CC BY
254
Ветеринарный врач. 2025. № 1. С. 54 - 60
The Veterinarian. 2025; (1): 54 - 60
Научная статья
УДК 579.62
DOI: 10.33632/1998-698Х 2025 1 54
МОЛЕКУЛЯРНОЕ ТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ BACILLUSANTHRACIS НА ОСНОВЕ ДАННЫХ canSNP-АНАЛИЗ А ИХ ГЕНОМОВ
Елизавета Алексеевна Громова, кандидат биологических наук, [email protected]
Наиль Анисович Фахрутдинов, [email protected]
Константин Анатольевич Осянин, кандидат биологических наук, [email protected]
Динис Анатолиевич Миргазов, [email protected]
Екатерина Алексеевна Додонова, [email protected]
Ленар Ильгизарович Зайнуллин, кандидат биологических наук, [email protected]
Эльмира Наримановна Мустафина, кандидат ветеринарных наук, [email protected]
Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности, Казань, Российская Федерация
Автор, ответственный за переписку: Елизавета Алексеевна Громова.
Аннотация. Сибирская язва - это особо опасное зоонозное заболевание, возбудителем которого являются бактерии Bacillus anthracis. При проведении мониторинговых исследований на эндемичных по сибирской язве территориях, а также в случае возникновения вспышек данного заболевания необходимым является не только индикация непосредственного возбудителя, но и определение его филогенетического положения в структуре глобальной популяции В. anthracis методами молекулярного типирования. При изучении филогении высококлональных мономорфных микроорганизмов, к которым относят В. anthracis, широкое применение находит подход, основанный на выявлении однонуклеотидных полиморфизмов в canSNP-локусах. В настоящем исследовании проведено типирование по 13 canSNP локусам для семи штаммов В. anthracis, хранящихся в Государственной коллекции штаммов возбудителей особо опасных болезней, используемых в ветеринарии и животноводстве (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»). С целью определения места исследуемых штаммов в глобальной филогении возбудителей сибирской язвы использовали геномы В. anthracis, представленных в базе данных GenBank. На основании проведенного canSNP-анализа установлено, что большинство исследуемых штаммов возбудителя сибирской язвы может быть систематизировано в соответствии с их принадлежностью к определенной филогенетической линии. Коллекционные штаммы принадлежали к линиям А {В. anthracis №1-4) и В (В. anthracis №5-7). Однако филогенетические подгруппы были идентифицированы только штаммов №1 и №3 (А.Вг.003/004 и А.Вг.008/009, соответственно). Штаммы №2, №4 и №5-7, в свою очередь, демонстрировали canSNP профили, не характерные для какой-либо известной филогенетической SNP-подгрупп. Штаммы №2 и №4 характеризовались одинаковым профилем однонуклеотидных полиморфизмов и группировались в отдельную ветвь, выходящую из одного узла с референсгеномом подгруппы A.BrVollum. Штаммы № 5-7 принадлежали к одному генотипу линии В, ближайшим родственником которых был австрийский штамм Туго! 4675.
Ключевые слова: Bacillus anthracis, SNP, филогенетическая линия, генотипирование, сибирская язва
Для цитирования: Громова Е.А., Фахрутдинов Н.А., Осянин К.А., Миргазов Д.А., Додонова Е.А., Зайнуллин Л.И., Мустафина Э.Н. Молекулярное типирование штаммов Bacillus anthracis на основе данных canSNP -анализа полиморфизма их геномов // Ветеринарный врач. 2025. № ГС. 54-60. DOI: 10.33632/1998-698Х 2025 1 54
55
MOLECULAR TYPING OF BACILLUS ANTHRACIS STRAINS BASED ON canSNP ANALYSIS OF THEIR GENOMES
Elizaveta A. Gromova, candidate of biological sciences, [email protected]
Nail A. Fakhrutdinov, [email protected]
Konstantin A. Osyanin, candidate of biological sciences, [email protected]
Dinis A.Mirgazov, [email protected]
Ekaterina A. Dodonova, [email protected]
Eenar I. Zainullin, candidate of biological sciences, [email protected]
Elmira N. Mustafina, candidate of veterinary sciences, [email protected]
Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan, Russian Federation
Corresponding author: Elizaveta Alekseevna Gromova.
