CC BY
26
УДК577.161.2+577.175.5:115.3 DOI: 10.22141/2224-1507.7.3.2017.116863
Шиманський 1.О., Лкаковська О.О., Великий М.М.
¡нститут óíoxímüím. О.В. Палладна НАН УкраУни, м. КиУв, УкраУна
Молекулярно-кл1тинш мехашзми захисноУ ди В1там1ну D3 при експериментальному предтзолон-шдукованому остеопороз1
For cite: Bol, Sustavy, Pozvonochnik. 2017;7(3):93-101. doi: 10.22141/2224-1507.7.3.2017.116863
Резюме. Актуальн'кть. Довготривале введення глюкокортико'^в (ГК) супроводжувться порушенням мшерального обмiну i, як наслщок, призводить до розвитку вторинного остеопорозу. Важливу роль у ре-гулюванн процесу ремоделювання кктково''' тканини в^грав вiтамiн D, який може реалiзовувати сво''' бю-логiчнi ефекти через рецептор втамшу D — VDR-опосередкований вплив на цитокiновi системи, зокрема RANKL-RANK-OPG (тганд рецептора активатора ядерного фактора транскрипцп NF-kB — рецептор RANKL — остеопротегерин). Мета. Дослщження ГКчндукованих змiн експреси детермiнантних для процеав форму-вання та резорбци кктково''' тканини регуляторних проте'шв (RANK, RANKL, OPG, остеокальцин, VDR) залеж-но вщ бiодоступностi вiтамiну D. Матер'шли таметоди. Щури-самиц лжи Wistar отримували преднiзолон (5 мг/кг маси тта) разом з вгамшом D3 (100 МО) або без нього протягом 30 днiв. Рiвнi vDr, остеокальцину, RANK, RANKL i OPG у юстковм тканинi визначали за методом вестерн-блот-аналiзу. Рiвень гщроксивтамЫу D (25OHD) у сироватцi кровi аналiзували, використовуючи метод ELISA. Вмiст мiнеральних компонентiв (Ca2+ та Pi), активысть лужно''' фосфатази (ЛФ) та и iзоформ визначали спектрофотометрично. Результати. Пред-нiзолон значно знижував рiвень 25OHD у сироватцi кровi та вмiст протешу VDR у кктковш тканинi. Це су-проводжувалось пщвищенням загально''' активностi сироватково''' ЛФ i 'ü' кктково''' iзоформи, гiпокальцi€мi€ю, ппофосфатем^ю, а також зниженням вмiсту мшеральних компонентiв у кiстковiй тканинi. Спостер^алось значне зниження експреси остеокальцину, ключового маркера остеосинтезу. Змiни у D-вiтамiнному статусi тварин, викликанi ГК, призводили до зниження рiвня RANK та OPG у кктковш тканинi, тодi як рiвень RANKL залишався без змш. Уведення вiтамiну D3, пщвищуючи рiвнi 25OHD i VDR, сприяло частковш або повнiй нор-малiзацi''' викликаних преднiзолоном змiн мiнерального обмшу й кiсткового гомеостазу через пщвищення рiвнiв RANK, OPG та остеокальцину. Висновки. Предызолончндуковане дерегулювання цитокшово' системи RANKL — RANK — OPG та остеокальцин-опосередковане формування кктково''' тканини можуть бути ткно пов'язаш зi зниженням бiодоступностi вiтамiну D i порушенням клiтинного сигналювання через VDR. Вщнов-лення бiодоступностi вiтамiну D € необхщною умовою, що протидi€ негативним ефектам глюкокортико'дно'' терапп у юстковм тканинi.
Ключовi слова: предызолон; остеопороз; вiтамiн D; рецептор втамшу D; остеокiни; ремоделювання ккт-ково''' тканини
Оригiнальнi дослiдження /
Original Researches
боль.
суставы. позвоночник
Вступ
Остеопороз — багатофакторне полiетiологiчне за-хворювання скелета е найбiльш поширеною формою метаболiчноl остеопатй'. Захворювання характеризуемся втратою маси кiсток, порушенням !х мк:ро-арxiтектонiки (руйнуванням трабекул), зниженням мщносл ыстково! тканини та супроводжуеться ви-соким ризиком переломiв [1]. За даними Всесвггньо! оргашзаци охорони здоров'я, остеопороз як причина швалщизаци i смертностi посiдае четверте мюце пiсля захворювань серцево-судинно! системи, онколопчних i цукрового дiабету [2].
Глюкокортико1ди е ефективними лiкарськими засо-бами, що знаходять широке застосування в медичнш практицi для лшування гострих i хронiчних запальних процешв [3]. Однак вiдомо, що пащенти, ят тривалий час приймають пероральш стерощш протизапальнi препарати, мають шдвищений ризик розвитку остеопорозу зi значними втратами тстково! маси в першi мiсяцi лiкування [4, 5]. Стеро!дний остеопороз нале-жить до класу вторинних остеопорозiв, що виклика-еться як патологiчним пiдвищенням ендогенно! про-дукцй' глюкокортикощв наднирниками, так i може бути результатом тривалого введення синтетичних
© «Бть. Суглоби. Хребет», 2017 © «Pain. Joints. Spine», 2017
© Видавець Заславський О.Ю., 2017 © Publisher Zaslavsky O.Yu., 2017
Для кореспонденцп: Шиманський 1гор Олександрович, кандидат бiологiчних наук, старший науковий ствробггник вiддiлу 6ioxiMiT BiTaMiHiB та коензимiв, 1нститут 6ioxiMfi iM. О.В. Палладша НАН Украпни, вул. Леонтовича, 9, м. КиТв, 01001, УкраТна; e-mail: [email protected]; контакт-ний тел.: +38 (093) 658 11 16.
For correspondence: Ihor Shymanskyy, PhD, Department of vitamins and coenzymes, O.V. Palladin Institute of Biochemistry, 9, Leontovicha st., Kyiv, 01001, Ukraine; e-mail: [email protected]; phone +38 (093) 658 11 16.
аналопв кортикостеро1Д1в, що застосовуються для л1кування численних захворювань людини. Тому ко-рекц1я порушень структурно1 орган1зацй' та функць онування юстково! тканини при глюкокортико1днш терапи е надзвичайно актуальною теоретичною та кль н1чною проблемою.
