полевых условиях, мелиттин и фосфолипазу, полученные из Института биоорганической химии (Москва). Для спектрофотометрических исследований использовали сухой гепарин (производство Франция), содержащий 130 МЕ в 1 мг, разведенный в дистиллированной воде или фосфатном буфере (рН 7.2).
Взаимодействие гепарина с пчелиным ядом и его компонентами in vitro изучали фотоколо-риметрическим методом, а также по изменению спектров поглощения данных веществ и их смесей в УФ- и видимой области. Колориметриро-вание осуществляли на фотоэлектроколориметре КФК-3 при синем светофильтре (400 нм). При исследовании физико-химических свойств исследуемых веществ и их смесей было сделано 210 проб.
Измерения спектров поглощения проводили на установке, функционально идентичной однолучевому спектрофотометру. Установка включала в себя источник света (водородная лампа или лампа накаливания), монохроматор МДР-12 с шаговым двигателем, синхронный детектор, светоприемную камеру, в которой размещались кварцевые кюветы с растворами, и фотоумножитель, подключенный к ЭВМ для автоматической регистрации данных. Иссле-
дуемые вещества растворяли в фосфатном буфере (рН 7.2) или в дистиллированной воде, экстинкцию растворов измеряли относительно растворителей.
Кроме того, изучали изменение спектров поглощения в видимой области (400-700 нм) смеси гепарина и катионового тиазинового красителя (метиленового синего) при добавлении пчелиного яда. К серии пробирок, содержащих по 10 мл раствора метиленового синего (1.9-10-5 моль/л) и гепарин в возрастающих концентрациях (от 0 до 1.8 МЕ/мл), добавляли по 0.2 мл пчелиного яда в концентрации 0.5-1 мг/мл. Экстинкцию растворов измеряли при длине волны 556 и 664 нм.
Результаты обрабатывали с помощью программы «Биостатистика» с использованием критерия Стьюдента, в случае множественных сравнений вводили поправки [17].
Результаты и их обсуждение
Ранее в работе А.Е. Хомутова [18] было показано, что гепарин взаимодействует с пчелиным ядом in vitro с образованием нефелометри-ческих соединений, причем наибольшее увеличение экстинкции наблюдается при оптимальном соотношении компонентов смеси гепарин -яд. Поэтому на первом этапе экспериментов была поставлена задача выяснить это соотно-
шение для данных образцов гепарина и яда (рис. 1).
При концентрации пчелиного яда 1 мг/мл максимальное светопоглощение смеси наблюдалось при содержании гепарина 30 МЕ/мл; при увеличении или уменьшении количества гепарина экстинкция смеси снижалась. Два гораздо менее выраженных пика наблюдались при содержании гепарина 5 и 80 МЕ/мл (рис. 1). При фиксированной концентрации гепарина в растворе (30 МЕ/мл) и возрастающих концентрациях пчелиного яда экстинкция смеси закономерно возрастала, более быстро до концентрации яда 1 мг/мл и затем практически линейно.
Следовательно, наиболее эффективное взаимодействие наблюдалось в смеси, содержащей 30 МЕ гепарина на 1 мг пчелиного яда. Измерения проводили при зеленом (530 нм) и синем (400 нм) светофильтре; поскольку в последнем случае чувствительность была выше, то все последующие эксперименты по фотоколориметрии проводили при 400 нм.
Чтобы проверить, остался ли гепарин в растворе после взаимодействия с пчелиным ядом, образовавшуюся взвесь осаждали центрифугированием и определяли гепарин в надосадочной жидкости по его взаимодействию с протамин сульфатом. Полученные значения экстинкции соотносили с предварительно построенной калибровочной кривой. Выяснили, что получен-
- длина волны 400 нм
Концентрация гепарина, МЕ/мл
Рис. 1. Экстинкция смеси гепарина и пчелиного яда при концентрации пчелиного яда 1 мг/мл, гепарина от 5 до 200 МЕ/мл
ная взвесь осаждается центрифугированием наиболее полно, когда на 30 МЕ гепарина приходится около 1 мг яда. При добавлении прота-мин сульфата к надосадочной жидкости максимальный прирост экстинкции наблюдался при малых концентрациях яда (0.1-0.5 мг/мл), эти значения соответствовали концентрации гепарина около 10-15 МЕ/мл по калибровочной кривой. При увеличении содержания яда содержание гепарина в надосадочной жидкости резко уменьшалось (до 5-6 МЕ/мл при концентрации яда 0.8 мг/мл), а при концентрации яда 1 мг/мл и выше гепарин в растворе определялся в следовых количествах (табл. 1).