Abstract. Anthrax is a particularly dangerous zoonotic disease caused by Bacillus anthracis bacteria. When conducting monitoring studies in areas endemic to anthrax, as well as in the event of outbreaks of this disease, it is necessary not only to indicate the direct pathogen, but also to determine its phylogenetic position in the structure of the global population of B. anthracis by molecular typing methods. The researches of the phylogeny of highly clonal monomorphic microorganisms, which include B. anthracis, is widely used an approach based on the identification of single nucleotide polymorphisms in canSNP loci. In this work, was typing for seven of B. anthracis strains from the State Collection of Strains of pathogens of Especially Dangerous Diseases used in veterinary Medicine and animal Husbandry (FSBSI «FCTRBS-ARRVI») at 13 canSNP loci. The genomes of B. anthracis from the GenBank database were used to determine the place of the strains from collection in the global phylogeny of anthrax pathogens. Based on the carried canSNP analysis were established the possible to systematize most of the studied strains of the anthrax pathogen in accordance with their belonging to a certain phylogenetic lineage. The strains from collection belonged to lines A (B. anthracis No. 1-4) and В (В. anthracis No.5-7). However, were identified phylogenetic subgroups for only the No.l and No. 3 strains (A.Br.003/004 and A.Br.008/009, respectively). The No.2, No.4 and B. No. 5-7 strains, in turn, were demonstrated canSNP profiles that are not characteristic of any known phylogenetic SNP subgroups. The No.2 and No.4 strains were characterized the same profile of single-nucleotide polymorphisms and grouped into a separate branch emerging from the same node with the reference genome of the A.BrVollum subgroup. The No. 5-7 strains belonged to the same genotype of the В line, the closest relative of which was the Austrian strain Tyrol 4675.
Keywords: Bacillus anthracis, SNP, phylogenetic lineage, genotyping, anthrax
Введение. Сибирская язва - особо опасное зоонозное заболевание, этиологическим агентом которого являются грамположительные спорообразующие бактерии Bacillus anthracis. Данное заболевание имеет глобальное распространение и поражает как травоядных диких и сельскохозяйственных животных, так и людей [1]. Заражение пастбищных животных происходит преимущественно путем проглатывания спор, находящихся в почве, траве и корнеплодах [1, 2]. Люди чаще всего заражаются контактным путем (кожная сибирская язва) или через употребление мяса инфицированного животного (желудочно-кишечная сибирская язва) [1, 2]. Несмотря на то, что данное заболевание является, как правило, эндемичным, новые вспышки сибирской язвы ежегодно фиксируются по всему миру [3]. Что касается Российской Федерации, в 2023 году на территории трех федеральных округов (Приволжский, Сибирский, Е1,ентральный) было зарегистрировано семь вспышек сибирской язвы с заражением сельскохозяйственных животных (не менее 14) и людей (19 человек) [3]. Неблагополучная эпизоотическая ситуация по данному зоонозу, также наблюдаемая в некоторых сопредельных странах (Таджикистан, Казахстан, Азербайджан и Кыргызстан), создает потенциальную угрозу возникновения новых вспышек данного заболевания вследствие ввоза на территорию России контаминированных бактериями В. anthracis продуктов питания и непосредственно больных животных [3]. Поэтому необходимым этапом противоэпидемических мероприятий является не только выявление непосредственного возбудителя -В. anthracis, но и молекулярно-генетическое типирование выделенных во время вспышки изолятов с целью определения источника инфекции и его географического происхождения.
Большинство штаммов В. anthracis на генетическом уровне в высокой степени однородны, поэтому для их дифференциации и типирования необходимо опираться на полиморфизм небольших участков геномов - маркерных локусов [4]. Основными маркерами, используемыми при типировании возбудителей сибирской язвы, являются VNTR (локусы, вариабельные по числу тандемных повторов)
56
и SNP-локусы (полиморфизм единичных нуклеотидов) [2, 4-6]. Настоящее исследование посвящено использованию canSNP-локусов, позволяющих определять принадлежность конкретных штаммов к основным генетическим линиям В. anthracis, приуроченных, в свою очередь, к определенному географическому региону.