В основ1 розвитку остеопорозу лежить переважання остеокласт-залежно'1 резорбци к1стки над 1i остеобласт-опосередкованим формуванням i мшератзащею, що веде до втрати щтьносп, порушень мiкроархiтектури кiстки та, зрештою, пiдвищення ризику переломiв [6]. Ключова роль у контролюваннi процесу ремоделюван-ня ыстково1 тканини належить цитокiновим системам. Так, зокрема, остеосинтез за участю остеобластiв забез-печуеться регуляторним проте'1ном — остеокальцином, який е валщним маркером формування юстково!' тканини, а процес резорбци регулюеться остеотропною цитоюновою системою RANKL — RANK — OPG [6, 7]. Вщомо, що взаемодiя рецептора активатора NF-kB (RANK) i його лианда (RANKL) призводить до акти-ваци NF-kB, що посилюе диференцшвання й активу-вання остеокластiв, тодi як остеопротегерин (OPG), да-ючи як рецептор-пастка, зв'язуе RANKL i нейтралiзуе його бюлопчну дiю. Водночас RANKL та OPG можуть здшснювати значний вплив i на клггини iмунноl сис-теми, адже продемонстровано експресш компонентiв цитокшово! системи RANKL — RANK — OPG у макрофагах, дендритних клгганах, Т- та В^мфоцитах, залучених до регулювання iмунних реакцiй [8].
Наслiдком системно! дц глюкокортикощв може бути активащя експреси RANKL i пригшчення експреси OPG в остеобластах [9]. У низщ дослiджень було показано, що глюкокортико1ди iнгiбують експресш мРНК OPG, подальшу секрецiю самого проте1ну та одночас-но позитивно регулюють надекспресш мРНК RANKL у культурi остеобластiв незалежно вiд стади диферен-цiювання й базального рiвня експреси [10]. Осюльки глюкокортико!д-чутливi елементи були виявлеш в генi RANKL, припускають можливють регуляци експреси цього цитоюну через посилення транскрипцшно1 активностi гормону [11]. Отже, цитокшова система RANKL — RANK — OPG може розглядатись як ш-тегруюча ланка у взаемоди рiзних типiв клiтин, залучених в iмуннi реакци, розвиток запалення та шдтри-мання рiвноваги мiж клгганами ыстково1 тканини, що робить 11 фармакологiчною мiшенню для здiйснення регуляторних i корегувальних впливiв на процес ре-моделювання за рiзних патологш кютково! тканини. Наведенi вище експериментальш данi здебiльшого стосуються дослiджень на культурах клгган або змiн у юстковш тканинi, пов'язаних переважно з корот-котривалим уведенням синтетичних глюкокортико-щв у високих дозах. Проте недостатньо з'ясованим залишаеться питання систематичного дослщження порушень експреси вшх трьох компонентiв системи RANKL — RANK — OPG у ыстковш тканиш за довго-тривало! дц глюкокортикощв in vivo.
Останнiм часом значш зусилля спрямованi на експериментальне обГрунтування ефективностi вь тамiну D3 (холекальциферолу) у протиди побiчним
ефектам тривалого застосування глюкокортико'дних препарапв [12]. Одним i3 важливих чинниыв, що по-рушують структурно-функцюнальний стан ыстково!' тканини, може бути недостатнiсть/дефiцит вггамшу D. На сьогоднi вiдомо, що стан забезпеченост населення вiтамiном D у свт характеризуеться як глобальна пан-демiя D-недостатностi [13]. Проведет недавш масш-табнi дослiдження дозволили виявити кореляцш мiж дефiцитом вггамшу D та поширенiстю таких захворювань, як автоiмуннi (цукровий дiабет, хвороба Крона, полiартрит тощо), серцево-судинш, онкологiчнi та ос-теопороз [14, 15].
Вггамш D е попередником утворення справжнього секостеро'дного гормону (1,25(OH)2D) з добре вивче-ними ефектами, пов'язаними у першу чергу з регу-люванням кальцiевого гомеостазу [16]. Крiм того, на сьогоднi встановлено важливу роль вiтамiну D3 у про-лiферацií та диференцiюваннi клгган, модулюваннi Гмунно!' вiдповiдi та протизапальному захистi [17—19]. Гормональна форма вггамшу D3 (1,25(OH)2D3) вiдiграе потенцiйну роль у контролюванш утворення цито-ышв у рiзних тканинах [20]. На молекулярному рiвнi цi ефекти можуть реалГзовуватись через рецептор вь тамшу D — VDR-опосередкований вплив на транс-крипцiйне активування NF-kB та експресш залеж-них вiд даного фактора транскрипци генiв. Оскiльки асоцшоваш з тривалою дiею глюкокортикощв змши ремоделювання ыстково!' тканини можуть включати порушення тонко!' взаемоди рiзних титв клiтин, ш-тегруючою компонентою яко'1 е система цитокiнiв, актуальним залишаеться питання, яким чином недо-статнiсть або дефщит вiтамiну D i порушення процесу ремоделювання юстково'! тканини пов'язаш зi змша-ми у системi RANKL-RANK-OPG i чи корелюють щ змiни з порушеннями експреси VDR при глюкокорти-ко'д-шдукованому остеопорозi.
Метою дано'1 роботи було вивчення взаемов'язку мiж забезпеченiстю органiзму вiтамiном D, експресь ею VDR i станом остеотропно!' цитоыново!' системи RANKL-RANK-OPG у ыстковш тканиш при експе-риментальному глюкокортико'д-шдукованому остео-порозi.
Матерiали та методи
Моделювання глюкокортикод-'ндукованого остеопорозу в щур'в i схема введення в'там'/ну D3
Дослгдження проводили на бглих щурах (самищ ль нГ1 Wistar масою 100 ± 5 г), яы утримувались на стандартному харчовому повноцшному рацiонi вiварiю (вмют кальцiю — 1,2 %, фосфору — 0,8 %), при тем-пературi в межах 18—22 °С, вологостi 50—60 % та природному свпловому режимi «день — шч». Пiсля перю-ду акшматизаци, який становив один тиждень, щурiв було розподiлено на 3 групи за методом випадкових чисел: 1 — контрольш тварини; 2 — тварини, яким що-доби вводили предшзолон («Дарниця», Укра'на) у дозi 0,5 мг на одну тварину протягом 30 дiб у виглядi водно!' суспензи; 3 — тварини, яким разом iз преднiзолоном уводили вггамш D3 (Sigma, США) у доз! 100 МО на одну
тварину протягом 30 дГб у виглядГ масляно! суспенз!!. Препарати вводили дослгдним тваринам у один i той самий час перорально за допомогою зонда. Уш маш-пуляцГ! з тваринами проводили з дотриманням загаль-ноприйнятих бюетичних норм гуманного поводження з лабораторними тваринами вГдповГдно до мГжнарод-них та нацГональних положень стосовно проведення експериментГв Гз залученням тварин: «бвропейсько! конвенцГ! про захист хребетних тварин, що викорис-товуються для дослГдних та Гнших наукових цiлей» (Страсбург, 1986); «Загальних етичних принцитв проведення експериментiв на тваринах» (Укра!на, 2001), Закону Укра!ни «Про захист тварин вГд жорстокого поводження» № 3447-IV (Укра!на, 2006).
