CC BY
174
Биология
МОЛЕКУЛЯРНОЕ МАРКИРОВАНИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПАСПОРТИЗАЦИЯ РЕСУРСНЫХ И РЕДКИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ С ЦЕЛЬЮ ОПТИМИЗАЦИИ СОХРАНЕНИЯ
ИХ ГЕНОФОНДОВ
С.В. БОРОННИКОВА,
кандидат биологических наук, доцент, Пермский государственный университет, г. Пермь
Ключевые слова: геном, ISSR и !ИАР маркеры, полиморфизм, генетическое разнообразие, технология генетической паспортизации.
Цель и методика исследований
Через одно-два десятилетия продовольствие станет важнейшим стратегическим ресурсом. В 2000 году полностью секвенирован геном первого растения - представителя класса двудольных Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. В 2001 году предварительно секвенирован геном представителя класса однодольных Oriza saliva L. [1]. После секвенирования генома человека в 2001 году разработаны научно-методические основы идентификации личности человека. С 3 декабря 2008 года в силу вступил Федеральный закон «О государственной геномной регистрации в Российской Федерации» [2].
Геномы растений значительно сложнее, чем геном человека, что связано с рядом причин и, прежде всего, с их огромными размерами, достигающими для отдельных видов растений десятков и даже сотен миллиардов пар нуклеотидов. Однако прямое секвенирование геномов растений требует крупных финансовых вложений и в настоящее время вряд ли возможно [1]. Для генетической паспортизации как основы геномной регистрации ресурсных видов растений необходимо использовать более рациональные подходы, основанные на молекулярном маркировании геномов. Применяемые для геномной регистрации человека SNP маркеры не могут быть использованы для генетической паспортизации растений из-за их дороговизны. В настоящее время для генетического типирования используются различные типы молекулярных маркеров (RELF, RAPD, AFLP, ISSR, микросателлиты и т.п.), каждый из которых имеет свои достоинства и недостатки [3, 4].
Микросателлитные последовательности окружают многие гены и могут быть использованы как якорные последовательности к этим генам. На этой особенности основан ISSR-метод (InterSimple Sequence Repeat), в котором используются один или несколько праймеров длиной в 15-24 нуклеотида. В данном случае праймеры состоят из тандемных коротких 2-4 нуклеотидных повторов и одного селективного нуклеотида на 3'-конце праймера [5]. ISSR не требует предварительного клонирова-
ния и секвенирования фрагментов для подбора праймеров и хорошо воспроизводим в строгих условиях реакции. IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) - это анализ полиморфных участков ДНК, амплифицирован-ных между ретротранспозонами [6]. В качестве модели разработки научнометодических основ генетической паспортизации ресурсных растений перспективны их редкие декоративные лекарственные виды.
Цель работы - разработка технологии генетической паспортизации гетерогенных и гомогенных популяций растений по результатам молекулярного маркирования как научно-методической основы геномной регистрации ресурсных видов растений с целью использования их потенциала и оптимизации сохранения их генофондов.
Молекулярно-генетические исследования 20 популяций 4 редких видов растений Пермского края, а именно: Adonis vernalis L. и Adonis sibirica Patrin ex Ledeb., Digitalis grandiflora Mill. и Adenophora lilifolia (L.) DC. [7, 8], проведены в 2004-2009 годах и предложен общий принцип молекулярно-генетической паспортизации [9]. Апробация технологии молекулярно-генетической паспортизации проведена на популяциях A. sibirica, который уступает по фармацевтическому потенциалу Adonis vernalis L., но перспективен как лекарственное растение [10]. Исследованы три популяции A. sibirica: первая (As1) расположена в травянистом ельнике на Лунежских горах около п. Полаз-на Добрянского района, вторая (As2) - в травянистом ельнике и мелколиственном лесу на территории УНБ "Предура-лье" Кишертского района, третья (As3) -в смешанном лесу около п. Ильинский Ильинского района Пермского края. Для выделения ДНК использовали методику A.M. Torres [11] с некоторыми модификациями. Клонирование последовательностей ретротранспозонов осуществляли с помощью нового универсального метода быстрого их выделения [12], основанного на использовании ПЦР с праймерами из участка связывания tRNA (PBS - Primer Binding Site), прилегающего к левому прямому повтору LTR в центральной части ретротранспозона. Сек-
венирование последовательностей ДНК с использованием капиллярного секве-натора ABI3700 (Biosystems, USA) и дизайн праймеров проведены во время кратковременной стажировки в лаборатории растительной геномики Института биотехнологии Университета Хельсинки (Финляндия), руководимой профессором Шульманом А.Х. Для IRAP-анализа пяти редких видов Урала разработаны и синтезированы 70 праймеров в MWG (Германия). Анализ молекулярно-генетического полиморфизма ДНК, включая основные его стадии, а именно: подбор молекулярных маркеров и условий проведения ПЦР, апробацию праймеров, ПЦР-анализ, детекцию продуктов амплификации и компьютерный анализ данных, проведен в ПЦР-лаборатории Пермского государственного университета. Амплификация ДНК была выполнена в термоциклере (MJ, Bio-Rad, USA) по следующей программе: предварительная денатурация 95°C, 3 мин.; 30 цикла 95°С, 20 сек.; 60°С отжига, 1 мин.; 68°C, 1 мин. Последний цикл элонгации длился 5 мин. при 72°C. Температура отжига в зависимости от G/C состава праймеров варьировалась от 55 до 68°С. Для проверки достоверности полученных ДНК-спект-ров опыт повторяли не менее двух раз. Амплифицированные продукты были подвергнуты электрофорезу на 1,7% аго-розном геле в присутствии бромистого этидия. Гели были отсканированы в системе Gel-Doc (Bio-Rad, США). Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 bp+1,5+3 КЬ DNA Ladder) (ООО "СибЭнзим-М", Москва). Определение длин фрагментов проводилось с использованием программы Quantity One в системе гель-документации Gel Doc XR (Bio-Rad, USA).