Цель работы - определить филогенетическое положение штаммов В. anthracis из Государственной коллекции штаммов - возбудителей особо опасных болезней, используемых в ветеринарии и животноводстве, полученных из различных регионов Российской Федерации и ближнего зарубежья, в структуре глобальной популяции вида.
Материалы и методы. В качестве объектов исследования использовали семь образцов ДНК Bacillus anthracis (№ 1-7), выделенных нами в предыдущем исследовании из инактивированных культур возбудителя сибирской язвы, хранящихся в Государственной коллекции штаммов - возбудителей особо опасных болезней (ООБ), используемых в ветеринарии и животноводстве (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») [5]. В работе также использовались 17 нуклеотидных последовательностей хромосом В. anthracis, отобранных нами из базы данных GenBank. Информация об использованных штаммах и геномах В. anthracis представлена в таблице 1.
Таблица 1 - Использованные в работе штаммы и геномы В. anthracis
Условное обозначение штамма
Место выделения
Место хранения/Но-мер GenBank
№1___________
№2___________
№3___________
№4___________
№5___________
№6___________
№7___________
STI-1________
Ames Ansenter
Vollum
BUL 12_______
3-IZSLT______
4-IZSLT______
A27__________
A193a________
3016_________
London 499 14RA5914
MCCC 1A01412
2002013094
A3783
Mn 106-1
CMF9_________
Tyrol 4675
Чеченская республика, Россия Таджикистан, Россия Кургановская область, Россия
Ульяновск, Россия
Республика Татарстан, Россия
Референсный геном Референсный геном Референсный геном Болгария
Италия
Германия Франция
Иран Англия Германия Китай США США Южная Африка
Китай Австрия
Для проведения SNP-анализа
использовали
Государственная коллекция штаммов возбудителей ООБ, используемых в ветеринарии и животноводстве
13 canSNP-локусов.
СР066168.1
АЕ017334.2
СР076225.1
СР076178.1
СР076204
СР076160.1
СР076181.1
СР076164.1
СР076144.1
СР029805.1
СР023001.1
СРОЗ 1643.1 СР009902.1
СР076201.1
СР126515.1
СР085402.1
СРО 18903.1
характерных для
В. anthracis. Детекцию canSNP осуществляли на многоканальном амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad) методом ПЦР-РВ с применением пары праймеров (прямого и обратного, ограничивающими локус canSNP) и двух конкурирующих TaqMan-зондов, комплементарных тому или иному аллельному состоянию canSNP, в соответствии с представленным ранее протоколом [5].
57
Биоинформационный анализ геномов В. anthracis осуществляли с помощью программы Vector NTI 9.1, а также баз данных NCBI. Множественное выравнивание с дальнейшим построением филогенетического дерева проводили с использованием программы Mega 11 согласно описанному ранее алгоритму [7].
Результаты исследований и их обсуяедение. В рамках текущего исследования методом ПЦР-РВ получены данные о ключевых canSNP-локусах семи штаммов В. anthracis, хранящихся в Государственной коллекции штаммов - возбудителей ООБ, используемых в ветеринарии и животноводстве (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»), Также SNP-анализ был проведен in silico для 17 нуклеотидных последовательностей геномов В. anthracis, представленных в базе данных GenBank (АЕ017334.2, СР076225.1, СР009902.1, СР076201.1, СР126515.1, СР076181.1, СР076178.1, СР076160.1, СР076164.1, СР076204.1, СР076144.1, СР029805.1, СР018903.1, СР031643.1, СР023001.1, СР066168.1). С помощью программы Vector NTI 9.1 у данных штаммов для каждого анализируемого SNP-локуса был определен наиболее комплементарный TaqMan-зонд, характеризующийся тем или иным аллельным состоянием canSNP. Информация о конфигурациях точечных нуклеотидных замен в исследуемых локусах, полученная по результатам SNP-анализа для всех исследуемых штаммов, представлена в таблице 2.