Визначення вм'кту 25OHD у сироватцi кровi
Забезпеченють органiзму вiтамiном D3 ощнювали за рГвнем 250HD, який визначали Гмуноензимним методом з використанням тест-набору 25-Hydroxy Vitamin D kit (IDS, США) за стандартним протоколом виробника. Концентрацш 250HD вимГрювали в нмоль/л сироватки кровь
Вивчення м'нерального обмну_
Рiвень кальцш в сироватщ кровГ визначали за допомогою бiотест-наборiв («Лахема», Чехiя). ВмГст неор-ганiчного фосфату (Pi) дослГджували тсля осадження проте!шв сироватки кровГ 12% розчином трихлороцто-во! кислоти за методом Dyce [21]. АктивнГсть загаль-но! лужно! та кисло! фосфатази в сироватщ кровГ ви-мiрювали за допомогою бiотест-наборiв виробництва «Лахема» (Чехiя). АктивнГсть iзоензимiв лужно! фосфатази визначали з використанням шпбггорГв згГдно з описаним методом [22].
ВмГст мшеральних компонентГв у юстковш тканиш вивчали пГсля екстракци з тканини проте!шв методом сухо! мшералГзаци при температурГ 600—800 °С. РГвень мГнеральних компонентГв у золГ визначали пГсля и роз-чинення у 0,5 мл соляно! кислоти та подальшого два-дцятикратного розведення в дистильованш водГ.
Вестерн-блот-анал'з_
Визначення вмюту цГльових проте!нГв у юстковш тканиш щурГв проводили за методом вестерн-блот-аналГзу. Для приготування загального проте!нового лГзату наважку юстково! тканини 200—250 мг розти-рали у фарфоровш ступцГ з рГдким азотом, пГсля чого 100 мг подрГбнено! тканини шкубували протягом 20 хв з буфером екстракцГ! проте!нГв RIPA (20 мМ трис-HCl, рН 7,5; 1% тритону Х-100, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЕДТА, 1% дезоксихолату натрш 20 мМ Tris-HCl, рН 7,6, 1% Triton-X100, 150 мМ NaCl, 50 мМ NaF, 0,2% ДСН) у сшввщношенш 1 : 10 (вага/об'ем) та коктейлем шпбь торГв проте!наз i фосфатаз (protease inhibitor cocktail — PIC, Sigma) на льодянш баш. Гомогенат додатково об-робляли ультразвуковим дезштегратором, пГсля чого центрифугували при 14 000 g протягом 20 хв при 4 °С. УмГст тотального проте!ну в алГквотах проб визначали за методом Лоурь До лГзату додавали 1/5 частину об'ему буфера ЛеммлГ 5х (60 мМ Tris-Cl pH 6.8, 2% додецил-
сульфат натрш, 10% глщерин, 5% Р-меркаптоетанол, 0,01% бромфеноловий синш), перемшували та прова-рювали на водянГй банГ +95 °С протягом 5 хв, а пГсля охолодження зберГгали у фризерГ при —80 °С для подаль-шо! роботи. Електрофоретичне роздГлення проте!шв у 10—15% полГакриламГдному гелГ (ПААГ) проводили в трис-глГциновому буферГ рН 8,3 (25 мМ Tris, 192 мМ глщину, 0,1% додецилсульфату натрш) (30—100 мкг проте!ну на лунку) при напрузГ 100—110 V [23]. Роздь ленГ за молекулярною масою проте!ни з ПААГ переносили на нпроцелюлозну мембрану протягом 1 год при 350 mA у трансфер-буферГ (25 мМ трис, 192 мМ глщину, рН 8,3, 0,1% додецилсульфату натрш, 20% метанолу). ВГльш центри зв'язування блокували 5% зне-жиреним сухим молоком у PBS з 0,05% твшу-20 протягом 1 год. Мембрану вГдмивали тричГ по 5 хв у PBS з 0,1% твшом-20 (PBST), пГсля чого шкубували шч при 4 °С з цГльовими антитГлами в попередньо пщ-браних оптимальних концентрацГях: RANKL (1 : 250), RANK (1 : 400), OPG (1 : 500), остеокальцину (1 : 500), VDR (1 : 200) та Р-актину (1 : 20 000). ПГсля шкубащ! з первинними антитГлами мембрану вГдмивали у PBST, пГсля чого протягом 1—1,5 год при юмнатнш температурГ шкубували зГ специфГчними вторинними антитГлами, кон'югованими з пероксидазою хрону в роз-веденш 1 : 4000 для anti-mouse, 1 : 2500 для anti-goat та anti-rabbit антитГл. НадалГ мембрану знову вГдмива-ли та виявляли Гмунореактивш сигнали за допомогою реактивГв для посилено! хемтюмшесценци (1,25 мМ розчин люмшолу, 2,72 мМ розчин кумарово! кислоти та 0,01% розчин пдрогенпероксиду в 0,1 М Tris-HCl рН 8,5). ПлГвку проявляли та фГксували стандартними фотопроявником i фГксажем. 1нтенсивнГсть сигналГв на рентгенГвських плГвках обраховували за допомогою програмного забезпечення GELPRO32. Вщносний умГст цГльових проте!нГв було нормалГзовано додатково за Р-актином i подано в умовних одиницях.
Статистична обробка результат'в_
Статистичну обробку експериментальних даних проводили з використанням програми Microsoft Excel загальноприйнятими методами варГацшно! статистики з вирахуванням середного арифметичного значен-ня показника (М) i стандартно! похибки середнього значення (SD). Визначення вГропдностГ вГдмГнностей мГж отриманими величинами двох вибГрок проводили з використанням t-критерш Стьюдента [24]. ВГрогГд-ними вважали вГдмГнностГ мГж групами при р < 0,05.