Результаты исследований На первом этапе разработки технологии молекулярно-генетической паспортизации была решена задача выбора эффективных стабильных молекулярных маркеров, которые позволяют выявить высокий уровень полиморфизма ДНК, анализировать большую часть ге-
Genome, ISSR and IRAP markers, polymorphism, genetic diversity, technology of the genetic certification.
Биология
Таблица 1
Характеристика фрагментов ДНК, избранных для паспортизации А. Б/Ыпсв
Обозначение праймера Нуклеотидная последовательность (5^3') Размеры фрагментов ДНК, п.н. ПЦР-фрагмены ДНК, избранные для паспортизации
мономорфные полиморфные
длина, п.н. обозначение длина, п.н. обозначение
ISSR M1 (AC)sCG 270-1570 1030 380 As v 1030 M1 AD r 380 M1 450 As p 450 M1
ISSR M3 (AC)sCT 270-960 480 340 AD r 480 m3 As v 340 м3 820 As p 820 M3
ISSR M12 (CA)6G 280-1620 550 As v 550 M12 750 320 22 І і 0 0 52 73 p p s s AA
ISSR Х11 (AGC)6G 310-1730 610 550 As v 610 x11 AD r 550 x11 320 As p 320 X11
IRAP 2175 TTA GAC CCG GAA CCG CCG TG 390-2170 1510 940 As v 1510 |R75 As v 940 IR75 1370 1020 As p 1370 1R75 As p 1020 1R75
IRAP 2197 GAA GTA CCG ATT TAC TTC CGT GTA 560-2630 1310 930 620 AD r 1310 |R97 As v 930 IR97 As v 620 IR97 780 1050 As p 780 1R97 As v 1050 IR97
IRAP 2198 ATC CTT CGC GTA GAT CAA GCG CCA 390-2800 850 430 AD r 850 ir98 As v 430 ir98 2120 1520 As p 21 20 IR98 As p 1520 |R98
IRAP 2202 TGG CGC TTG ATC TAC GCG AAG GA 390-2170 980 590 As v 980 1R02 As v 590 1R02 2170 Av p 2170 1R02
IRAP 2204 AAC TTG ATC CAG ATC ATC TCC 370-2980 1300 370 As v 1300|R04 As v 370 1R04 1170 1060 As p 1170 IR04 As p 1060 1R04
Примечание: ДЭГ - фрагменты ДНК, общие для видов А.увгпаНв и А. з!Ь1г1са; Абу - фрагменты ДНК, характерные для А. в1Ыпса; Авр - полиморфные фрагменты ДНК.
Таблица 2
Mолекулярно-генетические формулы трех популяций A. Sibirica
Обозначение популяции Тип фрагментов ДНК Запись формулы
As1 rod AD r 850 ir9s; AD r 550 xn; AD r 380 m1 AD r 475 м3
vid As v 1510 1R75; As v 935 1R97; As v 610 хи; As v 425 ir98
polimorph As р 1370 1R75; As р 745 M12
As2 rod AD r 850 |R98; AD r 550 xn; AD r 380 m1 AD r 475 м3
vid As v 1510 1R75; As v 935 1R97; As v 610 хи; As v 425 ir98
polimorph As р 1170 1R04; As р 745 M12
As3 rod AD r 850 |R98; AD r 550 xn; AD r 380 m1 AD r 475 м3
vid As v 1510 1R75; As v 935 1R97; As v 610 хи; As v 425 ir98
polimorph As р 1025 1R75; As р 320 M12
нома растений, получить четко воспроизводимые результаты. Технология должна быть недорогой и доступной для массового анализа. Эффективными для идентификации организмов признаны ІБвР маркеры. Возможно, для гомогенных искусственных популяций, каковыми являются сорта растений, достаточно ІвБР маркеров для паспортизации сорта. Для гетерогенных природных популяций необходима характеристика полиморфизма ДНК с анализом большей части генома. В связи с этим помимо ІвБР маркеров нами рекомендованы для паспортизации ІРДР маркеры. В качестве повторяющихся последовательностей ретротранспозоны рассеяны по всему геному [13]. По нашему мнению, хорошая воспроизводимость результатов ІвБР и ІРДР анализов обусловлена также размерами их праймеров: от 13 до 19 п.н. у ІвБР и от 18 до 24 п.н. у ІРДР (табл. 1).