Таблица 2 - Результаты SNP-анализа исследуемых штаммов и геномов В. anthracis
Локус
Штамм
ГЧ о о
m
гч о о
m
о о
m
<3
40 о о
m
ОО о о
m
<3
04 О о
m
о о
m
m
ГЧ о о
m m
гч о о
m m
о о
m
m
№1
№2
№3
№4
№5
№6
№7
T T
T T
T T
T
G
G
G
G
G
G
G
A
A
A
A
A A
A
c
c
T c c c c
A A A A £
c
T C
T c T T T
T G G G G G G
A
A
A
A
A A
A
T T
T T
T T
T
G G G G
T T T
G G
G
G
A A
A
T T
T T
T T
T
о о
m m
т А А А А А А
о о
m
о о
m
Результаты полученные in silico
STI-1_________
Ames Ansenter
Vollum________
BUL 12________
A27___________
3-IZSLT_______
4-IZSLT_______
A193a_________
3016__________
London 499 14RA5914
MCCC 1A01412
2002013094
A3783_________
Mn 106-1
CMF9__________
Tyrol 4675
T c T
T T T
T T T
T T T
T T T
T T
G
A
G
G
G
G
G
G
G
G
A
A
G
G
A A
G
A G A A A A A A A A
G A A A A A A
T c T
T T T
T
T T T c T T T T T T
A A A A A A A A A A A £ £ A £ £ C
T T c
T T T
T T T
T T T
T T T
T T
G T T G G G G G G G T T T T T T T
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
T T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T T
T
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G G
A
T T T
T T T
T T T
T T T
T T T
T
c
A A A A A A A A A A A G G G G G A
По результатам проведенных исследований также была построена дендрограмма кластерного анализа единичных полиморфизмов геномов В. anthracis.
58
Рисунок 1 - Дендрограмма, иллюстрирующая кластеризацию исследованных штаммов В. anthracis на основании проведенного SNP-анализа
3
STI1 {СР066168.1)
Isolate 3
London 499 (CP029805.1)
Референс-штамм Кургановская область Англия
7S
15
IS
3016 {CP076144.1)
34ZSLT(CP076204.1)
A193a(CP076164.1)
4-IZSLT(CP076160.1)
BUL 12 {CP076178.1)
A27{CP076181.1)
Иран
Италия
США
Италия
Болгария
Германия
r- А.Вг.00в/009
Isolate 1
Чеченская Республика А.Вг.ооз/(Ю4
57
---Vollum (CP076225.1)
Isolate 2
Референс-штамм Таджикистан
A.Br.Vollum
Ч
Isolate 4
Ульяновск
4a
A3783(CP076201.1)
США
J7
17
49
loa
49
MCCC 1 A01412 {CP031643.1)
МП106-1 (CPI 26515.1)
CMF9 (CP085402.1)
2002013094 (CP009902.1)
Tyrol 4675 (CP018903.1)
Isolate 5
Isolate 6
Isolate 7
Ames Ancestor (AE017334.2)
14RA5914{CP023001.1)
Китай
Северная Африка
Китай
США
Австрия
Ульяновск
Республика Татарстан
Республика Татарстан
Референс-штамм
Германия
->С.Вг.А1055
^C.Br.A10SS
A.Br.Ames
А.Вг.(Ю1/002
+
+
+
+
t
О.та» O.OOIKi O.OOICO 0O»5Ci o.oaooo
Как видно из представленного рисунка 1, штаммы из Государственной коллекции штаммов -возбудителей ООБ, используемых в ветеринарии и животноводстве (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»), распределились в три кластера. Отдельную ветвь на филогенетическом дереве формировал штамм В. anthracis №1, принадлежащий к генотипу А.Вг.003/004. Штамм №3, выделенный на территории Кур-гановской области, принадлежал к самому крупному кластеру, объединяющему штаммы группы А.Вг008/009, имеющие, как правило, европейское происхождение [8].