Результати
ДослГдження вмГсту 25-пдроксивггамшу D (25ОНD), основного маркера забезпеченостГ оргашзму вГтамГ-ном D та попередника його гормонально активно! фор-ми, показало зниження за довготривалого введення преднГзолону рГвня цього похщного холекальциферо-лу в сироватцГ кровГ до 39,4 ± 0,7 нмоль/л, що майже у 3 рази нижче, нГж у контрольних тварин (рис. 1).
На фош шдукованого преднГзолоном порушення метаболГзму вГтамГну D та розвитку D-гГповГтамГнозу були виявлеш вГрогГднГ змГни мшерального обмГну
в органiзмi тварин. Поданi у табл. 1 результати свщчать, що введення тваринам предшзолону супроводжуеться зниженням вмюту Са2+ за рахунок його бюлопчно активно! фракци, та Рi у сироватцi кровi на 17 i 14 % вщ-повщно порiвняно з показниками iнтактних тварин. Введення предшзолону також викликало зниження вмюту кальцш та неорганiчного фосфату в золi вели-когомiлкових исток за дц преднiзолону (табл. 1).
Пов'язанi з глюкокортико!дною терапiею гшокаль-цiемiя та гiпофосфатемiя корелювали з шдвищенням активностi маркерного ензиму процесу кюткоутворен-ня — лужно! фосфатази (ЛФ), яка в 1,51 раза переви-щувала показник контрольних тварин (табл. 1). Пд-вищення активност ЛФ вщбувалось головним чином за рахунок змши активностi Н ыстково! iзоформи, що становить 70 % вщ загально! активностi ЛФ сироват-ки кровi та зростае за ди преднiзолону на 60 %. У той самий час предшзолон не спричиняв вiрогiдних змiн активност кисло! (тартрат-резистентно!) фосфатази (маркер резорбци кiстково!' тканини) у сироватцi кровi (данi не наводимо).
Нормалiзацiя рiвня 25ОНD внаслiдок тривалого введення щурам iз глюкокортико!д-iндукованим ос-теопорозом вггамшу D3 (рис. 1) вiрогiдно впливала на рiвень мiнеральних компонентiв як у сироватш кровi, так i в кiстковiй тканинi щурiв порiвняно з показниками тварин, яы отримували глюкокортико!ди. Показано, що активнють лужно! фосфатази в сироватщ кровi нормалiзуеться при введеннi вггамшу D3 на фонi ди предшзолону (табл. 1). Щ данi можуть вказувати на iстотну роль дефщиту вiтамiну D у порушеннi мше-рального обмiну та кiсткового гомеостазу, що призво-дить до посилено! демшералiзацiГ кiстково! тканини та втрати Г! маси за ди предшзолону.
Осыльки глюкокортико!ди як системнi гормони знаходяться в тiснiй взаемоди з рiзними регуляторами процесу ремоделювання, спектр патогенетичних впливiв на стан ыстково! тканини за тривало! !х ди в терапевтичних дозах е надзвичайно широким i мо-
Рисунок 1. Вм'кт 250HDу сироватц кров'1 щур'вза дИ предшзолону та при введеннi втамну D3
Примтки: 1 — контроль; 2 — nреднiзолон; 3 — предшзолон + втамн D3; * — в'дм'тностi пор'вняно з контролем в'рог'дш (p < 0,05), * — в'дм'нност'! пор'шняноз дieю предшзолону в'рог'дш (p < 0,05).
же включати змши в ключовш остеоыновш ^creMi ысткового ремоделювання RANKL — RANK — OPG. Подаш на рис. 2 результати свщчать, що введення тваринам предшзолону, не викликаючи ютотного шдви-щення вмюту RANKL у ыстковш тканиш, призводить до 31% зниження рiвня остеопротегерину порiвняно з контрольними щурами.
Було встановлено шдуковане тривалою дieю предшзолону зниження cпiввiдношeння OPG/RANKL майже в 1,4 раза порiвняно з контролем (рис. 3). Крiм того, дослщження рiвня експресй' RANK як ключово-го компонента остеоыново! системи активаци остео-блаcтiв, що забезпечуе трансдукщю сигналу RANKL у процeci диференцшвання та активування остео-блаcтiв, показало його зниження майже в 2 рази за введення предшзолону. Таке дерегулювання остеоыново!
Таблиця 1. Вм'кт м'неральнихкомпонентiBу сироватц кров'1, зол'1 к'ктково) тканини та актившсть лужно)'фосфатази у сироватц кров'1
Дослшжуваш показники Контроль Преднiзолон Преднiзолон + D3
Сироватка кров'1
Загальний Са2+, мМ • л-1 2,23 ± 0,20 1,91 ± 0,05* 2,20 ± 0,03*
Протешзв'язаний Са2+, мМ • л-1 0,24 ± 0,03 0,22 ± 0,04 0,21 ± 0,04
Ультрафшьтрувальний Са2+, мМ • л-1 1,99 ± 0,04 1,69 ± 0,03* 1,99 ± 0,05*
Фосфат-неоргашчний, мМ • л-1 2,22 ± 0,06 1,86 ± 0,07* 2,26 ± 0,04*
Загальна лужна фосфатаза, Од • л-1 233,1 ± 6,3 352,7 ± 9,2* 250,5 ± 5,1*
Кишковий iзоензим лужно! фосфатази, Од • л-1 44,50 ± 1,68 64,70 ± 1,86* 48,30 ± 1,52*
Кiстковий iзоензим лужно! фосфатази, Од • л-1 158,2 ± 5,4 264,3 ± 7,2* 181,6 ± 5,9*
Великогом'1лкова метка
Зольнють, % 56,0 ± 2,4 47,0 ± 1,9* 52,0 ± 2,0*
Вмют Ca2+, % 30,20 ± 0,29 26,1 ± 0,7* 31,6 ± 0,6*
Вмiст Pi, % 19,20 ± 0,18 16,3 ± 0,6* 18,2 ± 0,5*
Примiтки: * — в'дм'тност'! пор'вняно з контролем вiрогiднi (р < 0,05), * — в'дм'тност'! пор'вняно з д/'ею предшзолону в'рог'дн (р < 0,05).