На втором этапе паспортизации в трех природных популяциях Д.зіЬігіоа собраны фрагменты листьев и выделена ДНК.
На третьем этапе были отобраны наиболее информативные 4 ІвБР- и 5 ІРАР-праймерьі, с помощью которых выявлены эффективные для Д.БІЬігіоа ІББР и ІРДР маркеры (табл. 1). Проведен
ПЦР-анализ выделенных проб ДНК.
На четвертом этапе паспортизации провели анализ выявленных молекулярных маркеров. Для паспортизации популяций A.sibirica были выделены четко воспроизводимые 18 мономорфных и 15 полиморфных фрагментов ДНК, длина которых при ISSR-анализе варьировалась от 270 до 1730 п.н., а при IRAP-анализе - от 245 до 2800 п.н. (табл. 1). Проведен ПРЦ-анализ проб ДНК двух видов рода Adonis с одними и теми же ISSR и IRAP праймерами и выявлены общие для двух видов фрагменты ДНК, которые являются надвидовыми, но для удобства названы нами родовыми. По нашим данным, для выявления идентификационных фрагментов ДНК необходимо проанализировать не менее 50 ISSR маркеров и не менее 90 IRAP маркеров.
На пятом этапе маркеры ДНК, избранные для паспортизации, представили в виде молекулярно-генетической формулы. Необходимость усовершенствования формы записи молекулярногенетической формулы продиктована тем, что в записи, предлагаемой ранее [14, 15] не указывается вид растений, а длина фрагмента ДНК и праймер, с помощью которого амплифицирован фрагмент, указаны в дополнительной таблице. В связи с этим нами предложена но-
вая запись фрагмента ДНК с указанием типа фрагмента (родовой, видовой, полиморфный), длины фрагмента и указания праймера нижним индексом, например, Asv1510IR75. Нами выявлены фрагменты ДНК, общие для особей двух видов рода Adonis, которые мы назвали родовыми и обозначили первыми буквами названия рода AD с указателем "r" от "rod" нижним индексом, например, ADr550X11. Четко воспроизводимые при ПЦР-анализе только у особей одного вида фрагменты ДНК предлагается назвать видовыми и обозначить как As с указанием "v" от "vid", например, Asv550M12. Полиморфные фрагменты ДНК предлагается обозначить индексом "p" от "polimorph", например, Asp780IR97. Моно-морфные фрагменты ДНК позволили нам идентифицировать принадлежность особи и к роду, и к виду, а полиморфные фрагменты ДНК при их различных сочетаниях позволили составить уникальную генетическую формулу популяции. Для паспортизации популяций A. sibirica мы отобрали четыре фрагмента ДНК, общих для двух видов рода Adonis, четыре видовых фрагмента ДНК, а также по два специфических фрагмента для каждой из трех изученных популяций A. sibirica (табл. 2). Это минимальное число фрагментов ДНК, с помощью которых нам удалось провести паспортизацию. Сочетания полиморфных фрагментов ДНК не совпадают ни у одной из изученных популяций, что позволяет рекомендовать их для генетической паспортизации.
На шестом этапе паспортизации помимо буквенно-цифровой записи молекулярно-генетической формулы впервые в мире предложена запись в виде штрих-кода [9]. Как молекулярно-генетическая формула, так и штрих-код (рис.
1, табл. 2) позволят идентифицировать принадлежность как растительного сырья, так и отдельных особей A.sibirica не
Маркер молекулярного веса, п.н. 1600
1500
1400
1300
1200
1100
1000
900
800
700
600
500
400
Штрих-код
Номер
фрагмента
ДНК
1
3
4
5
6
7
8
9
10
Обозначение
фрагмента
As v 1510 IR75
As р 1170 |R04
As v 930 |R97 AD r 850 ir98 As р 750 M12 As v 610 |R75 AD r 550 x11 AD r 480 M3 As v 430 |R98 AD r 380 M1
Рисунок 1. Молекулярно-генетический штрих-код популяции A. sibirica (As2)в УНБ «Предуралье»
Примечание: ADr - фрагменты ДНК, общие для видов A.vernalis и A. sibirica; Asv - фрагменты ДНК, характерные для A. sibirica; Asp - полиморфные фрагменты ДНК
2
только к роду и виду, но и к определенной популяции.