Таким образом, результаты экспериментов позволяют заключить, что гепарин, так же как и пчелиный яд, расходуется в процессе реакции. Наиболее полно эти вещества взаимодействуют в соотношении 30 МЕ гепарина на 1 мг яда. Интересно отметить, что на величину оптической плотности влияет не только концентрация пчелиного яда и гепарина, но и ионный состав растворителя.
Оценка оптической плотности раствора ме-литтин - гепарин, при фиксированной концентрации мелиттина (1 мг/мл) и возрастающей концентрации гепарина (G.G5-5ССС МЕ/мл), показала, что как и в случае с пчелиным ядом, оптическая плотность при невысоких концентрациях гепарина возрастает до определённого максимума, а затем, с увеличением концентрации, оптическая плотность начинает снижаться. Оптимум взаимодействия мелиттина с гепарином лежит в области 5Q МЕ/мл гепарина при концентрации мелиттина І мг/мл (рис. 2).
При исследовании взаимодействия гепарина с различными веществами для доказательства комплексообразования in vitro в числе прочих физико-химических методов широко применяют анализ спектров поглощения веществ в УФ-области, поскольку изменения спектров исходных веществ в составе смеси свидетельствуют о модификации их химической структуры (возможном образовании химических связей, кон-формационных изменениях молекул и т. п.). Гепарин в фосфатном буфере (рН 7.2) в интервале
Таблица 1
Определение содержания гепарина в смеси пчелиный яд - гепарин с помощью протамин сульфата по экстинкции раствора (концентрация гепарина 30 МЕ/мл)
Условия эксперимета Концентрация пчелиного яда (мг/мл)
Q.1 Q.2 Q.5 Q.S 1.Q 2.Q 5.Q S.Q 1Q 2Q
Смесь гепарин - яд Q.Q3 Q.Q5 Q. 1 б Q.46 Q.64 Q.7Q 1.Q1 1.26 1.43 2.13
Надосадочная жидкость Q.Q2 Q.Q3 Q.11 Q.15 Q.Q2 Q.Q5 Q.13 Q.23 Q.2S Q.61
Надосадочная жидкость + протамин сульфат 1.2Q 1.3Q 1.23 Q.59 Q.Q3 Q.Q6 Q.11 Q.21 Q.23 Q.5Q
£
S
с
о
тно
о
пт
о
35
3о
25
2о
S 15
а
1о
ill ТІ
5
о
Рис. 2. Влияние гепарина на оптическую плотность раствора мелиттина. Концентрация гепарина (МЕ/мл): 1 -
0.05; 2 - 0.5; 3 - 5.0; 4 - 50; 5 - 500; 6 - 5000
200-300 нм имеет максимум поглощения при 210 нм (рис. 3).
Пчелиный яд, как и большинство веществ белковой природы, имеет два максимума поглощения в областях 207-210 и 225 нм, обусловленных вкладом пептидной связи, и слабую полосу поглощения в диапазоне 275-285 нм, характерную для ароматических аминокислот тирозина, фенилаланина и триптофана. Как и в случае с протамин сульфатом, добавление даже небольшого количества гепарина приводит к выраженному изменению спектра поглощения, а именно - к возрастанию экстинкции во всем исследуемом диапазоне длин волн (200-300 нм) (рис. 3).
По-видимому, увеличение оптической активности, так же как и образование нефеломет-рических соединений в смеси пчелиного яда и гепарина, можно объяснить укрупнением молекул в растворе при их химическом взаимодействии.
Мелиттин, основной компонент пчелиного яда, имеет практически такие же спектры поглощения в УФ-области, как и цельный пчелиный яд. При добавлении гепарина в разных концентрациях светопоглощение смеси возрастает. Однако, как и в случае фотоколориметри-ческих исследований цельного яда, это изменение экстинкции с увеличением содержания гепарина носит двухфазный характер. Наиболее
0.20 0.22 0.24- 0.26 0.28 0.30
Длина волны, мкм
Рис. 3. Спектры поглощения в УФ-области гепарина, пчелиного яда и их смеси: 1 - гепарин, 1.5 МЕ/мл; 2 - пчелиный яд, 0.05 мг/мл; 3 - смесь гепарина с пчелиным ядом, в тех же концентрациях
Длина волны, мкм
Рис. 4. Спектры поглощения в УФ-области гепарина, фосфолипазы А2 и их смеси: 1 - гепарин, 2 МЕ/мл; 2 - фос-фолипаза А2, 0.02 мг/мл; 3 - фосфолипаза А2, 0.02 мг/мл, и гепарин, 0.4 МЕ/мл; 4 - фосфолипаза А2, 0.02 мг/мл, и гепарин, 2 МЕ/мл
сильное увеличение экстинкции наблюдается при содержании мелиттина 0.02 мг/мл и гепарина 1.2 МЕ/мл, тогда как при увеличении или уменьшении количества гепарина в пробе это изменение не столь значительно.