системи RANKL — RANK — OPG, детермшантно! для процесу остеокластогенезу, за ди преднiзолону допо-внюеться значним зниженням експреси ключового маркера остеосинтезу — остеокальцину, на 35,0 % по-рiвняно з контролем (рис. 4). Значне зниження вмюту остеокальцину, ви-амш-К-залежного неколагенового проте!ну кютково! тканини, який синтезуеться зрiлими остеобластами i е чутливим iндикатором iнтенсивностi метаболiзму кютково'! тканини, вказуе на чгтко вираже-не гальмування остеосинтезу за ди преднiзолону.
Введення тваринам вггамшу D3 сприяло незначному (11% зниженню вмiсту RANKL та бiльш вираженому тдвищенню (на 22 %) вмюту OPG у юстковш тканинi порiвняно з дiею преднiзолону (рис. 2). У свою чергу, це призводило до майже повного вщновлення сшввщ-ношення вмiсту OPG/RANKL, яке було вище у 1,4 раза, шж за ди преднiзолону (рис. 3). Рiвень проте!ну RANK зростав на 60 % за введення холекальциферолу
порiвняно з глюкокортикоlд-iндукованим остеопо-розом. Свiдченням нормалiзацil процесу формування кютково'! тканини та покращення метаболiчних про-цесiв у нiй е шдвищення експреси остеокальцину, вщ-носний вмют якого досягав рiвня контрольних значень за ди вiтамiну D3 (рис. 4).
Оскiльки бiологiчнi ефекти гормонально! форми вггамшу D3 у рiзних типах клiтин реалiзуються через специфiчнi рецептори до 1,25(OH)2D3 (VDR), було дослiджено !х рiвень у юстковш тканиш. Встановле-но, що за ди* преднiзолону вмiст проте!ну VDR значно (на 36 %) знижувався в цш тканинi, що свщчить про можливе зниження юлькосп та функцюнально! ак-тивностГ остеобласпв i остеоцитiв, що забезпечують остеосинтез, i/або чутливостГ клГтин до ди вiтамiну D-гормону (рис. 4). Холекальциферол на тлГ ди пред-шзолону на 20 % пiдвищував умют проте!ну VDR по-рГвняно з дiею лише преднiзолону.
Рисунок 2. В'дносний вм'кт протеш'в RANK, RANKL та OPG у кктковш тканин щурв за dii преднзолону та при введенн'1 втамшу D3
Примтки: RANK — рецептор-активатор ядерного фактора транскрипци кВ; RANKL — лганд рецептора-активатора ядерного фактора транскрипци кВ; OPG — остеопротегерин; 1 — контроль; 2 — преднiзолон; 3 — преднiзолон + вта-мн D3. Наведенi репрезентативнi iмуноблотограми та ix кшьккний аналiз за допомогою програмного забезпечення GELPRO32. В'дносний ум/ст RANK, RANKL та OPG було нормал'>зовано за Р-актином i подано як M ± SD; * — в'дмшностi пор'шняноз контролем в'1рог'1дн'1 (р < 0,05),* — в'дм'тностiпор'шняноз дieю преднзолонув'1рог'1дн'1 (р < 0,05).
Обговорення
Тривале лiкування стеро!дними протизапальними препаратами значно шдвищуе через reHOMHi та неге-номш механiзми ризик розвитку остеопорозу 3i значни-ми втратами ыстково! маси [4, 5, 25]. Вщомо, що истко-ва тканина е тканиною-мшенню для глюкокортикощв, осюльки специфiчнi рецептори для них локалiзованi на остеобластах, остеоцитах i остеокластах. Взаемодь ючи з рецепторами, глюкокортико1ди впливають на пролiферацiю, диференцiювання й метаболiзм клiтин. Порушення балансу мiж двома рiзнонаправленими процесами исткового ремоделювання, превалювання истково! резорбци над процесом формування ново! истково! тканини е центральною ланкою патогенезу глюкокортикощ-шдукованого остеопорозу. Дисбаланс формування та резорбцй истково! тканини за остеопорозу може вщображати порушення основних мехашз-мiв системно! гормонально! та мюцево! (цитокiново!) регуляцй активностi остеобластiв та остеокластiв [26].
У данш роботi було дослщжено за рiвнем експреси ключових маркерiв ремоделювання истково! тканини, iнтенсивнiсть i характер змiни циклу Г! формування-резорбци за глюкокортикоТд-шдукованого остеопорозу у взаемозв'язку iз забезпеченiстю оргашзму тварин вiтамiном D. Показано, що експрешя детермiнантних для остеобласт-остеокластично! взаемоди протеТшв OPG, RANK, VDR i маркера фiзiологiчного стану ыст-ково! тканини — остеокальцину зазнае предшзолон-
Рисунок 4. В 'дносний умст npomeiHiB VDR та остеокальцину у к'ктков'ш тканин щур 'в за dii преднзолону та при введенн'1 втам'шу D3
Примтки: VDR—рецептор втам'шу D3; 1 — контроль; 2 — npeÖHi3onoH; 3 — предшзолон + в'там'ш D3. Наведен репрезен-тативш 'муноблотограми та ix кльксний анал'в за допомогою програмного забезпечення GELPRO32. В/'дносний вм/'ст цльових проте'Мв було нормал'вованоза ß-актином; * — р'вниця пор'шняноз контролем в'рог'дна (р < 0,05), * — р'вниця
пор'шняно з дieю предтзолону в'рог'дна (р < 0,05).
шдуковано! негативно! регуляцй i може корегуватись введенням вггамшу D3 як критично важливого фактора, що забезпечуе формування ыстково! тканини та депонування мшеральних компонент.
RANK е ключовим компонентом остеокшово! систе-ми, локалiзованим на кштиннш поверхш преостеокластав,
Рисунок 3. Сп'шв'дношення вмсту OPG/RANKL у к'ктков'ш тканин щур'ш за дИ предшзолону та при введенн'1 втам'шу D3
Примтки: 1 — контроль; 2 — nреднiзолон; 3 — предтзо-лон + в'там'ш D3; * — в'дм'шност'! пор'шняно з контролем в'рог'дн (р < 0,05), * — в'дм'шност'! пор'шняноз дieю предшзолону в'рог'дн (р < 0,05).