В завершении технологии паспортизации сортов и популяций на ее седьмом этапе рекомендуется составление генетического паспорта единожды для генетически гомогенной популяции, и периодически через три-пять лет - для гетерогенной популяции. Нами разработана форма генетического паспорта на примере 10 популяций редкого вида ра-
стений Д.уегпаИБ, выбраны общепринятые показатели состояния популяций и генетического разнообразия [9].
Выводы. Рекомендации Технология молекулярно-генетической паспортизации ресурсных видов растений включает в себя 7 этапов: выбор эффективных методов анализа полиморфизма ДНК, сбор материала, подбор эффективных праймеров, молекулярно-генетический анализ с исполь-
Биология
зованием ПЦР, выявление идентификационных маркеров ДНК, редких и уникальных фрагментов ДНК, составление молекулярно-генетической формулы, штрих-кода и генетического паспорта.
Для молекулярно-генетической паспортизации ресурсных растений нами рекомендуются !88Р и !РДР методы, которые в совокупности позволяют выявить полиморфизм большей части геномов изучаемых видов, являются стабильными, дают четко воспроизводимые результаты. Предлагаемая технология паспортизации является относительно недорогой и при наличии выявленных эффективных !РДР праймеров пригодна для массового анализа. Разработанная на примере редких лекарственных видов растений технология паспортизации может являться моделью, которая рекомендуется для паспортизации сортов продовольственных культур и идентификации растительного сырья лекарственных растений.
Технология молекулярно-генетической паспортизации позволяет выявить, записать и наглядно представить в обобщенной форме характеристику геномов изучаемых видов растений, позволив конкретизировать показатели их генетического разнообразия на популяционном уровне. Данная технология, на наш взгляд, оптимизирует стратегию сохранения генофондов изучаемых видов растений и может быть в будущем основой геномной регистрации как природных популяций ресурсных, включая редкие, видов растений, так и сортов продовольственных культур.
Литература
1. Зеленин А. В. Геном растений // Вестник Российской академии наук. 2003. Т. 73. № 9. С. 797-806.
2. О государственной геномной регистрации в Российской Федерации : Федер. закон Рос. Федерации от 3 дек. 2008 г. № 242-Ф3 // Рос. газ. 2008. 09 дек.
3. Гостимский С. А., Кокаева З. Г., Коновалов Ф. А. Изучение организации и изменчивости генома растений с помощью молекулярных маркеров // Генетика. 2005. Т. 41. № 4. С. 480-490.
4. Чесноков Ю. В. ДНК-фингерпринтинг и анализ генетического разнообразия у растений // Сельскохозяйственная биология. 2005. № 1. С. 20-40.
5. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. 1994. V. 20. P 176-183.
6. Kalendar R., Grob T., Regina M. IRAP and REMAP: Two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques // Theor. and Applied Genetics. 1999. V. 98. P. 704-711.
7. Горчаковский П. Л., Шурова E. А. Редкие и исчезающие растения Урала и Предуралья. М. : Наука, 1982. 283 с.
8. Красная книга Пермского края / науч. ред. А.И. Шепель. Пермь : Книжный мир, 2008. 256 с.
9. Боронникова С. В. Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация редких и находящихся под угрозой исчезновения видов растений. Пермь : Изд-во Пермского ун-та, 2008. 120 с.
10. Дикорастущие полезные растения России / отв. ред. А. Л. Буданцев, E. E. Лесиовская. СПб. : Изд-во СПХФА, 2001. 663 с.
11. Torres A. M., Weeden N. F., Martin A. Linkage among sozyme, RFLP and RAPD markers in Vicia faba // Theor Appl. Genet. 1993. V. 5. P. 937-945.
12. Kalendar R., Tanskanen J., Chang W., Antonius K. et al. Cassandra retrotransposons carry independently transcribed 5S RNA // PNAS. 2008. V. 105. № 15. P 5833-5838.
13. Kumar A., Bennetzen J. Plant retrotransposons // Annu. Rev.Genet. 1999. V. 33. P 479-532.
14. Соболев В. В., Карлов Г. И., Соболева А. Г., Озеровский А. В., Казаков И. В., Феськов А. А. Использование ISSR маркеров для молекулярно-генетической идентификации и паспортизации сортов малины // Сельскохозяйственная биология. 2006. № 5. С.48-52.
15. Малышев С. В., Урбанович О. Ю., Картель Н. А. Идентификация и паспортизация сортов сельскохозяйственных культур (мягкой пшеницы, картофеля, томата, льна и свеклы) на основе ДНК маркеров : методические рекомбинации. Минск, 2006. 28 с.