Фосфолипаза А2 составляет 12% сухого веса пчелиного яда и имеет спектры поглощения в УФ-диапазоне, аналогичные мелиттину и цельному яду. Однако при добавлении гепарина в разных концентрациях не выявлено изменений оптической активности смеси по сравнению с исходными веществами (рис. 4).
Свойство катионовых красителей взаимодействовать с отрицательно заряженной молекулой гепарина с изменением спектра поглощения в видимом диапазоне позволяет использовать их для изучения комплексообразующих свойств гепарина [19].
Катионовый тиазиновый краситель метиленовый синий имеет максимальный пик поглощения при 664 нм. При увеличении содержания гепарина в смеси этот пик уменьшается, а в области 566 нм появляется новый пик, характерный для комплекса гепарин - метиленовый синий, - так называемое явление метахромазии.
Этот эффект основан на адсорбции красителя на поверхности отрицательно заряженной макромолекулы гепарина с образованием нековалентных (электростатических) связей. Агрегация красителя приводит к изменению спектров поглощения метиленового синего [20].
При добавлении веществ, взаимодействующих с гепарином, метиленовый синий вытесняется из комплекса с гепарином, и наблюдается уменьшение пика поглощения при 566 нм и восстановление максимума при 664 нм, характерного для чистого красителя. Добавление к смеси гепарина с метиленовым синим пчелиного яда в концентрации в 10 раз большей, чем протамин сульфат (1 мг/мл), вызывает еще более сильное изменение экстинкции смеси. В пробирках с исходной концентрацией гепарина 0.2-0.6 МЕ/мл наблюдаются спектры, характерные для чистого красителя, что свидетельствует о полном связывании гепарина в растворе, а при изначально более высоких концентрациях гепарина (0.8-1.8 МЕ/мл) происходит лишь частичное восстановление собственного спектра метиленового синего.
При добавлении к такой же серии пробирок с гепарином и метиленовым синим главного компонента пчелиного яда - мелиттина - в пропорции, приблизительно соответствующей его процентному содержанию в яде (0.05 мг/мл), получаются спектры, удивительно похожие на предыдущие, полученные при добавлении цельного яда. В то же время в аналогичных опытах добавление фосфолипазы А2 из пчелиного яда (0.5 мг/мл) приводило лишь к очень незначительному изменению экстинкции смеси, что свидетельствует о слабом взаимодействии фосфолипазы с гепарином или его отсутствии (рис. 5).
Концентрация гепарина, МЕ/мл
Рис. 5. Изменение экстинкции смеси гепарина с метиленовым синим (МС) при добавлении мелиттина и фосфо-липазы А2 пчелиного яда: 1 - смесь гепарина и МС, 664 нм; 2 - смесь гепарина и МС, 566 нм; 3 - смесь гепарина и МС с мелиттином, 664 нм; 4 - смесь гепарина и МС с мелиттином, 566 нм; 5 - смесь гепарина и МС с фосфо-липазой А2, 664 нм; 6 - смесь гепарина и МС с фосфолипазой А2, 566 нм
Таким образом, можно предполагать, что в растворе пчелиный яд и мелиттин взаимодействуют с гепарином, в результате чего образуется комплексное соединение, которое и увеличивает оптическую плотность. Как известно, мелиттин является низкомолекулярным полипептидом, в состав которого входят аргинин и лизин - аминокислоты, содержащие дополнительно группы NH2 , за счёт которых, видимо, происходит взаимодействие с высокосульфати-рованным гепарином, обладающим мощным отрицательным зарядом.
Исследования спектров поглощения в УФ-области и в видимой части спектра подтвердили предположение о том, что целый яд и мелиттин взаимодействуют с гепарином, а фосфолипаза А2, являющаяся одним из компонентов пчелиного яда, с гепарином не взаимодействует.
Заключение
Опираясь на полученные экспериментальные данные, можно сказать, что гепарин in vitro при взаимодействии с пчелиным ядом и мелит-тином увеличивает оптическую плотность раствора, причем максимальные значения изменения оптической плотности регистрируются при соотношении гепарин : яд = 1 : 0.5. Регистрация спектров поглощения в УФ-области и в видимой части спектра показала, что пчелиный яд и мелиттин вступают во взаимодействие с гепарином. Пчелиный яд, судя по спектрам поглощения в видимой части спектра, вытесняет метиленовый синий из комплексов с гепарином.
Список литературы
1. Грицюк А. И. Актуальные проблемы гемостаза. Молекулярно-биологические и физиологические аспекты. М.: Наука, 1979. 314 с.
2. Гущин И.С., Мирошников А.И., Мартынов В. И. Особенности гистамин-возбуждающего действия МСД-пептида из яда пчел // Бюлл. экспер. биологии и медицины. 1977. Т. 84, № 7. С. 78-80.