що сприяе ïx диференцiюванню в остеокласти та акти-вуванню зрiлиx остеокласт, вiдповiдальниx за поси-лення процесу резорбцй' кiстковоï тканини. Тому вмют протешу RANK може корелювати як i3 кшькютю клiтин остеобластiв, так i з ïx активнiстю в кютковш тканинi. Встановлене нами зниження вмюту RANK скорше за все вГдображае гальмування iнтенсивностi остекласто-генезу за глюкокортикощ-шдукованого остеопорозу. Однак, з шшого боку, вiдомо, що резорбтивна актив-нiсть остеокластiв i характер ремоделювання кiстковоï тканини здебiльшого визначаються спiввiдношенням продукування OPG та RANKL [11]. У кютковш ткани-ш OPG синтезуеться переважно остеобластами й ос-теоцитами та дiе як ендогенний розчинний рецептор-пастка для RANKL [6, 7]. Остеопротегерин, зв'язуючи RANKL, запобГгае активацй' RANK на клггиннш по-верxнi остеокластiв, що знижуе як остеокластогенез, так i резорбтивну активнють остеокластiв. Отже, ви-явлене зниження рiвня OPG, iмовiрно, сприяе поси-ленню RANKL-опосередкованоï резорбцй' кютково'1 тканини.
У цiлому отриманi результати узгоджуються з да-ними лггератури щодо можливостi модуляторних ефектiв глюкокортикощв на стан цитокiновоï систе-ми RANKL — RANK — OPG [9-11]. Незважаючи на вщсутнють ютотних змiн експресй' RANKL i зниження рiвня RANK, недостатне утворення OPG може свщчити про пригнiчення функцюнально'1 активностi остеоблас-тiв i переважання остеокласт-опосередковано'1 резорбцй' кiстковоï тканини над остеобласт-залежним процесом остеосинтезу, що було пщтверджено даними порушень стану мшерального обмiнy Зважаючи на роль остеокальцину як пдрокшапатит-зв'язувального протешу й одше'1 з детермiнантниx сполук остеобласт-опосе-редкованого формування кiсткового матриксу, можна констатувати чiтко виражене гальмування остеосинтезу та подальшу демiнералiзацiю кютково'1 тканини за дй' преднiзолону [27]. Крiм того, додатковим свщчен-ням пригшчення функцюнально'1 активностi клiтин, вщповщальних за остеосинтез (остеобласти та остео-цити), е виявлене нами зниження вмюту в кютковш тканиш маркерного для цих клгган протешу — VDR.
У роботах шших авторiв показано, що високi кон-центрацй' глюкокортикоïдiв пригнiчують експресiю генiв колагену I типу, фiбронектину, остеокальцину в остеобластах, а також активують синтез тканинних колагеназ. Глюкокортикощи змiнюють iнтенсивнiсть синтезу й активнють факторiв росту остеобластiв, ш-гiбують диференцiацiю клiтин-попередникiв та шду-кують апоптоз остеобластiв [28], що частково може пояснювати встановлене нами зниження рiвнiв мар-керних для остеобласпв протеïнiв, остеокальцину та VDR, у кютковш тканиш. З шшого боку, за деякими даними лггератури, глюкокортикощи посилюють екс-пресiю клгганами-попередниками остеобластiв коло-нш-стимулюючого фактора I та RANKL; стимулюють резорбцш кютки, в основному, через активацiю зрглих остеокластiв i подовження ix життевого циклу [11].
Беручи до уваги наявнють вираженого дефiциту вь тамшу D за умов глюкокортико'1дно'1 терапй' та ефек-
тивнють введення холекальциферолу, виявлеш змши вмюту дослГджуваних остеокшв та ix сшввГдношення, можуть, принаймш частково, бути зумовленими по-рушеннями мехашзмГв реалГзацп' бюлопчно! дй' холекальциферолу в регулюванш кюткового ремоделювання та вказувати на пряме чи опосередковане залучення D-гормону до цих процешв.
Одна з причин негативного балансу кальцш в ор-гашзмГ за розвитку предшзолон-шдукованого остеопорозу, по-перше, може бути пов'язана зГ зниженням його бюдоступносп внаслгдок негативного впливу глюкокортикощв на обмш вггамшу D та його фГзю-лопчну функцш в регуляцй' кальщевого гомеостазу. Зниження рГвня 250HD у сироватщ кровГ за дй' пред-шзолону значною мГрою зумовлено гепатотоксичню-тю глюкокортикощв i зниженням умюту й активнос-т ГзоензимГв вггамш D-25-пдроксилази гепатоципв, про що свгдчать результати наших попередшх досль джень [29]. По-друге, вггамш D е одним з основних регуляторГв формування кютково'1 тканини в про-цеш il розвитку й ремоделювання протягом усього життевого циклу. Через прямий вплив на клггани кютково'1 тканини гормонально активна форма вь тамшу D контролюе процес пролГферування мезен-хГмальних стовбурових клгган, ix диференцшвання з утворенням колонок хондроцитГв, ростово'1 пластинки (резервна зона — зона спокою) й остеобласпв, а також може прямо або опосередковано регулювати диференщацш й активнють остеокласпв [30]. Не ви-ключено, що здатнють вггамшу D3 шдвищувати екс-пресш VDR та дослГджуваних цитоышв у кютковш тканиш зумовлена наявнютю конкурентних взаемо-дш мГж вггамшом D3 i предшзолоном за зв'язування з консенсусною послГдовнютю промоторних дшянок гешв-мшеней.
Висновки
Отримаш результати дослГдження продемонстру-вали, що змши в цитокшових системах остеокальцину та RANKL-RANK-OPG, яы вГдбуваються на фош недостатньо'1 забезпеченосп оргашзму вггамшом D3, можуть вГдповГдати за втрату кютково'1 тканини при тривалому введенш предшзолону. Вггамш D3 здатен нормалГзувати виявлеш порушення ремоделювання кютково'1 тканини через VDR-опосередкований вплив на клггани кютково'1 тканини, змщуючи остеобласт-остеокластну рГвновагу в бш посилення процешв ос-теосинтезу.
Конфлiкт штересш. Автори заявляють про вщсутнють конфлшту штерешв при шдготовщ дано'1 статп.
1нформащя про внесок кожного автора
Шиманський 1.О. Концепщя й дизайн дослГджен-ня, написання статп.
Люаковська О.О. Отримання, обробка експеримен-тальних даних та ix штерпретащя, оформлення глю-страцш.
Великий М.М. Концепщя дослГдження та аналГз отриманих результапв.