Остальные пять коллекционных штаммов демонстрировали canSNP профиль, не характерный для какой-либо известной филогенетической SNP-подгруппы. Штаммы №2 и №4, выделенные на территории Таджикистана и Ульяновска, соответственно, формировали отдельную ветвь, выходящую из общего узла с референсным геномом В. anthracis Vollum одноименного генотипа A.BrVollum. Действительно, данные штаммы обладают типичной только для представителей A.BrVollum SNP-подгруппы заменой Т С в локусе А.Вг.007, однако различаются от типовых штаммов A.BrVollum по локусам А.Вг.ООЗ и А.Вг.008 [9].
Штаммы В. anthracis №5-7, выделенные на территориях республики Татарстан и Ульяновска, сгруппировались на дендрограмме в виде общей клады с близкородственной ветвью из австрийского штамма Tyrol 4675, также характеризующимся нетипичным профилем нуклеотидных замен в canSNP-локусах. Однако, представители данной клады, вероятно, могут быть отнесены к филогенетической
59
линии в, поскольку обладают типичной для В линии заменой А
С в локусе А.Вг.006 [21]. Наиболее
близкой филогенетической подгруппой для штаммов В. anthracis №5-7 является В.Вг.001/002 (различия только по локусам А.Вг. 004 и А.Вг.008). Согласно данным литературы подгруппа В.Вг.001/002 является одной из наиболее часто встречающихся на территории Российской Федерации [8].
Полученные результаты филогенетического исследования указывают на то, что на российских и близлежащих территориях встречаются как уникальные (автохтонные), так и более распространенные «канонические» клады возбудителя сибирской язвы. Действительно, имеются свидетельства того, что глобальная популяция В. anthracis не ограничивается выделенными на сегодняшний день 14-ю SNP-генотипами [6, 10]. Например, в работе Афанасьева с соавторами большинство исследуемых штаммов демонстрировали атипичный canSNP-профиль однонуклеотидных замен и, как следствие, были отнесены к дополнительным филогенетическим подгруппам [6]. Также для штамма ВА2968, выделенного в 1988 с сельских территорий Финляндии (страны с редкими очагами сибирской язвы), была показана принадлежность к отдельной SNP-сублинии подгруппы В.Вг.001/002 [10]. Таким образом, каноничная схема генотипирования имеет ограничения для типирования автохтонных штаммов В. anthracis, что диктует необходимость расширения существующего протокола SNP-генотипирования.
Что касается остальной выборки штаммов из базы данных GenBank, нижнюю часть дендрограммы составляют выходящие из общего узла две самостоятельные ветви представленные референсгеномом Ames Ansenter и штаммом немецкого происхождения В. anthracis 14RA5914 с генотипом А.Вг.001/002.
Штаммы из Китая, США и Африки сформировали несколько близкородственных суб кластеров.
характеризующихся общей заменой А
G в локусе А/В.Вг.ОО1, типичной для генотипа С.Вг.А1055.
Согласно данным литературы, генетическая линия С занимает менее 0,1 % в глобальной филогенетической структуре В. anthracis и представлена всего четырьмя американскими штаммами [8].
Заключение. Проведенный по 13 локусам canSNP-анализ указывает на то, что на территории
Российской
Федерации
и
стран
ближнего
зарубежья
присутствуют
штаммы
В. anthracis. которые не могут быть отнесены к какой-либо из ранее выделенных филогенетических подгрупп. Данный факт диктует необходимость проведения масштабного исследования canSNP-профилей российских штаммов с целью создания уникальной базы данных единичных полиморфизмов, позволяющей существенно дополнить современные представления о глобальной популяция возбудителя сибирской язвы и интегрировать в нее автохтонные для Российской Федерации штаммы
Список источников
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Spores and soil from six sides: interdisciplinarity and the environmental biology of anthrax (Bacillus anthracis) / C.J. Carlson [et al.] // Biol Rev Camb Philos Soc. 2018. No 93(4). P. 1813-1831.
Дифференциация штаммов Bacillus anthracis методом анализа температур плавления продуктов ПЦР, полученных после амплификации VNTR локусов / Н. А. Фахрутдинов [и др.] // Ветеринарный врач. 2023. №2. С.41-46.