3. Орлов А. В., Зимин Ю. В., Мухина И. В., Козин Д. В., Плохов Р. А. Влияние гепарина на активность лактатдегидрогеназы кардиомиоцитов изолированного сердца крысы // Межвузовский сборник «Структура и регуляция биосистем». Нижний Новгород, 1999. 156 с.
4. Wang S.Z., Edmudson R., Zhu S.Z., Fakaha-ny E.E. Selective enhancement of antagonist ligand binding at muscarinic M2 receptors by heparin due to receptor uncoupling // Eur. J. Pharmacol. 1996. V. 18. P. 113118.
5. Wettreich A., Sebollela A., Carvalho M.A. et al. Acidic pH modulates the interaction between human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and
glycosaminoglycans // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. № 44. Р. 31468-31475.
6. Cai S., Dufner-Beattie J.L., Prestwich G.D. A selective protein sensor for heparin detection //Anal. Bio-chem. 2004. V. 326. № 1. Р. 33-41.
7. Liang A., Liu X., Du Y., Wang K., Lin B. Further characterization of the binding of heparin to granulocyte colony-stimulating factor: Importance of sulfate groups // Electrophoresis. 2008. V. 149. № 2. Р. 109-112.
8. Бакаринов П.В. Торможение гепарином седативного действия дроперидола // Межвузовский сборник «Регуляция и управление в биосистемах». Нижний Новгород, 1998. С. 130.
9. Бакаринов П.В., Хомутов А.Е., Зимин Ю.В. Влияние экзогенного гепарина на физическое состояние крыс через сутки после этанолового сна // Физиологические механизмы природных адаптаций. Материалы 3-го Всероссийского симпозиума. Иваново, 1999. С. 92-93.
10. Nabil Z.I. et al. Mechanism of action of honey bee (Apis mellifera L.) venom on different types of muscles // Hum. Exp. Toxicol. 1998. V. 17. N 3. P. 185-190.
11. Kakkar V.V., Welzel D., Murray W.J., Malone P., Jones D. Possible mechanism of the synergistic effect of heparin and dihydroergotamine // Am. J. Surg. 1985. V. 150. № 4. Р. 33-38.
12. Pereira-Rosario R., Utamura T., Perrin J.H. Interaction of heparin sodium and dopamine hydrochloride in admixtures studied by microcalorimetry // Am. J. Hosp Pharm. 1988. V. 45. № 6. Р. 1350-1352.
13. Gagnon R.F., Harris A.D., Prentis J., Richards G.K. The effects of heparin on rifampin activity against Staphylococcus epidermidis biofilms // Adv. Perit. Dial. 1989. № 5. Р. 138-142.
14. Caplain H., D'Honneur G., Cariou R. Prolonged heparin administration during clopidogrel treatment in healthy subjects // Semin Thromb Hemost. 1999. V. 25. № 2. Р. 61-64.
15. Reimann J.D., Modi N.B., Novotny W. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of sibrafiban, an orally administered GP IIb/IIIa antagonist, following coadministration of aspirin and heparin // J. Clin. Pharmacol. 2000. V. 40. №. 5. Р. 488-495.
16. Robinson J.L., Tawfik G., Saxinger L. et al. Stability of heparin and physical compatibility of heparin/antibiotic solutions in concentrations appropriate for antibiotic lock therapy // J. Antimicrob. Chemother. 2005. V. 56. № 5. Р. 951-953.
17. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. 459 с.
18. Хомутов А.Е. Гепарин и зоотоксины // Межвузовский сборник «Механизмы действия зоотоксинов». Горький: Изд-во ГГУ, 1987. 87 с.
19. Клейменов А., Розенфельд М., Бурлакова Е. и др. Влияние антиоксиданта ОП-6 на некоторые модельные реакции системы свертывания крови // Вопр. мед. химии. 1983. Т. 29. Вып. 1. С. 33-37.
20. Jiao Q. C., Liu Q., Sun C., He H. Investigation on the binding site in heparin by spectrophotometry // Ta-lanta, 1999. V. 48. P. 1095-1101.
MOLECULAR INTERACTION OF HEPARIN WITH APITOXIN AND ITS COMPONENTS IN VITRO
A.E. Khomutov, M.B. Zvonkova, K.A Pursanov, Z.V. Perepelyuk, A.G. Butylin
It has been shown by photocolorimetric research and by the studies of the absorption spectra in the UV region and in the visible spectrum that heparin interacts with apitoxin and melittin in solution. Phospholipase A2 does not interact with heparin in vitro. The optical density of the solution increases when sodium, potassium, calcium and silver salts are added to the solvent. Our studies in the visible spectrum have shown that methylene blue is displaced by apitoxin in complex heparin compounds.
Keywords: heparin, apitoxin, photocolorimetry.