References
1. Zofkova I, Blahos J. New molecules modulating bone metabolism - new perspectives in the treatment of osteoporosis. Physiol Res. 2017 Sep 26;66(Supplementum 3):S341-S347. PMID: 28948818.
2. Wacker M, Holick ME Vitamin D - effects on skeletal and extraskeletal health and the need for supplementation. Nutrients.2013 Jan 10;5(1):111-48. doi: 10.3390/ nu5010111.
3. Cruz-Topete D, Cidlowski JA. One hormone, two actions: anti- and pro-inflammatory effects of glucocorti-coids. Neuroimmunomodulation. 2015;22(1-2):20-32. doi: 10.1159/000362724.
4. Hartmann K, Koenen M, Schauer S, et al. Molecular actions of glucocorticoids in cartilage and bone during health, disease, and steroid therapy. Physiol Rev. 2016 Apr;96(2):409-47. doi: 10.1152/physrev.00011.2015.
5. Pereira RM, Carvalho JF, Canalis E. Glucocorticoid-induced osteoporosis in rheumatic diseases. Clinics (Sao Paulo). 2010 Nov; 65(11):1197-1205. doi: 10.1590/S1807-59322010001100024.
6. Xiao W, Wang Y, Pacios S, Li S, Graves DT. Cellular and molecular aspects of bone remodeling. Front Oral Biol. 2016;18:9-16. doi: 10.1159/000351895.
7. Liu W, Zhang X. Receptor activator of nuclear factor-kB ligand (RANKL)/RANK/osteoprotegerin system in bone and other tissues (review). Mol Med Rep. 2015 May;11(5):3212-8. doi: 10.3892/mmr.2015.3152.
8. Takayanagi H. New developments in osteoimmu-nology. Nat Rev Rheumatol. 2012 Nov;8(11):684-9. doi: 10.1038/nrrheum.2012.167.
9. Canalis E. Clinical review 83: Mechanisms of gluco-corticoid action in bone: implications to glucocorticoid-induced osteoporosis. J Clin Endocrinol Metab. 1996 0ct;81(10):3441-7. doi: 10.1210/jcem.81.10.8855781.
10. Brandstrom H, Bjorkman T, Ljunggren O. Regulation of osteoprotegerin secretion from primary cultures of human bone marrow stromal cells. Biochem Biophys Res Commun. 2001 Jan 26;280(3):831-5. doi: 10.1006/ bbrc.2000.4223.
11. Shi C, Qi J, Huang P, et al. MicroRNA-17/20a inhibits glucocorticoid-induced osteoclast differentiation and function through targeting RANKL expression in os-teoblast cells. Bone. 2014 Nov;68:67-75. doi: 10.1016/j. bone.2014.08.004.
12. Kinoshita Y, Masuoka K, Miyakoshi S, Tanigu-chi S, Takeuchi Y. Vitamin D insufficiency underlies unexpected hypocalcemia following high dose glucocorti-coid therapy. Bone. 2008 Jan;42(1):226-8. doi: 10.1016/j. bone.2007.09.042.
13. Pludowski P, Grant WB, Bhattoa HP, et al. Vitamin D status in central Europe. Int J Endocrinol. 2014;2014:589587. doi: 10.1155/2014/589587.
14. Guessous I. Role of Vitamin D deficiency in ex-traskeletal complications: predictor of health outcome or marker ofhealth status? Biomed Res Int. 2015;2015:563403. doi: 10.1155/2015/563403.
15. Komissarenko Yul, Bobryk MI. Autoimmune Disorders in Endocrine Pathology. A New Look on the
Diagnosis and Management. According to the Materials of 18th European Congress of Endocrinology (Munich, May 2016). Mezhdunarodnyi Endokrino-logicheskii Zhurnal. 2016;76(4):41-4. doi: 10.22141/22240721.4.76.2016.77797. (in Russian).
16. Montecino MA, Lian JB, Stein JL, Stein JS, van Wijnen AJ, Cruzat F. Biological and molecular effect of vitamin D on bone. In: Holick MF. Vitamin D. Physiology, molecular biology, and clinical applications. Totowa, USA: Humana Press; 2010. 1160 p.
17. Tanner SB, Harwell SA. More than healthy bones: a review of vitamin D in muscle health. Ther Adv Musculoskelet Dis. 2015 Aug;7(4):152-9. doi: 10.1177/1759720X15588521.
18. Caprio M, Infante M, Calanchini M, Mammi C, Fabbri A. Vitamin D: not just the bone. Evidence for beneficial pleiotropic extraskeletal effects. Eat Weight Disord. 2017 Mar;22(1):27-41. doi: 10.1007/s40519-016-0312-6.
19. Kvashnina LV. Immunomodulatory properties of vitamin D in children. Zdorov'ye Rebenka. 2013;7(50):134-8. (in Russian).
20. Li H, Xie H, Fu M, et al. 25-hydroxyvitamin D3 ameliorates periodontitis by modulating the expression of inflammation-associated factors in diabetic mice. Steroids. 2013 Feb;78(2):115-20. doi: 10.1016/j.ste-roids.2012.10.015.
21. Dyce BJ, Bessman SP. A rapid nonenzimatic assay for 2,3-DPG in multiple specimens of blood. Arch Environ Health. 1973 Aug;27(2):112-5. PMID: 4721197.
22. Vroon DH, Israili Z, authors; Walker HK, Hall WD, Hurst JW, editors. Clinical methods: the history, physical, and laboratory examinations. 3rd edition. Boston: Butterworths; 1990. 1087 p.
23. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970 Aug 15;227(5259):680-5. PMID: 5432063.
24. Lapach SN, Chubenko AV, Babich PN. Statis-ticheskie metody v mediko-biologicheskikh issledovaniiakh s ispol'zovaniem Excel [Statistical methods in biomedical studies using Excel]. Kiev: Morion; 2000. 320 p. (in Russian).
25. Povorozniuk VV, Dedukh NV, Grigor'eva NV, Gopkalova IV. Eksperimental'nyi osteoporoz [Experimental osteoporosis]. Kiev: Ekspress; 2012. 228 p. (in Russian).
26. Matsubara R, Kukita T, Ichigi Y, et al. Characterization and identification of subpopulations of mono-nuclear preosteoclasts induced by TNF-a in combination with TGF-P in rats. PLoS One. 2012; 7(10): e47930. doi: 10.1371/journal.pone.0047930.