Анализ эпизоотолого-эпидемиологической обстановки по сибирской язве в 2023 г. в мире, прогноз на 2024 г. в Российской Федерации / А.Г. Рязанова [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2024. №3. С.35-41.
Brodzik А.К., Francoeur J. А new approach to in silico SNP detection and some new SNPs in the Bacillus anthracis genome //BMC Res Notes. 2011. No 4. P. 114.
Дифференциация штаммов Bacillus anthracis на основе SNP- и VNTR-полиморфизма геномов // Вавиловский журнал генетики и селекции / Е.А. Анисимова [и др.] // 2022. № 26(6) С. 560-567.
Сравнительный мультилокусный VNTR и SNP-анализ вакцинных штаммов Bacillus anthracis / М. В. Афанасьев // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2014. № 2. С. 86-92.
Дифференциация штаммов бруцелл на основе анализа вариабельности VNTR-локусов. / Е. А. Анисимова // Вестник КрасГАУ. 2024. № 4(205). С. 53-60.
Филогенетика, эволюция и филогеография Bacillus anthracis. / Е.И. Еременко // Бактериология. 2018. №3(2). С. 57-63.
Тимофеев В.С., Бахтеева И.В., Дятлов И.А. Генотипирование Bacillus anthracis и близкородственных микроорганизмов // Генетика. 2018. № 54(1). С. 3-14.
Genotyping and phylogenetic placement of Bacillus anthracis isolates from Finland, a country with rare anthrax cases / T. Eienemann [et al.] // BMC Microbiol. 2018. No 18(1). P. 102.
60
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
References
Spores and soil from six sides: interdisciplinarity and the environmental biology of anthrax (Bacillus an-thracis) / C.J. Carlson [et al.] // Biol Rev Camb Philos Soc. 2018. No 93(4). P. 1813-1831.
Differentiation of Bacillus anthracis strains by method based on melting points of the PCR products obtained after amplification the VNTR loci / N. A. Fakhrutdinov [et al.] // The Veterinarian// 2023. No 2. P. 41-46.
Analysis of the Epizootiological and Epidemiological Situation on Anthrax in the World in 2023, the Forecast for 2024 in the Russian Federation / A.G. Ryazanova [et al.] // Problems of Particularly Dangerous Infections. 2024. No 3. P. 35-41.
Brodzik A.K., Francoeur J. A new approach to in silico SNP detection and some new SNPs in the Bacillus anthracis genome //BMC Res Notes. 2011. No 4. P. 114.
Bacillus anthracis strain differentiation based on SNP and VNTR loci / Anisimova E.A. [et al.] // Vavi-lovskii Zhumal Genetiki i Selektsii=Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2022. No 26(6). P. 560-567.
Comparative multilocus VNTR and SNP analysis of Bacillus anthracis vaccine strains / M.V. Afanas’ev [et al.] // Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2014. No 29(2). P. 8692.
Brucella strains differentiation based on VNTR loci variability analysis / E.A. Anisimova [et al.] // Bul-liten KrasSAU. 2024. No 4. P. 53-60.
Hylogenetics, evolution and phylogeography of Bacillus anthracis / E.I. Eremenko [et al.] // Bacteriology. 2018. No 3(2). P. 57-63.
Timofeev V.S., Bakhteeva I.V., Dyatlov I.A. Genotyping of Bacillus anthracis and closely related microorganisms // Russian Journal of Genetics. 2018. No 54(1). P. 3-14.
Genotyping and phylogenetic placement of Bacillus anthracis isolates from Finland, a country with rare anthrax cases / T. Eienemann [et al.] // BMC Microbiol. 2018. No 18(1). P. 102.
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации.
Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
АП authors have made an equivalent contribution to the preparation of the publication. The authors declare that there is no conflict of interest.
Принята к публикации / Accepted for publication 13.12.2024;
© Громова E. A., Фахрутдинов H. A., Осянин К. A., Миргазов Д. A., Додонова E. A., Зайнуллин Л. И., Мустафина Э. Н. 2025