27. Song L. Calcium and Bone Metabolism Indices. Adv Clin Chem. 2017;82:1-46. doi: 10.1016/ bs.acc.2017.06.005.
28. Weinstein RS, Jilka RL, Parfitt AM, Manolagas SC. Inhibition of osteoblastogenesis and promotion of apoptosis of osteoblasts and osteocytes by glucocorticoids. Potential mechanism of their deleterious effects on bone. J Clin Invest. 1998 Jul 15;102(2):274-82. doi: 10.1172/ JCI2799.
29. Lisakovska O, Shymanskyy I, Mazanova A, Kho-menko A, Veliky M. Vitamin D3 protects against predniso-lone-induced liver injury associated with the impairment of the hepatic NF-KB/iNOS/NO pathway. Biochem Cell Biol. 2017 Apr;95(2):213-22. doi: 10.1139/bcb-2016-0070.
30. St-Arnaud R, Naja RP. Vitamin D metabolism, cartilage and bone fracture repair. Mol Cell Endocrinol. 2011 Dec 5;347(1-2):48-54. doi: 10.1016/j.mce.2011.05.018.
OTPMMQHO 20.08.2017 ■
Шиманский И.О., Лисаковская О.А., Великий Н.Н.
Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, г. Киев, Украина
Молекулярно-клеточные механизмы защитного действия витамина D3 при экспериментальном преднизолон-индуцированном остеопорозе
Резюме. Актуальность. Длительное введение глюко-кортикоидов (ГК) сопровождается нарушением минерального обмена и, как следствие, приводит к развитию вторичного остеопороза. Важную роль в регулировании процесса ремоделирования костной ткани играет витамин D, который может реализовывать свои биологические эффекты через рецептор витамина D (VDR) — опосредованное влияние на цитокиновые системы, в частности RANKL — RANK — OPG (лиганд рецептора активатора ядерного фактора транскрипции NF-kB — рецептор RANKL — остеопротегерин). Цель. Изучение ГК-инду-цированных изменений экспрессии детерминантных для процессов формирования и резорбции костной ткани ре-гуляторных протеинов (RANK, RANKL, OPG, остеокаль-цин, VDR) в зависимости от биодоступности витамина D. Материалы и методы. Самки крыс линии Wistar получали преднизолон (5 мг/кг массы тела) совместно с витамином D3 (100 МЕ) или без него в течение 30 дней. Уровни VDR, остеокальцина, RANK, RANKL и OPG в костной ткани определяли методом вестерн-блот-анализа. Уровень 25-гидроксивитамина D (25OHD) в сыворотке крови анализировали с помощью метода ELISA. Содержание минеральных компонентов (Ca2+ и Pi), активность щелочной фосфатазы (ЛФ) и ее изоформ определяли спектро-фотометрически. Результаты. Преднизолон значительно снижал уровень 25OHD в сыворотке крови и содер-
жание протеина VDR в костной ткани. Это сопровождалось повышением общей активности сывороточной ЛФ и ее костной изоформы, гипокальциемией, гипофосфате-мией, а также снижением содержания минеральных компонентов в костной ткани. Наблюдалось значительное снижение экспрессии остеокальцина, ключевого маркера остеосинтеза. Изменения в D-витаминном статусе животных, вызванные ГК, приводили к снижению уровня RANK и OPG в костной ткани, тогда как уровень RANKL оставался без изменений. Введение витамина D3, повышая уровни 25OHD и VDR, способствовало частичной или полной нормализации вызванных преднизолоном изменений минерального обмена и гомеостаза костной ткани за счет повышения уровней RANK, OPG и остеокальцина. Выводы. Преднизолон-индуцированная дере-гуляция цитокиновой системы RANKL — RANK — OPG и остеокальцин-опосредованного формирования костной ткани может быть тесно связана со снижением биодоступности витамина D и нарушением клеточного сиг-налинга через VDR. Нормализация биодоступности витамина D является необходимым условием, обеспечивающим противодействие негативным эффектам глюкокор-тикоидной терапии в костной ткани. Ключевые слова: преднизолон; остеопороз; витамин D3; рецептор витамина D; остеокины; ремоделирование костной ткани
I.O. Shymanskyi, O.O. Lisakovska, M.M. Veliky
Palladin Institute of Biochemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, Ukraine
Molecular and cellular mechanisms of vitamin D3 protection in experimental
prednisolone-induced osteoporosis
Abstract. Background. Osteoporosis is the most common side effect of glucocorticoid (GC) therapy. Vitamin D is known to play a crucial role in bone remodeling, but the precise molecular mechanisms of its action on GC-induced impairments of cytokine systems, in particular RANK (receptor activator of nuclear factor kappa-B)/RANKL (RANK li-gand)/OPG (osteoprotegerin), are still controversial. Thus, the purpose of the study was to evaluate GC-induced changes in the RANK/RANKL/OPG system and osteocalcin synthesis in rat bone depending on vitamin D bioavailability and vitamin D receptor (VDR) expression. Materials and methods. Female Wistar rats received prednisolone (5 mg/kg b.w.) with or without 100 IU of vitamin D3 (for 30 days). The levels of VDR, osteocalcin, RANK, RANKL and OPG in bone tissue were determined by western blotting. Blood serum 25OHD was assayed by enzyme-linked immunosorbent assay. The levels of Ca2+, Pi, activity of alkaline phosphatase (AP) and its bone isoenzyme were determined using spectrophotometry. Results. Prednisolone significantly lowered 25OHD content
in the blood serum and VDR level in bone tissue that has been accompanied by an elevation of the AP bone isoenzyme activity in the blood serum, hypocalcemia and hypophospha-temia. A significant decrease in the expression of osteocal-cin, a well-known marker of bone formation, was also observed. GC-induced disturbances in vitamin D status led to a reduction of the RANK and OPG level, while RANKL level was unaffected. Vitamin D3 administration restored 25OHD and VDR levels that resulted in amelioration of GC-induced changes in bone tissue and normalization of mineral metabolism through elevation of RANK, OPG and osteocalcin levels. Conclusions. Prednisolone-induced imbalance in the RANK/RANKL/OPG and osteocalcin systems is related to the reduction of vitamin D bioavailability and impairments in VDR signaling. Thus, normalization of vitamin D bioavail-ability might be perspective in reducing the negative effects of GC on bone homeostasis.
Keywords: prednisolone; osteoporosis; vitamin D; vitamin D receptor; osteokines; bone tissue remodeling
